柚苷酶高產(chǎn)菌株的選育及培養(yǎng)基優(yōu)化

李 耀,陳曉龍,李睿曉,闞建全

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶400715;2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400715;3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,重慶400715)

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柚苷酶高產(chǎn)菌株的選育及培養(yǎng)基優(yōu)化

李 耀,陳曉龍,李睿曉,闞建全

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶400715;2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400715;3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,重慶400715)

為了獲得高產(chǎn)穩(wěn)定的柚苷酶產(chǎn)生菌,以分離純化出的36株黑曲霉菌為材料,利用常規(guī)篩選方法從中選出黑曲霉菌株M53,采用紫外線和LiCl復(fù)合誘變,選育出一株柚苷酶高產(chǎn)突變株M53-7,并通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)該菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,正交優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為蔗糖 0.5%、豆餅粉 3.0%、NH4NO31.0%、K2HPO40.1%,無機(jī)鹽CaCl2、MgSO4·7H2O、ZnSO4在發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加量分別為0.1%、0.5%、0.1%;采用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)突變菌株M53-7進(jìn)行搖床發(fā)酵,其發(fā)酵液中柚苷酶活力可達(dá)到906.28 U/mL,且產(chǎn)酶性能穩(wěn)定。

柚苷酶,黑曲霉菌,誘變,突變菌株,發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

柚汁是一種時(shí)下流行的飲品,具有很好的保健功效,而其較重的苦味令一些消費(fèi)者望而卻步。柚汁的主要致苦因子是柚皮苷,柚皮苷是一種二氫黃酮類化合物,學(xué)名是柚皮素-7-β-D-葡萄糖(2,1)-α-L-鼠李糖。目前,柚汁脫苦的主要方法有:吸附法脫苦、分離技術(shù)脫苦、添加苦味抑制劑法、酶法脫苦及加熱或改善榨汁方法等脫苦方法[1-2]。酶法脫苦是利用柚苷酶作用于柚皮苷達(dá)到脫苦目的,柚苷酶由β-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶組成,是一種能水解柚苷生成柚苷配基而起到脫苦作用的酶[3]。酶法脫苦效果好、較溫和,是柚汁較理想的脫苦方法[4]。張怡[5]利用平板透明圈篩選的方法,篩選出一株產(chǎn)柚苷酶活力達(dá)365.31 U/mL的黑曲霉,陳玲[6]采用亞硝基胍對(duì)柚苷酶產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變處理,經(jīng)過透明圈初篩和多次搖瓶復(fù)篩,得到1株產(chǎn)柚苷酶活力高達(dá)770.06 U/mL的菌株,肖安風(fēng)[7]將一株黑曲霉發(fā)酵工藝經(jīng)過優(yōu)化,使柚苷酶的最大酶活力達(dá)到727.44 U/mL,張晨[8]將一株野生產(chǎn)柚苷酶菌株經(jīng)搖床培養(yǎng)使產(chǎn)柚苷酶活力達(dá)到342 U/mL。目前應(yīng)用酶法脫苦還存在著高產(chǎn)菌株缺乏、產(chǎn)酶效率低、成本高等問題,從而導(dǎo)致了柚苷酶在柚子深加工中的應(yīng)用受到了極大的限制,因此篩選柚苷酶高產(chǎn)穩(wěn)定菌株、生產(chǎn)高品質(zhì)的柚苷酶商品酶制劑已成為當(dāng)務(wù)之急[9]。因此,本實(shí)驗(yàn)利用柚苷酶半固體高層試管透明層篩選方法,并采用紫外線和LiCl復(fù)合誘變,選育出一株柚苷酶高產(chǎn)突變株M53-7,與之前的研究相比,該菌株具有更高酶活力,且產(chǎn)酶性能穩(wěn)定,可為柚苷酶的工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種:36株野生黑曲霉(Aspergillusniger)為西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室選育的菌種;柚苷標(biāo)品 Sigma公司;一縮二乙二醇、醋酸、蔗糖、黃豆粉 重慶川東化工有限公司;NH4NO3、MgSO4·7H2O、CaCl2、ZnSO4成都科龍化工試劑廠;實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為分析純。

DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器 蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;OLYMPUS-BX43生物顯微鏡 日本奧林巴斯公司;PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;BioSpec-Mini紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 培養(yǎng)基配制

柚苷低糖半固體培養(yǎng)基:MgSO4·7H2O 0.5%、KH2PO41.0%、KCl 0.5%、NaNO30.3%、FeSO40.01%、瓊脂0.6%、蔗糖 0.5%、柚苷 0.3%、自然pH,121 ℃滅菌20 min。以20 mm×150 mm試管為容器,裝量均為10 mL。

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯去皮,稱取200 g后切成小塊,加水煮沸30 min,紗布過濾,補(bǔ)足水至1000 mL,添加20 g蔗糖和15 g瓊脂,攪拌溶化,121 ℃滅菌20 min[10]。

發(fā)酵初始培養(yǎng)基:黃豆粉2%、蔗糖 0.5%、CaCl20.1%、K2HPO40.1%、MgSO4·7H2O 0.5%、ZnSO40.1%、柚苷 0.1%、自然pH,121 ℃滅菌20 min[11]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單孢子懸浮液的制備 將4 ℃貯藏的菌種接種于PDA培養(yǎng)基上,28 ℃條件下培養(yǎng)3 d得成熟孢子,用0.75%的無菌生理鹽水洗下孢子,放入裝有無菌玻璃珠和50 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中,充分振蕩30 min。待孢子充分打散后,測(cè)菌懸液OD600值,再用無菌生理鹽水調(diào)整其OD值至0.2,得單孢子菌懸液[12-14]。

1.3.2 柚苷酶酶活力測(cè)定方法 取適量搖瓶發(fā)酵液,5000 r/min離心10 min,取上清液即柚苷酶粗酶液。將2 mL 0.1%柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.2 mol/L的pH4.0的醋酸緩沖液1.9 mL置于試管中,在40 ℃恒溫水浴中預(yù)熱5 min后,加入提前稀釋好的粗酶液0.1 mL,充分搖勻,保溫30 min,迅速吸取0.1 mL置于15 mL的比色管中,加入5 mL的90%一縮二乙二醇,0.4 mL蒸餾水和0.5 mL的1 moL/L的NaOH溶液,搖勻后在30 ℃保溫30 min,倒入厚度1cm的比色皿中,在420 nm處測(cè)吸光度[15-16]。以0.1 mL蒸餾水做同樣處理,作為對(duì)照,在420 nm處測(cè)吸光度[5]。查標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得剩余柚皮苷的質(zhì)(μg),與總的柚皮苷質(zhì)量(μg)作差比較,即可求出酶解的柚皮苷質(zhì)量M(μg)。

柚苷酶酶活力的定義:在40 ℃、pH4.0的條件下,每分鐘每毫升酶液分解柚皮苷的質(zhì)量(μg)。

酶活力(U/mL)=M·N/T·V

(1)

式中,M-酶解的柚皮苷質(zhì)量(μg);N-稀釋倍數(shù);T-酶解反應(yīng)時(shí)間(min);V-測(cè)定取用柚苷酶發(fā)酵液體積(mL)。活力單位定義:在40 ℃、pH4.0條件下每分鐘水解1 μg柚皮苷的酶活力為1 U(μg/min)。

1.3.3 誘變出發(fā)菌株的篩選 含柚苷的高層試管表面生長(zhǎng)的柚苷酶產(chǎn)生菌合成的酶液經(jīng)瓊脂擴(kuò)散后水解柚皮苷,會(huì)產(chǎn)生透明的溶解層,可根據(jù)溶解層的高度來判斷菌株的產(chǎn)酶能力。將36株黑曲霉產(chǎn)酶菌分別點(diǎn)接于柚苷低糖半固體培養(yǎng)基中,編號(hào),30 ℃培養(yǎng)7 d,根據(jù)透明層的厚度初步判定這些菌株的產(chǎn)柚苷酶能力;將單孢子菌懸液于4 ℃冰箱中放置1 h,使之同步培養(yǎng),然后取出,待溫度升至室溫,以10%的接種量接種至裝液量為45 mL 的錐形瓶(規(guī)格250 mL)中,在32 ℃、190 r/min的條件下培養(yǎng)72 h后取樣。發(fā)酵液于室溫下3500 r/min離心 10 min,然后測(cè)定上清液中柚苷酶活力[17-18]。

