基于CRISPR/Cas9系統的金針菇基因組編輯載體構建

羅 潤,林俊芳,郭麗瓊,葉志偉,郭天芬,云 帆

(1.華南農業大學食品學院,華南農業大學食品生物技術研究所,廣東廣州 510640;2.廣東省微生態制劑工程技術研究中心,廣東廣州 510640;3.廣州市澳鍵豐澤生物科技有限公司,廣東廣州 510640)

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基于CRISPR/Cas9系統的金針菇基因組編輯載體構建

羅 潤,林俊芳,郭麗瓊,葉志偉,郭天芬,云 帆

(1.華南農業大學食品學院,華南農業大學食品生物技術研究所,廣東廣州 510640;2.廣東省微生態制劑工程技術研究中心,廣東廣州 510640;3.廣州市澳鍵豐澤生物科技有限公司,廣東廣州 510640)

采用高效基因編輯系統CRISPR/Cas9,構建金針菇基因Mads-8敲除載體及轉化體系。以轉錄組數據為依據,通過分析基因Mads-8序列信息,選擇高效的靶位點序列,同時加入篩選標記基因hph構建過渡載體sgRNA-T,通過菌落PCR鑒定和測序來驗證靶位點序列是否正確插入。以表達載體pgFvs-cas9為框架,酶切連接后構建重組敲除載體pgFvs-Cas9-gRNA,PCR和酶切鑒定敲除載體。再以PEG介導的金針菇原生質體轉化表達載體,在潮霉素抗性平板上篩選擬轉化子,以擬轉化子基因組DNA為模板擴增Cas9基因。結果顯示,靶位點序列成功插入敲除載體且序列正確,重組質粒成功轉化進金針菇的基因組。對金針菇基因組敲除載體的構建,為后續金針菇相關基因的功能驗證及育種研究提供載體材料及理論依據。

金針菇,CRISPR/Cas9,轉錄組,MADS-box,PEG轉化

金針菇富含豐富的氨基酸、蛋白質和維生素等營養物質,是深受消費者歡迎的食用菌,具有廣闊的消費市場和開發前景。隨著金針菇工廠化栽培技術的成熟,菌種成為決定工廠化栽培產量最關鍵的因素,因此,探究金針菇子實體生長發育的機理,對于定向培育高產的金針菇菌株具有重要的科學意義和應用價值。近年來,食用菌生長發育機理的研究發展迅速,除了溫度、光照、CO2濃度等環境因素對食用菌子實體發育的研究,伴隨著分子生物技術的飛速發展,目前已有許多的研究分別從發育相關基因、轉錄組學等領域對食用菌的子實體的發育機理進行探究[1]。如劉芳[2]等研究金針菇子實體分化發育過程中指出,金針菇原基階段有3310個基因相比菌絲階段差異表達,其中只在原基中表達的有26個;劉朋虎[3]等對草菇的轉錄組數據研究表明,在菌絲形成原基的過程中葡萄糖、己糖和乙醇等代謝途徑大部分基因下調表達,并成功找到在原基階段特異表達的321個基因。但目前相關各個差異表達基因的研究僅停留在轉錄組數據的縱向及橫向比較分析,各個具體基因對子實體分化發育的調控機理還有待深入研究。

MADS-box基因家族是真核生物中一類重要的轉錄調控因子,在真核生物的生長發育調控和信號傳導中發揮著重要作用,廣泛存在于動植物和真菌中[4]。韓國研究者Young-Jin Park[5]對通過分析金針菇全基因組信息,發現金針菇基因組中存在7段MADS-box基因序列。為了探究金針菇子實體發育相關基因的具體調控功能,進一步了解金針菇子實體發育機制的調控,把公布的序列信息在本實驗室構建的金針菇菌絲和原基轉錄組差異數據庫中進行比對,以篩選比對得到的差異基因為研究對象,借助最新的基因組高效定點編輯技術CRISPR/Cas9系統對金針菇基因組進行定點編輯。CRISPR/Cas9系統是繼鋅指核酸酶(ZFNs)[6]和類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALENs)[7]之后新一代的基因組編輯技術,其基本作用原理是通過向導sgRNA引導的核酸內切酶Cas9切割目標基因,形成DSB缺口,再利用細胞自身的同源重組修復(HDR)和非同源末端連接(NHEJ)兩種方式修復方式,從而實現基因定點編輯的技術。因其載體設計操作簡單、編輯高效且通用性廣等優勢,已成為基因組定向改造和基因功能驗證的突破性革命,目前成功應用于斑馬魚[8-9]、酵母[10-11]、曲霉[12]以及包括iPS細胞在內的人體外培養細胞系[13]等多個物種基因的定點修飾。本研究通過對金針菇基因Mads-8序列分析,構建完整的金針菇基因組敲除和轉化體系,初步探索了高效基因組定點編輯技術CRISPR/Cas9系統在金針菇等大型食用菌中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

