超聲輔助提取雨生紅球藻渣多糖工藝優化

張 苗,劉曉娟,劉 欣

(華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642)

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超聲輔助提取雨生紅球藻渣多糖工藝優化

張 苗,劉曉娟,劉 欣

(華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642)

以提取過蝦青素后的雨生紅球藻渣為原料,采用超聲輔助熱水浸提法提取藻多糖。在單因素實驗基礎上,通過正交實驗設計對雨生紅球藻多糖提取工藝進行優化,并與傳統的熱水浸提工藝進行對比。結果表明,雨生紅球藻多糖的最佳提取工藝為:超聲功率400 W,超聲時間30 min,水浴溫度90 ℃,水浴時間3 h,料液比1:25,在此條件下多糖得率為3.48%,得率比傳統法提高了27%。超聲輔助熱水浸提法是雨生紅球藻多糖提取的有效途徑,為藻多糖的進一步研究提供基礎,為雨生紅球藻渣的綜合開發利用提供理論依據。

雨生紅球藻,多糖,超聲輔助提取,正交實驗

雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis),在分類學上屬于綠藻門、綠藻綱、團藻目、紅球藻科、紅球藻屬,是一種在淡水中生長的單細胞綠藻[1]。雨生紅球藻中蝦青素含量高達干重的2.0～5.0%,被公認為自然界中生產天然蝦青素的最好生物來源[2],在美國已經獲得了食品與藥品管理局(FDA)的批準,允許作為新的膳食成分進入保健品市場。天然蝦青素具有很強的抗氧化特性[3-4],同時還具有增強機體免疫力活性、促進癌細胞凋亡[5]和著色作用[6-7]等。從雨生紅球藻中提取蝦青素是目前研究開發的熱點,提取完蝦青素后剩下的藻渣雖含有豐富的營養成分,卻因缺乏科學利用方法大都作為肥料甚至廢料丟棄。雨生紅球藻中碳水化合物所占比例較高,約占細胞干重的30%～40%,多糖含量高達干重的6%～10%,且雨生紅球藻多糖成分與海洋多糖成分有所不同,這與其生長環境鹽度低有關,此特點賦予雨生紅球藻多糖特殊的生物活性,也有研究表明,雨生紅球藻多糖具有促血栓溶解活性[8]。而國內外報道藻類活性多糖的藥理功能主要還包括增強免疫[9]、抗腫瘤[10]、抗氧化[11]、抗衰老、降血糖、降血脂等[12],因此進一步開發雨生紅球藻渣多糖能更好地綜合利用雨生紅球藻資源,為新藥和保健食品的開發奠定基礎。

迄今為止,國內外對雨生紅球藻成分的研究大多集中在蝦青素,對其多糖的相關研究較少。馮以明等[8]采用冷水、熱水和5%碳酸鈉提取雨生紅球藻多糖,得率分別為2.74%、1.36%及1.55%,但未對多糖進行提取工藝優化。目前對于多糖的提取主要采用傳統的熱水浸提法[13],該方法提取耗時長且效率低,因此近年來利用超聲、微波等輔助手段進行浸提多糖逐漸成為主流[14-15]。雨生紅球藻多糖提取工藝的第一步要進行脫脂,此工藝恰好是蝦青素的提取工藝,因此雨生紅球藻多糖可以從提取完蝦青素后廢棄的藻渣中進行提取,目前國內外對雨生紅球藻渣的綜合利用未見報道,這不僅提高了資源的利用率,也增加了雨生紅球藻的附加值。本文以脫脂后的雨生紅球藻渣為原料,采用超聲波輔助熱水浸提法對雨生紅球藻多糖進行提取,在單因素基礎上進行正交實驗優化,明確雨生紅球藻中多糖的最佳提取條件,為雨生紅球藻多糖的進一步開發和利用奠定基礎,為雨生紅球藻資源的廣泛應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)藻渣 荊州天然蝦青素有限公司;葡萄糖、濃硫酸、鹽酸、NaOH、苯酚、無水乙醇等 國產分析純。