1.3.4 誘變方法 取活化后的出發(fā)菌株孢子懸液0.5 mL,然后梯度稀釋至10-4。分別取0.2 mL涂布于含有0.1%、0.2%、0.3% LiCl的PDA培養(yǎng)基上,15 W紫外燈,距離30 cm分別照射0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 min,然后避光30 ℃培養(yǎng)3 d,待長(zhǎng)出菌落后計(jì)數(shù),按公式(2)計(jì)算致死率[19]。

致死率(%)=未處理懸液?jiǎn)纹桨寰鋽?shù)-處理后懸液?jiǎn)纹桨寰鋽?shù)/未處理懸液?jiǎn)纹桨寰鋽?shù)×100

(2)

1.3.5 突變菌株的性能測(cè)試 將突變菌株接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別在24、28、32、36、40 ℃下?lián)u床180 r/min培養(yǎng)96 h,測(cè)菌絲干重;在最適生長(zhǎng)溫度下,將突變菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別在pH為3、4、5、6、7下?lián)u床180 r/min培養(yǎng)96 h后測(cè)菌絲干重[20];將得到的產(chǎn)酶活力較高的菌株連續(xù)傳代10代,測(cè)定菌株產(chǎn)柚苷酶活力。

1.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素實(shí)驗(yàn) 以物料的重量(g)占培養(yǎng)基體積(100 mL)的百分比含量來表示物料在培養(yǎng)基中的添加量,分別考察碳源蔗糖添加量(0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%),無機(jī)氮源NH4NO3添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%),有機(jī)氮源豆餅粉添加量(0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%),無機(jī)鹽Ca2+、Mg2+、Zn2+添加量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶活力的影響。當(dāng)考察某一因素時(shí),其他已考察因素固定,未考察因素保持為基礎(chǔ)培養(yǎng)基狀態(tài)。在30 ℃下180 r/min恒溫培養(yǎng)5 d,測(cè)柚苷酶活力。

1.3.7 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及參考文獻(xiàn),以蔗糖添加量(0.5%、1.0%、1.5%)、豆餅粉添加量(2.0%、3.0%、4.0%)、NH4NO3添加量(0.5%、1.0%、1.5%)、K2HPO4添加量(0.05%、0.10%、0.15%)[5,7,11,21]為實(shí)驗(yàn)因素,以柚苷酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo),在30 ℃下180 r/min恒溫培養(yǎng)5 d,測(cè)柚苷酶活力[22]。設(shè)計(jì)4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)表,優(yōu)化柚苷酶搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基配方。

表1 因素與水平設(shè)計(jì)表

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,用Excel 2003處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差”來表示。

表2 36株野生菌株及其產(chǎn)柚苷酶活力

表3 紫外線和LiCl復(fù)合誘變致死率

2 結(jié)果與分析

2.1 野生高產(chǎn)柚苷酶菌株的篩選結(jié)果

對(duì)實(shí)驗(yàn)室初篩出來的36株產(chǎn)柚苷酶菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn),測(cè)定其酶活力,選擇酶活力最高的菌株作為誘變出發(fā)菌株。由表2分析可知,M41、M44、M48、M53、M61、M70比其它菌株的產(chǎn)柚苷酶能力強(qiáng),其中M53產(chǎn)柚苷酶能力最強(qiáng),其發(fā)酵液的柚苷酶活力達(dá)到507.07 U/mL。因此,選擇M53作為誘變選育的出發(fā)菌株。

