基于BP神經網絡的牡蠣抗氧化活性肽制備工藝優化

劉盟夢,李銀平,延海瑩,張高麗,王 鵬

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266100)

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基于BP神經網絡的牡蠣抗氧化活性肽制備工藝優化

劉盟夢,李銀平,延?，?張高麗,王 鵬

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266100)

以牡蠣為原料,通過響應面和BP神經網絡模型對牡蠣蛋白酶解過程、工藝條件進行優化研究,實現酶解過程中可控制備牡蠣抗氧化活性肽。結果表明:采用胰酶水解牡蠣,經響應面優化得到最佳酶解條件為:加酶量0.28%,溫度55 ℃,時間3.4 h,此條件下酶解產物·OH清除率可達到78.4%。在此基礎上,以酶解過程中的響應因子-游離谷氨酸含量來監控牡蠣蛋白水解過程,運用BP神經網絡數學模型擬合蛋白水解過程與產物活性之間的關系。構建出以加酶量、料水比和酶解體系游離谷氨酸濃度為神經網絡輸入,酶解產物·OH清除率為輸出的BP神經網絡模型,以實現在預期時間內通過實時監測游離谷氨酸含量即可得出產物活性變化情況,并定點終止反應的目的。模型預測值與實驗值相關性系數r為0.9943,平均相對誤差值為2.1%。該模型擬合性能良好,與牡蠣蛋白酶解過程具有高度相關性,可應用于牡蠣抗氧化活性肽的在線監控與可控制備。

牡蠣,抗氧化活性肽,BP神經網絡

牡蠣蛋白水解物生物利用價值高,其水解產生的抗氧化活性肽能夠有效清除體內過剩的活性氧自由基,進而能夠保護細胞和線粒體的正常結構和功能[1-3]。因此,在預防治療自由基誘發的疾病和抗衰老方面有著廣闊的應用前景[4-5]。

在酶解制備抗氧化活性肽的過程中,底物的水解過程十分復雜。底物水解的預處理條件、反應體系的pH及溫度等因素都會影響酶促反應,進而使得酶解產物與預期有偏差,從而導致水解反應的控制十分困難[6]。在酶解過程中,通常使用蛋白水解度作為酶解產物水解程度的指標,然而該方法不能及時反映水解情況,無法達到在線控制水解的效果。牡蠣蛋白在水解過程中,肽鏈被逐漸切斷,游離谷氨酸的產生量顯著增加,利用生物傳感器可快速、準確、穩定的測定游離谷氨酸含量。因此通過測定游離谷氨酸的含量變化可以“在線”直接或間接反映出蛋白的水解情況。

牡蠣蛋白的酶解與其產物活性之間存在非常復雜的非線性關系,但是簡單的酶解動力學模型無法模擬酶解過程以及實現可視化的酶解控制。人工神經網絡模型是模擬人腦生物過程的人工智能技術之一。在研究非線性問題、探索和研究復雜系統關系時,其以高度的并行性、良好的容錯性,在處理非線性系統的工藝優化、過程模擬應用非常廣泛[7-9]。

本實驗以牡蠣為原料,采用生物酶法制備具有·OH清除活性的抗氧化活性肽,應用生物傳感器檢測響應因子(游離谷氨酸含量)變化,并結合人工神經網絡技術擬合牡蠣蛋白酶解與產物·OH清除活性之間的非線性關系,進而實現酶法水解過程的可視化及抗氧化活性肽的可控制備。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牡蠣 2014年12月購于山東威海市乳山;胰酶(80000 U/g)、中性蛋白酶(230000 U/g)、堿性蛋白酶(200000 U/g)、動物蛋白水解酶(120000 U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司。

SBC-40C型生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所;HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;722N型可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;FD-1D-50型冷凍干燥機 北京博醫實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解工藝流程 將牡蠣去殼洗凈、勻漿,按料水比1∶2加入雙蒸水,調節體系至酶的最適pH(其中胰酶和動物蛋白酶的最適pH為8.5,中性蛋白酶的最適pH為6.5,堿性蛋白酶的最適pH為10),再將所有體系預熱至酶的最適溫度(胰酶的最適溫度為50 ℃,動物蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的最適溫度為55 ℃),并按0.1%～0.3%加入不同種類的蛋白酶,以不加酶的實驗組做為空白對照,在0、0.5、1.0、2.0、3.0 h分別取適量酶解液于沸水浴10 min終止反應,4000 r/min離心10 min取上清液,測定酶解產物的水解度和·OH清除率[10]。

1.2.2 水解度測定 參照檀志芬等[11]蛋白水解度測定方法(三氯乙酸溶解指數法),使用10%三氯乙酸沉淀牡蠣大分子蛋白。三氯乙酸溶解指數可以反應蛋白質的水解情況,溶解指數越高,表明較短肽段含量越高,水解度越高。