JY92-ⅡD超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;AL-104型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;HW系列電熱恒溫水浴鍋 北京市長風儀器儀表公司;RE-52A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D(III)型循環水式多用真空泵 鞏義市英峪高科儀器廠;UV-1750紫外可見分光光度計 日本島津公司;FD-1型冷凍干燥機 北京博醫康技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 雨生紅球藻渣→加入一定體積蒸餾水→超聲提取→熱水抽提→4000 r/min離心10 min→上清液濃縮→乙醇沉淀、靜置→4000 r/min離心10 min→收集沉淀→無水乙醇洗滌→冷凍干燥→多糖粗品

1.2.2 雨生紅球藻多糖的提取 精密稱取5.000 g干燥的雨生紅球藻渣,以蒸餾水為提取溶劑,在相應的功率、時間、料液比下進行超聲輔助提取,再按相應的溫度、時間熱水浸提,冷卻,4000 r/min離心10 min,取上清液濃縮,加入四倍體積無水乙醇沉淀,放置過夜,4000 r/min離心10 min后取沉淀,最后用無水乙醇洗滌兩次,冷凍干燥得雨生紅球藻粗多糖。以傳統的熱水浸提法提取藻多糖作為對照,考察這種新工藝的效果。傳統的熱水浸提工藝條件為料液比1∶30、浸提溫度80 ℃、浸提時間3 h、重復提取3次[8,16-17]。

1.2.3 多糖得率的測定 參照文獻[18]采用苯酚-硫酸法測定多糖含量,用分光光度計測定。

標準曲線繪制:精密稱取標準葡萄糖10 mg,用蒸餾水溶解,然后定容到100 mL容量瓶中,即得到每毫升含糖量為100 μg的標準溶液。將葡萄糖標準溶液配成一系列不同濃度的溶液,采用苯酚-硫酸法,測得吸光度。以吸光度值(A)為縱坐標,各標準溶液濃度(μg/mL)為橫坐標,繪制標準曲線。

樣品多糖含量測定:移取適量粗多糖提取液于試管中,按上述方法進行測定,根據回歸方程計算粗多糖含量,計算多糖得率。

1.2.4 單因素實驗 以雨生紅球藻多糖得率為指標,采用單因素實驗,研究超聲功率、超聲時間、水浴時間、水浴溫度、料液比對多糖得率的影響。每組實驗重復3次,取平均值。

1.2.4.1 超聲功率對多糖得率的影響 精密稱取5.000 g干燥的雨生紅球藻渣,料液比1∶30,超聲時間15 min,水浴溫度80 ℃,水浴時間3 h,超聲功率分別設定為100、200、300、400、500 W。

1.2.4.2 超聲時間對多糖得率的影響 精密稱取5.000 g干燥的雨生紅球藻渣,在以上因素篩選結果的基礎上,以料液比1∶30,超聲功率400 W,水浴溫度80 ℃,水浴時間3 h,超聲時間分別設定為10、15、20、25、30 min。

1.2.4.3 水浴時間對多糖得率的影響 精密稱取5.000 g干燥的雨生紅球藻渣,在以上因素篩選結果的基礎上,以料液比1∶30,超聲功率400 W,超聲時間25 min,水浴溫度80 ℃,水浴時間分別設定為1、2、3、4、5 h。

1.2.4.4 水浴溫度對多糖得率的影響 精密稱取5.000 g干燥的雨生紅球藻渣,在以上因素篩選結果的基礎上,以料液比1∶30,超聲功率400 W,超聲時間25 min,水浴時間3 h,水浴溫度分別設定為60、70、80、90、100 ℃。

1.2.4.5 料液比對多糖得率的影響 精密稱取5.000 g干燥的雨生紅球藻渣,在以上因素篩選結果的基礎上,以超聲功率400 W,超聲時間25 min,水浴時間3 h,水浴溫度80 ℃,料液比分別設定為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40。