2.2 M53菌株的紫外線和LiCl復(fù)合誘變實(shí)驗(yàn)

2.2.1 紫外線和LiCl復(fù)合誘變的不同處理?xiàng)l件下黑曲霉(M53)的致死率 采用紫外線和LiCl復(fù)合誘變對(duì)篩選出的產(chǎn)柚苷酶(M53)黑曲霉進(jìn)行誘變處理,計(jì)算致死率(見表3)。從表3分析可得,隨著紫外線照射時(shí)間的增加,菌體致死率升高,M53菌株對(duì)紫外線光不敏感,紫外線作用9 min時(shí),致死率才達(dá)到91.8%。當(dāng)LiCl的添加量為0.3%時(shí),紫外照射2 min后致死率就達(dá)到90%以上;當(dāng)LiCl的添加量為0.2%時(shí),紫外照射4 min后菌株致死率高于90%。研究表明[23-24],致死率在80%～90%時(shí)正突變株較多,致死率在90%～99.9%時(shí)負(fù)突變株較多,故可選擇添加0.2%的LiCl結(jié)合紫外照射3 min或添加0.3%的LiCl結(jié)合紫外照射1 min作為誘變處理?xiàng)l件。而LiCl本身對(duì)菌體有毒害作用,高質(zhì)量濃度的LiCl會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)[19],綜合考慮,實(shí)驗(yàn)選擇添加0.2%的LiCl結(jié)合紫外照射3 min作為誘變處理?xiàng)l件。

表4 紫外線和LiCl復(fù)合誘變菌株的生長(zhǎng)性狀

2.2.2 突變株的篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果 從誘變后的平板中挑取出菌落生長(zhǎng)旺盛、透明圈大的菌斑,分別點(diǎn)接于PDA平板培養(yǎng)基上,30 ℃下恒溫培養(yǎng),連續(xù)3次轉(zhuǎn)接,從中挑取“透明圈直徑/菌落直徑”較大的突變株(大于出發(fā)菌株M53),再對(duì)其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵篩選,測(cè)定其酶活力,挑取酶活力高于出發(fā)菌株M53(507.07 U/mL)的突變株,對(duì)其編號(hào)。突變株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況如表4所示。從表4分析可得,經(jīng)紫外線和LiCl復(fù)合誘變后,突變株編號(hào)M53-7的菌株產(chǎn)酶活力最高,為721.08 U/mL,比出發(fā)菌株提高214.01 U/mL,提高率達(dá)42.21%。因此,可以將突變株M53-7作為目的菌株。

2.3 目的突變菌株的性能檢測(cè)

2.3.1 目的突變菌株M53-7最適生長(zhǎng)條件 發(fā)酵液的pH對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生成有較大的影響,因此,需要對(duì)發(fā)酵過程中pH進(jìn)行控制。圖1為不同發(fā)酵pH對(duì)黑曲霉M53-7生長(zhǎng)的影響,其中pH5.0對(duì)黑曲霉M53-7菌體生長(zhǎng)相對(duì)有利,在該條件下菌體干重最大;pH控制為7.0時(shí),黑曲霉M53-7生長(zhǎng)較差。

圖1 突變株M53-7最適生長(zhǎng)pHFig.1 The optimum fermentation pH of the mutant M53-7

發(fā)酵溫度的控制也對(duì)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累具有重要的意義,溫度過高容易使酶失活,菌體易衰老;溫度還會(huì)影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)和溶解氧,從而間接影響生物合成。從圖2可以看出,當(dāng)發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí),黑曲霉M53-7菌體生長(zhǎng)相對(duì)最好,在該條件下,菌體干重值最大;當(dāng)發(fā)酵溫度為36 ℃和40 ℃時(shí),黑曲霉M53-7菌體生長(zhǎng)良好,但當(dāng)發(fā)酵溫度為24 ℃時(shí),黑曲霉M53-7基本不生長(zhǎng)。

圖2 突變株M53-7最適生長(zhǎng)溫度Fig.2 The optimum fermentation temperature of the mutant M53-7

2.3.2 目的突變菌株M53-7的生長(zhǎng)性能曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果 出發(fā)菌株M53和突變菌株M53-7在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線及其含0.05%柚苷的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶活力曲線見圖3。由圖3分析可得,在最適生長(zhǎng)溫度32 ℃和最適pH5下,突變菌株M53-7和出發(fā)菌株M53分別在24、36 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,60 h進(jìn)入穩(wěn)定期。在發(fā)酵過程前期,從0～24 h孢子萌發(fā),兩菌株的菌絲迅速生長(zhǎng),開始形成菌絲團(tuán),不產(chǎn)柚苷酶;24～54 h菌絲繼續(xù)生長(zhǎng);60～96 h兩菌株菌絲生長(zhǎng)停止,發(fā)酵液變褐色,酶活力快速上升;突變菌株M53-7在96 h產(chǎn)酶活力最高,出發(fā)菌株M53在108 h產(chǎn)酶活力最高;之后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),菌絲自溶,發(fā)酵液變稀,產(chǎn)酶趨緩,酶活力都有所下降。突變菌株M53-7與出發(fā)菌株M53相比,菌體生長(zhǎng)速度快,產(chǎn)菌絲豐富,發(fā)酵產(chǎn)酶周期較短。