再生培養基(RM)麥芽糖5 g,酵母提取粉5 g,葡萄糖10 g,氯化鉀44.78 g,加蒸餾水定容至1000 mL;固體培養基(PDA)200 g去皮新鮮土豆,20 g葡萄糖,3 g磷酸二氫鉀,1.5 g硫酸鎂,20 g瓊脂,加蒸餾水定容至1000 mL;CRISPR/Cas9表達載體p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t 購自Addgene公司;大腸桿菌DH5α菌株 由本實驗室保存;載體pgFvs-cas9、P18T-H1、pgFvs-hph 由本實驗室構建;普通瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、PCR產物回收試劑盒、質粒小提試劑盒 均購自TIANGEN公司;DNA聚合酶、KpnI內切酶、pMD18-T克隆載體、Pfu DNA Polymerase、T4 DNA Ligase 均購自TAKARA公司;DNA分子量MarkIII 購自東盛公司;引物合成于上海捷瑞公司;測序均在華大基因完成。

PCR儀 德國Biometra公司;離心機 德國Eppendorf公司;電泳儀 北京市六一儀器公司;凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司;金屬振蕩培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司;超凈工作臺 江蘇蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 sgRNA靶位點的選擇 使用CRISPR在線設計工具(http://crispr.dbcls.jp/),以可能與金針菇子實體分化有關Mads-8基因為靶基因,選擇靠近5′端得分最高的G-N19-NGG 23 bp序列,其中第一個G是小RNA轉錄的起始信號位點,NGG是Cas9基因定位的PAM序列,需要插入gRNA載體的是G-N19共20 bp序列。靶序列的選擇原則:盡可能選擇靠近5′端包含酶切位點的一段外顯子編碼序列,便于載體構建后的gRNA切割效率的驗證;靶序列必須在全基因組中比對且唯一,否則會形成錯誤切割影響實驗結果;選擇高G+C含量的靶位點,增加向導sgRNA和DNA結合穩定性,從而提高切割效率[14]。

1.2.2 重疊引物的設計和sgRNA的構建 向導sgRNA的轉錄必須由Ⅲ型啟動子驅動,本研究選擇人類的Ⅲ型啟動子H1作為gRNA的啟動子,H1啟動子已成功在灰蓋鬼傘中得到了應用[15]。分別以P18T-H1、p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t、pgFvs-hph質粒為模板,通過設計特異性重疊引物克隆H1啟動子片段(記為H1 249 bp)、gRNA和終止子片段(記為Y-gRNA 118 bp)以及篩選標記基因潮霉素的完整表達框(記為Hph 2227 bp),使相鄰片段間有20 bp的重疊區域,且引物設計時引入靶位點的20 bp于gRNA表達框中,用Pfu高保真酶擴增這三個片段。PCR程序為:94 ℃預變性5 min后,94 ℃,變性30 s;Tm-5 ℃退火30 s,72 ℃延伸0.5 kb/min;共33個循環,最后72 ℃,延伸10 min,PCR產物4 ℃下保存。

表1 引物序列信息

將擴增成功的三個目的片段通過瓊脂糖電泳后,按照PCR產物回收試劑盒操作步驟切膠回收目的片段,采用降落重疊PCR進行片段融合,電泳后通過凝膠成像儀鑒定融合后的PCR產物大小是否與預期大小一致,成功獲得的PCR產物連接pMD18-T載體4 ℃連接過夜后轉化大腸桿菌感受態細胞,37 ℃培養過夜后,隨機挑取單菌落進行搖菌,送菌液去華大測序,驗證融合片段是否正確連接T載體,成功構建的載體記為pgRNA-T。

1.2.3 pgFvs-Cas9-gRNA重組載體的構建 以載體pgRNA-T為模板,設計特異性引物(Ht-F/Ht-R)擴增片段H1-gRNA-Hph,在片段兩端引入KpnI酶切位點和15 bp載體框架重疊區域,把成功擴增得到的片段用KpnI酶切4 h后通過T4連接酶連接KpnI酶切線性化的載體pgFvs-cas9框架,連接體系為:插入片段4 μL,載體pgFvs-Cas9片段4 μL,T4 DNA Ligase 1 μL,10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μL,4 ℃連接過夜后轉大腸桿菌DH5α感受態細胞,涂布于50 μg/mL的氨芐LB板培養,待菌落長出后挑取單菌落搖菌,參照質粒小提試劑盒操作提質粒,通過設計的Cas9引物對獲得的質粒進行PCR分子鑒定,同時用Kpn I酶單酶切得到的質粒進行酶切鑒定,鑒定正確的質粒由華大基因測序。