1.2.5 正交實驗 在單因素實驗的基礎上,超聲時間、水浴溫度、水浴時間、料液比是影響雨生紅球藻多糖得率的主要因素,選擇確定超聲功率400 W基礎上,設計四因素三水平L9(34)正交表,實驗因素和水平見表1。

表1 雨生紅球藻多糖超聲提取正交實驗因素水平表

1.2.6 統計分析 采用Origin 8.5軟件作圖,數據應用SPSS 17.0統計。各項數據以“平均值±標準差”表示,用方差分析及t檢驗比較組間差異的顯著性,以p<0.05表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線制作

圖1為所繪制的標準曲線,所得的回歸方程為y=0.0074x-0.001(R2=0.9995)。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.2 單因素實驗

2.2.1 超聲功率對多糖得率的影響 由圖2可知,隨著超聲功率的增大,多糖得率逐漸上升,在400 W后增量不明顯,超聲功率對多糖得率影響不顯著(p>0.05),這是因為隨著功率的增加,超聲波對細胞壁的破碎作用增強,胞內多糖溶出速率增大,溶液中多糖的含量也逐漸增加,超聲功率達到400 W時,多糖得率趨于穩定,可能是雨生紅球藻細胞內多糖已完全釋放,因此從能耗角度及成本考慮,選取超聲功率在400 W為宜。

圖2 超聲功率對多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

2.2.2 超聲時間對多糖得率的影響 由圖3可知,隨著超聲時間的延長,多糖得率顯著上升(p<0.01),在25 min后增量不顯著(p>0.05),多糖浸出過程與時間密切相關,時間越長,超聲波使胞內多糖溶出越多,溶液中多糖的含量也逐漸增加,超聲時間達到25 min時,多糖得率趨于穩定,可能是細胞內外滲透壓減小,傳質推動力減弱,多糖浸出速率幾乎穩定,從時間角度及操作成本考慮,選取超聲時間在25 min為宜。

圖3 超聲時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on polysaccharide yield

2.2.3 水浴時間對多糖得率的影響 由圖4可知,隨著水浴時間的延長,剛開始多糖得率略有升高,變化不顯著(p>0.05),在3 h后顯著下降(p<0.01),可能是超聲一定時間后雨生紅球藻多糖幾乎浸出完全,多糖得率在水浴時間為3 h時達到最高,之后有明顯下降趨勢,由于水浴時間過長會導致多糖分解,從多糖得率及時間考慮,選取水浴時間在3 h為宜。

圖4 不同水浴時間對多糖得率的影響Fig.4 Effect of water bath time on polysaccharide yield

2.2.4 水浴溫度對多糖得率的影響 由圖5可知,隨著水浴溫度的升高,多糖得率顯著升高(p<0.01),在80 ℃后緩慢下降(p>0.05),這是因為提取溫度升高會加快溶液的擴散速率,促進細胞內的多糖物質向外擴散,水浴溫度過高時,許多大分子多糖的局部結構會發生一定程度的變化,多糖分解[19],從而影響提取效果。從多糖得率及能耗考慮,選取水浴溫度在80 ℃為宜。

圖5 不同水浴溫度對多糖得率的影響Fig.5 Effect of bath temperature on polysaccharide yield

2.2.5 料液比對多糖得率的影響 由圖6可知,隨著料液比的升高,多糖得率顯著升高(p<0.01),在1∶30后緩慢下降(p>0.05),料液比越大,多糖得率越高,其原因是提取液體積越大,溶劑與浸提物的接觸越充分,能在相同時間內溶解出更多的水溶性多糖,使提取率增大。如果料液比過大,多糖溶出量達到飽和,同時會增加超聲波破碎細胞的阻力,使細胞破碎程度下降,從而降低有效成分的提取率,類似現象在其他多糖的提取工藝研究中也多有報道[20-21],故選取料液比在1∶30為宜。