圖3 突變株M53-7與出發(fā)菌株M53的生長(zhǎng)性能曲線Fig.3 The growth curves and the enzymeproducing curves of the two moulds

2.3.3 突變菌株M53-7的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將突變菌株M53-7于PDA培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)10次,在其最適發(fā)酵條件下進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵,測(cè)定各代的酶活力,觀察其產(chǎn)酶的穩(wěn)定性。從表5可看出,經(jīng)過傳代10次,突變株M53-7各代產(chǎn)酶能力均維持在第一代721.08 U/mL左右,該菌株產(chǎn)酶的性能較穩(wěn)定。

表5 突變株M53-7的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 碳源蔗糖添加量對(duì)產(chǎn)柚苷酶的影響 由圖4可知,發(fā)酵液中柚苷酶酶活力隨蔗糖添加量的增加呈先增后減的趨勢(shì),當(dāng)蔗糖添加量小于0.5%時(shí),發(fā)酵液的酶活力和蔗糖添加量呈正相關(guān),蔗糖添加量在0.5%時(shí),發(fā)酵液酶活力最大為729.85 U/mL,蔗糖添加量大于0.5%時(shí),發(fā)酵液酶活力與蔗糖添加量呈負(fù)相關(guān),蔗糖添加量在1.5%時(shí),發(fā)酵產(chǎn)酶能力高于0.2%的蔗糖添加量。因此,選擇0.5%～1.5%的蔗糖添加范圍進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖4 蔗糖濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of sucrose content amount on naringinase production

2.4.2 無機(jī)氮源NH4NO3添加量對(duì)產(chǎn)柚苷酶的影響 從圖5可知,NH4NO3添加量小于1%時(shí)發(fā)酵液中柚苷酶酶活力與其增加呈正相關(guān),當(dāng)NH4NO3添加量為1%時(shí),發(fā)酵液酶活力最大,當(dāng)NH4NO3添加量大于1%后發(fā)酵液酶活力與其添加量呈負(fù)相關(guān)。故選擇0.5%～1.5%的NH4NO3添加量作為正交實(shí)驗(yàn)的范圍。

圖5 NH4NO3濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of NH4NO3 addition amount on naringinase production

2.4.3 有機(jī)氮源豆餅粉對(duì)產(chǎn)柚苷酶的影響 從圖6知,豆餅粉添加量小于3%時(shí)發(fā)酵液中柚苷酶酶活力與其增加呈正相關(guān),豆餅粉的添加量在3%時(shí),酶活力最高。當(dāng)豆餅粉添加量繼續(xù)增加時(shí),酶活力與豆餅粉添加量呈負(fù)相關(guān)。因此,選擇豆餅粉添加量范圍2%～4%進(jìn)行后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)。

圖6 豆餅粉濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of soybean cake powder addition amount on naringinase production

2.4.4 不同濃度無機(jī)鹽離子對(duì)產(chǎn)酶的影響 從圖7可知,隨著MgSO4·7H2O濃度的升高,柚苷酶酶活力不斷提高,當(dāng)MgSO4·7H2O的濃度達(dá)到0.5%時(shí),酶活力最大達(dá)到778.76 U/mL。當(dāng)CaCl2的濃度為0.1%時(shí),酶活最高為767.26 U/mL,隨著CaCl2濃度的升高,酶活力逐漸下降。ZnSO4的添加量為0.1%時(shí),酶活為736.33 U/mL,而增加其用量后,酶活力明顯下降,因此少量的Ca2+、Zn2+離子有助于產(chǎn)酶,由于有機(jī)氮源自身已含有少量無機(jī)鹽金屬離子,過量的添加Ca2+、Zn2+離子就會(huì)抑制酶活力。因此,取MgSO4·7H2O添加量0.5%、CaCl2添加量0.1%、ZnSO4添加量0.1%來促進(jìn)產(chǎn)酶。