1.2.4 重組載體pgFvs-Cas9-gRNA的轉化和篩選鑒定 采用PEG介導法轉化重組質粒于金針菇原生質[16],轉化后涂板于添加了潮霉素的原生質體再生平板(RM)上培養,25 ℃靜置培養,待長出菌落隨機挑取長出的擬轉化子轉接于PDA平板培養,提擬轉化子菌絲細胞DNA進行Cas9和gRNA片段的PCR鑒定。

1.3 數據處理

CRISPR gRNA在線設計工具(http://crispr.dbcls.jp/);PCR擴增引物設計軟件:primer Premier 5.0;質粒結構圖軟件DNAMAN。

2 結果與分析

2.1 靶位點的確定和引物設計

根據CRISPR gRNA在線設計工具,參考軟件自帶評分參數,選擇G+C含量高達60%的位點用于gRNA載體的構建,靶位點序列信息為GTGGCA GGGAACGCGTGAAAAGG。本研究的引物由軟件primer Premier 5.0設計,具體引物序列信息見表1。

2.2 sgRNA載體的構建

以P18T-H1、p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t、pgFvs-hph質粒為模板,通過特異性引物H-F/H-R、Y-F/Y-R、Pgf-h F/Pgf-h R成功擴增到目標片段,結果如圖1所示。圖1A是片段H1和Y-gRNA,大小分別是249 bp和118 bp,前四個泳道是H1 PCR產物,泳道5是Y-gRNA的PCR產物,以東盛MarkIII作參照,在200 bp左右均成功克隆出目標條帶。圖1B是片段hph的電泳圖,結果表明成功克隆2227 bp的hph片段。瓊脂糖回收試劑盒切膠回收目標片段后,通過降落重疊PCR融合3個重疊片段,電泳結果如圖1C所示,3個片段整合后大小為2594 bp,從圖1C中,泳道1～3在目標位置條帶不明顯,但是在泳道4的2000 bp和3000 bp中間位置可以觀察到一條清晰明亮的條帶,說明片段大小符合預期,華大測序結果表明融合片段成功連接T載體,過渡載體pgRNA-T構建成功。

圖1 基因片段PCR擴增和融合電泳圖Fig.1 Electrophoregram of PCR amplification and fusion注:M:分子量MarkⅢ;A:1～4片段H1擴增,5片段 gRNA擴增;B:1片段hph PCR擴增圖;C、1～4 3個片段PCR融合效果圖。

2.3 重組載體pgFvs-Cas9-gRNA PCR鑒定和酶切鑒定

將過渡載體pgRNA-T和Cas9載體框架用T4連接酶重組后,轉化大腸桿菌感受態細胞進行鑒定,隨機挑取轉化后的6個單菌落進行Cas9基因短片段(910 bp)的鑒定,從圖2A可以看出,目標條帶明亮單一且符合預期。提取這6管的質粒進行酶切鑒定,從圖2 B電泳結果可以看出,1、2、3、6成功得到了Cas9框架(8047 bp)和H1-gRNA-Hph片段(2594 bp),而4、5的酶切結果可能是質粒重組過程兩段H1-gRNA-Hph形成聚合物所致。華大基因測序結果顯示,重組質粒pgFvs-Cas9-gRNA成功插入了Mads-8靶位點序列,敲除載體構建成功,構建后的質粒結構圖見圖3。

圖2 重組質粒pgFvs-Cas9-gRNA的PCR和酶切鑒定圖Fig.2 PCR and enzyme digestion figure of recombinant plasmid pgFvs-Cas9-gRNA注:M:分子量MarkⅢ;A:1～6單菌落Cas9鑒定圖;B:1～6重組質粒酶切鑒定圖。

圖3 重組質粒結構圖Fig.3 Structure of recombinant plasmid

2.4 重組質粒的轉化和擬轉化子的鑒定

質粒轉化金針菇原生質體后,原生質體在潮霉素抗性平板上的生長趨勢如圖4所示,部分原生質體通過了潮霉素篩選長出了菌落,這些通過篩選的原生質體極有可能是成功轉化了重組質粒,使得質粒上的潮霉素的基因得到了表達。對篩選得到的擬轉化子進行Cas9基因的表達驗證,結果如圖5,可以看出,在篩選得到的擬轉化子中成功鑒定得到了1個表達Cas9基因的轉化子,至此,本研究成功實現了表達載體在金針菇的轉化。

圖4 原生質體轉化平板Fig.4 Transformation culture plate of protoplast

圖5 重組載體轉化鑒定Fig.5 Identification of recombinant vector transformation注:M:分子量MarkⅢ,1～9:單菌落Cas9基因鑒定,10:陰性對照,11:Cas9質粒陽性對照。