水解度(%)=mi/m0×100

其中,mi為10%三氯乙酸沉淀酶解液后的蛋白質量,m0為酶解液中的總蛋白質量。

I(%)=[A0-(Ai-Ai0)]/A0×100

其中,A0為雙蒸水代替酶解液的反應體系測得的吸收值,Ai為酶解液在反應體系的吸收值。

1.2.4 響應面實驗設計 利用Design Export軟件,根據Box-Behnken實驗設計原理以及預實驗結果,以加酶量、溫度、時間為自變量,活性肽·OH清除率為響應值設計的3因素3水平響應面[13],考察酶解牡蠣蛋白的最佳工藝條件,此時的料水比為1∶2。表1為實驗因素水平編碼。

表1 響應面因素設計水平

1.2.5 神經網絡設計 實際生產過程中,反應體系的微小變化都會對酶解效果產生一定的影響,從而導致在預期時間內得到的產物活性達不到理想值。在優化酶解時間等工藝條件的基礎上,對整個酶解過程進行可視化研究,通過生物傳感器在線快速測定酶解反應中游離谷氨酸含量結合加酶量、料水比作為神經網絡的輸入建立模型,預測酶解產物·OH清除活性的變化,并驗證模型預測性能。通過參考相關文獻并比較神經網絡訓練效果與訓練時間,構建含3個輸入單元的輸入層,3個神經元的隱含層和1個輸出單元的輸出層的BP神經網絡[14]。以反應體系游離谷氨酸含量、初始酶濃度和初始底物濃度作為神經網絡輸入單元,以活性肽的·OH清除率作為神經網絡的輸出單元[13]。利用均勻設計和正交設計的思想,在0.1%≤加酶量≤0.4%,1∶4≤料水比≤1∶3范圍內設計神經網絡實驗,網絡結構如圖1所示:

圖1 BP神經網絡結構示意圖Fig.1 The structure of BP neural network

由于神經網絡模型輸入輸出矢量單位的不統一,為了加快訓練網絡的收斂性,減小網絡收斂誤差,更利于數據處理,數據在輸入前先作歸一化預處理。歸一化處理可以采用如下公式:Xi=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)[13]

X為訓練樣本的輸入和輸出數據,Xi為歸一化后的數據,Xmax與Xmin是輸入數據和輸出數據的最大值、最小值。歸一化處理后,48組輸入輸出矢量如下所示:

輸入數據=-1 0000-1 0000-1 0000-1 0000-0 3333-0 3333-0 3333-0 33330 00000 00000 00000 00000 00000 00000 00000 0000-1 0000-0 22220 14810 2593-1 0000-0 8148-0 2963-0 0741-0 33330 3333-0 33330 33330 33330 33330 33330 33330 00000 00000 00000 00000 00000 00000 00000 00000 03700 18520 4444-1 0000-0 77780 25930 29630 59261 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00000 00000 00000 00000 00000 00000 00000 00001 0000-1 0000-0 3704-0 14810 11110 40740 66670 6296-0 25931 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00000 03700 22220 6296-0 25930 03700 22220 62960 70371 00001 00000 33330 33330 33330 33330 33330 33331 00001 00000 00000 00000 00000 00000 00000 00001 00000 9630-1 0000-0 5926-0 03700 11110 25930 48150 3333-0 0667-0 0667-0 0667-0 0667-0 0667-0 3333-0 33330 0000-0 6000-0 6000-0 6000-0 6000-0 6000-1 0000-1 00000 5556-0 9259-0 7037-0 3704-0 2593-0 1852-0 9259-0 8519-0 3333-0 3333-0 3333-0 33331 00001 00001 00001 0000-0 2593-0 0741-0 0741-0 0741

1.3 數據統計分析

所得數據均通過三次平行實驗得到,用Microsoft Excel 2007計算平行實驗之間的標準偏差,使用Design Expert 8.0軟件進行響應面實驗分析,利用Matlab(R2012a)建立BP神經網絡模型,通過調試訓練函數,隱含層神經元個數等優化網絡結構,并進行數據處理分析和作圖。

2 結果與討論

2.1 不同酶制劑對牡蠣蛋白水解效果的比較

蛋白酶對底物有一定的作用特異性,主要表現在作用的肽鍵不同[15]。不同蛋白酶作用下牡蠣的水解度及活性變化曲線如圖2、圖3所示。

圖2 不同蛋白酶處理過程酶解產物水解度的變化曲線Fig.2 Effects of different enzymes on the hydrolysis degree of oyster

圖3 不同蛋白酶處理過程中酶解產物·OH清除活性的變化曲線Fig.3 Effects of different enzymes on the ·OH clearance rate of enzymatic hydrolysate

