朝鮮族傳統米酒中的乳酸菌多樣性分析

苗乘源，鄭 琳，程雅韻，金 清，崔泰花

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

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朝鮮族傳統米酒中的乳酸菌多樣性分析

苗乘源，鄭 琳，程雅韻，金 清，崔泰花*

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

為了分析米酒中乳酸菌的多樣性，從2種朝鮮族傳統發酵米酒中利用平板稀釋法及菌落特征共分離出28株菌株，革蘭氏染色觀察形態后篩選出11株推定為乳酸菌菌株，再經SDS-PAGE電泳法分析篩選菌株的全細胞蛋白模式，將其劃分為2大類，經16s rRNA基因序列分析，確定為發酵乳桿菌，且在2種傳統發酵米酒中發酵乳桿菌均參與發酵。

米酒；乳酸菌；SDS-PAGE電泳；16s rRNA

朝鮮族傳統米酒是一種老少皆宜的低酒精度的發酵型飲料酒，其酒精含量一般為3%～14%，發酵的主要原料為糯米，經浸米、蒸米、糖化、發酵等工序釀制而成，富含葡萄糖、麥芽糖、氨基酸、維生素、有機酸、多糖等多種營養成分[1]。其米香濃郁，口感醇和，具有補血養顏、舒筋活絡、強身健體和延年益壽的功效[2]。在米酒發酵過程中，乳酸菌起到了關鍵作用。

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類能利用可發酵糖產生大量乳酸的無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。乳酸菌可分為18個屬，共有200多種[3,4],具有防治乳糖不耐癥、促進營養物質吸收、改善人體腸道菌群平衡、抑制腐敗菌生長、降血脂、降血壓的作用，同時還有增強人體免疫力、抗腫瘤、抗衰老等功能[4]。

因此，為了分析米酒中乳酸菌的分布及乳酸菌對米酒的影響，該試驗從朝鮮族傳統發酵米酒中按照乳酸菌的菌落特征初步分離篩選出乳酸菌，并運用革蘭氏染色觀察菌株形態進一步篩選乳酸菌,采用SDS-PAGE電泳法分析全細胞蛋白模式，根據蛋白質條帶特點對菌株進行歸類，最后經16s rRNA基因序列分析對歸類菌株進行鑒定。分析朝鮮族傳統米酒中乳酸菌的多樣性，對研究傳統發酵米酒中乳酸菌分布，從而進一步了解乳酸菌分布對米酒發酵特性的影響，為有益乳酸菌的利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

黑米米酒(由延吉市以勒公司提供)，善子米酒(由延吉市善子飯店提供)。

1.1.2 主要試劑

甘氨酸、丙烯酰胺、過硫酸銨、考馬斯亮藍、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘油、溴酚藍、四甲基乙二胺(TEMED)、2-巰基乙醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等試劑為Sigma公司產品，分子量標準蛋白為Promega公司產品，其他試劑均使用了分析純國產試劑。

1.1.3 主要儀器

PowerPac 3000電泳儀和3 Cell 電泳槽(美國伯樂公司)；超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司Scientz-ⅡD)；超凈工作臺(上海新苗醫療器械機械制造有限公司SW-CJ-1FD)；電熱恒溫培養箱(上海新苗醫療設備有限公司DNP-9082BS-Ⅲ)；數字酸度計(上海鵬順科學儀器有限公司PHS-3C)；超低溫冷凍箱(美國NUAIRE公司NU-9668E)；高壓蒸汽滅菌器(日本TOMY公司SX-700)。

1.1.4 培養基

乳酸菌的篩選和培養選用了添加溴甲酚紫的MRS培養基[5]。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的篩選與純化

采用平板稀釋法[6,7]。

取2種傳統發酵米酒樣液作為初始倍數菌液(100)，按10倍梯度遞增稀釋后均勻涂布于MRS固體培養基上，在37 ℃恒溫培養48 h后，挑取乳酸菌菌落特征明顯的單個菌落在MRS培養基中37 ℃純化培養24 h，并按照不同樣品、不同稀釋度進行編號(黑米米酒，善子米酒中所篩選出的菌株編號字母依次為J、K)。