3 討論與結論

作為一種新興的基因組定點編輯技術,CRISPR/Cas9系統的兩個主要元件是具有向導作用的sgRNA和Cas9核酸酶切割蛋白,因此,在CRISPR/Cas9系統中,向導sgRNA對靶位點基因的定點識別扮演著非常重要的作用,構建gRNA載體時,除了其靶位點的選擇必須遵循一定原則外,gRNA啟動子也至關重要。已有研究證明,在真菌的CRISPR/Cas9基因編輯系統中,gRNA使用III型U6啟動子啟動的sgRNA表達明顯高于II型TrpC啟動子,甚至由II型啟動子起始轉錄得到的gRNA不能誘導某些目標基因產生DSB效應[17]。本研究特別選用已經在灰蓋鬼傘中成功應用,且能促進轉錄表達的三型啟動子H1作為gRNA載體的啟動子,旨在構建更高敲除效率的金針菇基因組表達載體。目前,國內外對CRISPR/Cas9系統的研究發展迅速,人們已經不僅僅滿足于它的基因敲除功能探究,Yukiko[18]等人在斑馬魚中實現了基因的敲入,而在載體的構建方法上,王令[19]等研究者利用寡聚核苷酸直接退火的方法直接把靶位點序列引入Cas9載體,摒棄了傳統分子克隆和酶切處理構建sgRNA的方法,低成本且快速獲得CRISPR/Cas9基因組靶向編輯系統,這些研究成果對今后的研究工作都有重要的參考價值。

近些年,隨著高等真菌分子生物學的發展和基因工程技術的成功應用,借助基因工程技術定向育種成為繼原生質體技術后的一次技術飛躍,它能突破一般傳統常規育種的限制,給育種研究工作帶來了新的曙光[20]。本研究基于金針菇菌絲和原基兩個生長階段的基因轉錄組數據分析,以金針菇生長發育階段的轉錄因子MADS-box中的Mads-8基因為研究對象,借助基因編輯工具CRISPR/Cas9系統,成功構建了重組敲除載體pgFvs-cas9-gRNA,首次探索CRISPR/Cas9編輯系統對金針菇基因組的編輯作用,并成功實現了重組載體在金針菇的轉化,從而為進一步深入探究金針菇生長發育的機理和定向培育優質高產的金針菇菌株奠定基礎。

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Construction ofFlammulinavelutipesgenome editing vector by using CRISPR/Cas9 system

LUO Run1,2,LIN Jun-fang1,2,3,*,GUO Li-qiong1,2,3,*,YE Zhi-wei1,2,GUO Tian-fen1,2,YUN Fan3

(1.College of Food Science,South China Agricultural University&Institute of Food Biotechnology,South China Agricultural University,Guangzhou 510640,China;2.Microecologics Engineering Center of Guangdong Province,Guangzhou 510640,China;3.Alchemy Biotechnology Co,Ltd. of Guangzhou City,Guangzhou 510760,China)

High-efficiency gene editing system CRISPR/Cas9 system was employed to construct aFlammulinavelutipesMads-8 gene knockout vector and transformation system. Based on the transcriptome data,efficient targeted point sequence was selected by analyzing the sequence information of gene Mads-8 to construct transition vecter sgRNA-T withhphas selection marker gene. The target sequence of vecter sgRNA-T was comfirmed by colony PCR and DNA sequencing. Recombinant vector pgFvs-Cas9-gRNA was constructed using expression vector pgFvs-cas9 as the frame and verified by PCR methods and digestion with restriction enzyme. Recombinant vector infectedFlammulinavelutipesprotoplast with PEG mediating. Hygromycin resistance plate was used to screen the transformants,and the Cas9 gene was verified by PCR amplifying using genomic DNA as template. Results showed that targeted point sequence was successfully inserted into the recombinant vector followed by the transformation into the genome ofFlammulinavelutipes. In this work,a complete method ofFlammulinavelutipesgenome knockout and transformation was established. This method will provide theoretical foundation for the following gene functional identification and breeding research inFlammulinavelutipes.

Flammulinavelutipes;CRISPR/Cas9;transcriptome;MADS-box;PEG transformation

2016-04-14

羅潤(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail:aliceluorun@163.com。

*通訊作者:郭麗瓊(1963-)，女，教授，研究方向：食用菌天然產物研究，E-mail:guolq@scau.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31372116，31572178)；廣東省科技計劃項目(2014B020205003，2014B050505018)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000

林俊芳(1962-)，男，研究員，研究方向：天然產物的生物制造研究，E-mail:linjf@scau.edu.cn。