圖6 不同料液比對多糖得率的影響Fig.6 Effect of solid-to-solvent ratio on polysaccharide yield

2.3 雨生紅球藻多糖提取正交實驗

根據單因素實驗,選取超聲時間(A)、水浴溫度(B)、水浴時間(C)、料液比(D)4個因素作為考察指標。采用L9(34)正交實驗設計,超聲功率固定為400 W,進行優化雨生紅球藻多糖的提取工藝條件。正交實驗結果見表2,方差分析見表3。

表2 正交實驗設計及結果

表3 超聲波法提取結果方差分析

注:*:p<0.05,差異顯著;**:p<0.01,差異極顯著,F0.05(2,2)=19,F0.01(2,2)=99。 由表3可見,超聲時間、水浴溫度對提取結果的影響差異顯著(p<0.05)。水浴時間、料液比對提取結果影響差異不顯著。根據表2極差分析可知,對雨生紅球藻多糖得率影響程度從大到小排列是:水浴溫度>超聲時間>料液比>水浴時間,與方差分析一致。結合方差分析結果,超聲波提取的最優組合為A3B3C2D1,即超聲時間30 min,水浴溫度90 ℃,水浴時間3 h,料液比1∶25,多糖得率為3.48%,為正交表中第9號實驗組合。

采用傳統的熱水浸提法直接從藻渣中提取藻多糖作為對照,其工藝條件見1.2.2。結果顯示,多糖得率為2.55%,低于超聲波輔助熱水浸提法近27%。因此,超聲波輔助提取具有迅速、節能、操作簡便、提取率高等優點,是一種有效的雨生紅球藻多糖提取的新工藝。

3 結論

通過單因素及正交實驗,確定了雨生紅球藻渣多糖的最佳提取工藝,結果表明,影響超聲提取雨生紅球藻多糖得率的四個因素中超聲時間、水浴溫度對多糖得率的影響差異顯著(p<0.05),水浴時間、料液比對多糖得率的影響差異不顯著,其影響程度從大到小排列是:水浴溫度>超聲時間>料液比>水浴時間。確定超聲波法輔助熱水浸提的最佳工藝條件為:超聲時間30 min,水浴溫度90 ℃,水浴時間3 h,料液比1∶25。在此條件下,雨生紅球藻多糖得率達到3.48%,高于傳統的熱水浸提法近27%。所用的超聲輔助提取手段是為了破碎雨生紅球藻細胞,與傳統的熱水浸提法相比,超聲法易于操作,提取時間縮短,多糖水解相對較少,多糖得率高,同時保持多糖有效成分的原有結構和活性。超聲波作為一種新的提取手段,破碎效果好。本研究不僅為提取蝦青素后的雨生紅球藻藻渣的綜合利用提供了參考,而且為雨生紅球藻多糖進一步深入研究提供了基礎。

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Optimization of process in extracting polysaccharide assisted by ultrasonic wave fromHaematococcuspluvialisresidues

ZHANG Miao,LIU Xiao-juan*,LIU Xin

(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

Polysaccharide was extracted fromHaematococcuspluvialisresidue after extraction of astaxanthin by ultrasonic treatment cooperated with hot water extraction. Operating parameters for hot water extraction of polysaccharide fromHaematococcuspluvialiswere optimized using an orthogonal array design. The best results were obtained after ultrasonic treatment at 400 W for 30 min at a solid-to-solvent ratio of 1∶25(g/mL),water bath temperature of 90 ℃ for 3 h.Under such conditions,the extraction yield of polysaccharides was 3.48%,which was approximately 27% higher than that obtained by hot water extraction alone. The results showed that ultrasonic treatment cooperated with hot water extraction is a potential effective way,and providing theoretical basis for in depth research ofHaematococcuspluvialispolysaccharide and for the development and application of residue.

Haematococcuspluvialis;polysaccharide;ultrasound-assisted extraction;orthogonal design

2016-03-23

張苗(1993-),女,在讀研究生,研究方向:食品化學及功能食品,E-mail:18819266900@163.com。

*通訊作者:劉曉娟(1980-),女,博士,副教授,研究方向:食品化學及功能食品,E-mail:liuxj@scau.edu.cn。

國家自然科學基金資助項目(31401481)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000