圖7 不同濃度無機(jī)鹽離子對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of different concentrations of metal ions on naringinase production注:1為MgSO4·7H2O;2為CaCl2;3為ZnSO4。

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 培養(yǎng)基配方正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)及極差分析結(jié)果見表6,由表6可知,影響突變菌株M53-7搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶活力的4種培養(yǎng)基主要成分的主次順序是:B>C>A>D,即豆餅粉>NH4NO3>蔗糖>K2HPO4。方差分析結(jié)果見表7,由表7可知,豆餅粉對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶活力的影響極顯著,NH4NO3對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶活力的影響顯著,而蔗糖和K2HPO4對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶活力的影響不顯著。分析同一因素不同水平下所對(duì)應(yīng)的發(fā)酵產(chǎn)酶活力大小,得到最優(yōu)水平組是:A1B2C2D2,即得出實(shí)驗(yàn)最優(yōu)方案為:蔗糖0.5%、豆餅粉3.0%、NH4NO31.0%、K2HPO40.1%。采用四因素的最佳值,進(jìn)行3次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證測(cè)得發(fā)酵液中柚苷酶活力為906.28 U/mL。

表7 方差分析表

注:*表示在p<0.05水平上差異顯著。

3 結(jié)論

從36株產(chǎn)柚苷酶黑曲霉中篩選出一株產(chǎn)柚苷酶活力為507.07 U/mL的野生型菌株。M53經(jīng)紫外線和LiCl復(fù)合誘變,選育出一株產(chǎn)柚苷酶能力更高的突變型菌株M53-7,其產(chǎn)柚苷酶酶活力為721.08 U/mL,最適生長(zhǎng)溫度在32 ℃,最適生長(zhǎng)pH為5.0,產(chǎn)酶性能穩(wěn)定。經(jīng)過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后,突變菌株M53-7搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為蔗糖 0.5%、豆餅粉3.0%、NH4NO31.0%及K2HPO40.1%,無機(jī)鹽CaCl2、MgSO4·7H2O和ZnSO4在發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加量分別為0.1%、0.5%、0.1%。采用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖床發(fā)酵突變型菌株M53-7,其發(fā)酵液中柚苷酶酶活力達(dá)到906.28 U/mL。與國(guó)內(nèi)外同類研究相比,本研究特點(diǎn)如下:采用液態(tài)發(fā)酵方法生產(chǎn)柚苷酶,比固態(tài)發(fā)酵法技術(shù)先進(jìn),機(jī)械化程度高,過程控制更精確,工藝符合產(chǎn)業(yè)化要求;通過選育及優(yōu)化培養(yǎng)基后大幅度提高了柚苷酶的發(fā)酵水平。

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Breeding and screening of a Naringinase-producing strain and optimization of culture medium

LI Yao1,CHEN Xiao-long1,LI Rui-xiao1,KAN Jian-quan1,2,3,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing,400700,China;2.Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage,Chongqing,400715,China;3.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and preservation(Chongqing),Ministry of Agriculture,Chongqing 400715,China)

In order to obtain a high yield and stable naringin enzyme producing bacteria,taking the 36 strains ofAspergillusnigerasthe experimental material,a strain ofnaringinase production strain M53 was obtained by conventional screening methods. A mutational strain named M53-7 was bred through multiple mutagenesis(LiCl treatment and UV irradiation). The culture medium of M53-7 was optimized by orthogonal experiment. The results showed that the optimal parameters for the fermentation culture medium were as follows:sugar 0.5%,soybean meal 3.0%,NH4NO31.0%,K2HPO40.1%,CaCl20.1%,MgSO4·7H2O 0.5%,ZnSO40.1%.Under the optimum conditions,the enzymatic activity of M53-7 was 906.28 U/mL.The research proved that the M53-7 was born with the stable performance at naringinase-producing,and it can be utilized in industrial production.

Naringin enzyme;Aspergillusniger;mutagenesis;mutant strain;optimization of fermentation medium

2016-05-24

李耀(1991-)，男，碩士，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)，E-mail：549883499@qq.com。

*通訊作者:闞建全(1965-)，男，博士，教授，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)，E-mail：ganjq1965@163.com。

TS261.1

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000