由圖2和圖3可知,隨著酶解時間的增加,酶解產物·OH清除活性和蛋白水解度均出現不同程度的上升且均顯著高于空白對照(p<0.01)。四種酶的水解產物活性曲線均呈現先上升后期變化相對平緩的趨勢,其中胰酶水解得到的產物·OH清除活性顯著高于(p<0.05)其它蛋白酶。此外,酶解過程中,胰酶對牡蠣蛋白的水解度始終高于其它蛋白酶組。因此,選擇胰酶作為制備牡蠣抗氧化活性肽的最適酶制劑。

2.2 響應面優化實驗結果

2.2.1 響應面分析方案、實驗結果及方差分析 對表2中的實驗結果進行回歸分析,得到活性肽·OH清除率(I)對加酶量(A)、溫度(B)和時間(C)的三元二次回歸方程:

I=78.17-1.00A-1.47B+5.38C+2.02AB+3.74AC+1.80BC-4.53A2-6.33B2-4.02C2

對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗,回歸項p=0.0007,說明所選擇模型顯著,表明該二次回歸模型能夠顯著擬合加酶量、溫度和時間對活性肽·OH清除率的影響,該模型能夠代替實驗真實點對實驗結果進行分析。方差分析結果表明:交互項AC對活性肽·OH清除率具有顯著影響,一次項C、二次項A2、B2、C2具有極顯著影響。因素的F值可以反映出各因素對實驗指標的重要性,F值越大,表明對實驗指標的影響越大,即重要性越大。通過比較三個因素的F值可知:各因素對活性肽·OH清除率的影響程度大小順序為:時間(C)>溫度(B)>加酶量(A)。

2.2.2 響應面分析 利用Design-Expert軟件對表2的實驗數據進行三元二次回歸擬合分析,所得響應面如圖4～圖6所示,各因素及其交互作用對活性肽·OH清除率的影響結果可直觀地反映出來。

響應面圖顯示了其中一個因素位于中心水平時,其余兩個因素的交互作用對活性肽·OH清除率的影響。坐標面上等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強弱,圓形表示兩因素間交互作用較弱,橢圓形則表示交互作用較強[16-17]。由圖5可知,相對于其他因素的交互作用來說,時間和加酶量的交互作用對活性肽的·OH清除率具有較明顯影響。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果

圖4 加酶量和溫度對活性肽·OH清除率的響應曲面圖Fig.4 Response surface of the enzyme concentration and temperature on the yield of hydrolysate ·OH clearance rate

圖5 酶解時間和加酶量對活性肽·OH清除率的影響相應曲面Fig.5 Response surface of the hydrolysis time and enzyme concentration on the yield of hydrolysate ·OH clearance rate

圖6 酶解時間和溫度對活性肽·OH清除率的影響相應曲面Fig.6 Response surface of the hydrolysis time and temperature on the yield of hydrolysate ·OH clearance rate

通過響應面實驗得到酶解牡蠣蛋白制備·OH清除抗氧化活性肽的最佳工藝條件為:溫度55.4 ℃,時間3.4 h,加酶量0.28%。此條件下·OH清除率的預測值為80.1%。為驗證所得最優參數的可靠性,結合實際的可操作性,在55 ℃、加酶量0.28%條件下酶解3.4 h,產物·OH清除率為78.4%,與預測值的誤差為2.1%,說明采用響應面優化得到的酶解條件可靠。

2.3 神經網絡建模結果

通過響應面實驗優化酶解牡蠣蛋白條件,獲得了具有較高·OH清除活性的目標產物。為了克服酶解反應過程中攪拌速度、pH變化等因素所導致的酶解時間與預期產物活性的不一致性,采用胰酶進行水解,以游離谷氨酸實時的產生量作為水解程度指標,并作為BP神經網絡的輸入建立模型,擬合出酶解體系中游離谷氨酸的產生量與產物·OH清除活性之間的關系,實現在反應過程中在線監測產物的活性變化以及在預期的時間范圍內定點終止酶解反應。

本研究通過采用Matlab(R2012a)軟件,對酶解過程建立一個三層結構的BP神經網絡,以加酶量、料水比和酶解體系游離谷氨酸濃度為神經網絡輸入單元,以活性肽·OH清除率為輸出單元,選擇正切S型傳遞函數“tansig”函數為隱含層傳遞函數,網絡訓練函數采用“trainlm”。

2.4 神經網絡模型擬合酶解過程結果

通過對實驗數據進行訓練,建立輸入數據和輸出數據之間復雜的非線性關系。軟件Matlab(R2012a)訓練結果如下:

表3 網絡的預測值與實驗值的比較

由圖7可知,該BP神經網絡模型經過23步訓練后網絡性能即達到所設定的均方誤差目標要求,并趨于穩定。圖8顯示了模型的網絡輸出值與目標值之間的回歸分析,模型決定系數R2值達到了0.9883,擬合曲線與目標曲線基本重合,輸出結果和目標結果得到較好的線性回歸效果,模型建立成功,可用于后續預測。圖9是實驗值與BP神經網絡預測值的相關性比較分析圖。將原始數據在該訓練后的網絡下進行仿真,獨立樣本檢驗結果顯示兩組數據無顯著性差異。兩組數據的相關性系數r為0.9943,擬合平均相對誤差值為2.1%,表明BP神經網絡預測值與實驗數值之間具有一致性。對于整個復雜的水解過程,通過該BP神經網絡模型仿真得到的預測值實現了對原始樣本值的較好的擬合。

圖7 神經網絡數據訓練圖Fig.7 ANN data training plot

圖8 神經網絡回歸模型相關性Fig.8 ANN regression model correlation

圖9 實驗值和預測值相關性圖Fig.9 The correlation of actual values and the predicted values

2.5 神經網絡的預測性能

隨機在0.1%≤加酶量≤0.4%,1∶4≤料水比≤1∶3范圍內進行5組獨立實驗,測定反應過程中游離谷氨酸含量并使用訓練好的神經網絡計算酶解產物·OH清除率,將其與實際·OH清除率進行比較,結果如下:

由表3可知,利用模型進行5次隨機驗證實驗,實驗值與預測值的相對誤差在0.2%～4.2%范圍內,表明所建立的BP神經網絡模型預測性能良好,具有較高的精確度。

通過響應面實驗優化的酶解條件如下:加酶量0.28%、溫度55 ℃、酶解時間3.4 h,酶解產物·OH清除率為78.4%,此條件下體系中游離谷氨酸含量為75 mg/dL。在酶解2.9～3.9 h時間范圍內通過生物傳感器實時測定反應體系中游離谷氨酸含量來監測該水解反應過程中·OH清除活性的變化情況,當游離谷氨酸含量達到75 mg/dL時終止酶解反應,通過神經網絡模型預測酶解產物·OH清除活性大小為76.7%,與實際值相差2.2%,表明該神經網絡模型能在線準確的擬合出酶解過程中游離谷氨酸產生量與產物·OH清除率之間的關系,并能達到可控制備牡蠣抗氧化活性肽的目的。

3 結論

以牡蠣為原料,通過單因素實驗得出水解牡蠣最佳用酶為胰酶,采用Box-Behnken響應面實驗設計對酶解工藝進行優化,得到最佳酶解工藝條件為:加酶量0.28%,溫度55 ℃,時間3.4 h。在此條件下酶解產物·OH清除率可達到78.4%。通過生物傳感器在線測定反應體系中游離谷氨酸的含量,結合BP神經網絡模型模擬出了牡蠣酶解程度與·OH清除活性之間的復雜關系。模型模擬效果良好,相關性系數r為0.9943,可以高度擬合各種酶解條件下游離谷氨酸含量和酶解產物活性變化情況之間的關系,實現了酶解過程的可視化和可控制備牡蠣抗氧化活性肽。

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Optimization of enzymatic processing for antioxidant peptides from oyster based on a BP neural network

LIU Meng-meng,LI Yin-ping,YAN Hai-ying,ZHANG Gao-li,WANG peng*

(College of Food Science and Engineering,Ocean university of China,Qingdao 266100,China)

In order to achieve the controllable preparation of antioxidant peptides from oyster,enzymatic hydrolysis conditions were optimized on the basis of the response surface methodology(RSM)and neural network models. In this study,pancreatin was used for the oyster hydrolysis. The results of RSM showed that the optimal hydrolysis condition was 0.28% pancreatin dosage,temperature of 55 ℃,and hydrolysis duration of 3.4 h,under this condition the ·OH clearance rate of its enzymatic prodcut reached 78.4%. The free glutamic acid concentration was used as the monitor of enzymatic hydrolysis process. The back propagation(BP)neural network model was applied to fit for the relationship between enzymatic hydrolysis process and activity of the hydrolysate. The correlation coefficient between predict value and confirmatory experiment were 0.9943,and the average relative error was 2.1%,which indicated that this BP neural network model showed good performance. It was an effective way to monitor the enzymatic hydrolysis on-line,and made it possible to realize controllable preparation of antioxidant peptides.

oyster;antioxidant peptides;BP neural network

2016-03-30

劉盟夢(1991-),男,碩士,研究方向:水產品加工與利用,liumengm_5262@qq.com。

*通訊作者:王鵬(1980-),男,副教授,研究方向:海洋應用微生物,pengwang@ouc.edu.cn。

山東省自然科學基金(ZR2015DQ005);山東省科技發展計劃項目(2015GSF115038)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000