1.2.2 乳酸菌菌種保藏

將已純化的乳酸菌菌種接種到1 mL MRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養24 h后,將菌株培養液0.7 mL與0.3 mL 50%甘油混合，在-80 ℃冷凍冰箱中保存備用[7]。

1.2.3 形態學鑒定

為觀察細菌形態,對篩選菌株進行革蘭氏染色[8]。

將純化菌種接種到MRS固體培養基上，37 ℃恒溫培養24 h。取生理鹽水1滴滴在載玻片上，用接種環取1個單一菌落溶于生理鹽水中，用火焰固定，草酸銨結晶紫染色2 min，碘液媒染2 min，95%酒精脫色30 s，蕃紅復染2 min，細水清洗干燥后，顯微鏡觀察菌體形態。

1.2.4 乳酸菌全細胞蛋白模式的分析

SDS-PAGE電泳法分析全細胞蛋白模式[9,10]。

將純化后的乳酸菌在液體MRS培養基中培養后離心,沉淀物用生理鹽水清洗、離心，得到菌體加入生理鹽水混勻后用細胞粉碎機破碎,破碎溶液為樣品作凝膠電泳實驗。凝膠濃度分別為分離膠12.5%、濃縮膠5%。分離電壓分別為分離膠140 mV、濃縮膠70 mV。 考馬斯亮藍R250染色1 h后用10%乙酸脫色至凝膠背景清晰。

1.2.5 菌種鑒定

利用16s rDNA 基因序列測定方法進行菌種鑒定。代表菌株在MRS液體培養基中培養后離心得到菌體。使用試劑盒提取菌體總DNA[11],總DNA為模板27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(TACCTTGTTACGACTT)為引物進行16s rDNA PCR擴增。所得到的擴增產物經純化后，由SolGent公司(韓國，大田)測定序列，經BLAST進行同源性分析鑒定到種。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌分離和純化

將收集到的2種米酒梯度稀釋后涂布在MRS固體培養基，挑選具有明顯乳酸菌菌落特征的菌株，共分離28株菌株，其中，黑米米酒中12株，善子米酒中16株。

2.2 革蘭氏染色結果

圖1為對黑米米酒、善子米酒中分離菌株進行革蘭氏染色后的顯微鏡觀察結果。結果表明，所分離的28株菌株中有11株具有乳酸菌形態特征，其中6株來自黑米米酒，5株來自善子米酒，11株菌株形態均呈桿狀。

圖1 黑米米酒(J)、善子米酒(K)中代表菌株革蘭氏染色 (10×100)

2.3 乳酸菌全細胞蛋白模式分析

根據SDS-PAGE電泳結果顯示的主要蛋白質條帶厚度、位置、間隙、數量以及分子量差異對菌株進行歸類，全細胞蛋白模式相同的菌株視為同類菌種[12]。由圖2可知，呈現乳酸菌形態的11株菌株主要為2大類型，具體劃分見表1。

圖2 SDS-PAGE電泳法分析的乳酸菌菌株的全細胞蛋白模式

2.4 菌種鑒定

對上述通過SDS-PAGE電泳法劃分的2大類乳酸菌代表菌株提取總DNA，以分別提取的總DNA為模板，PCR擴增16s rRNA基因片段后，對擴增產物序列進行分析，將所得到的基因序列在 GenBank 中同源序列搜索的結果見表1。由表1可知，代表菌株被鑒定為發酵乳桿菌，且具有較高的同源性(99%以上)。

表1 運用16s rRNA序列鑒定乳酸菌的種類

3 結論

本試驗運用平板稀釋法從2種傳統發酵米酒中分離出28株乳酸菌，經革蘭氏染色觀察形態后篩選出11株具有乳酸菌形態特征的菌株，利用SDS-PAGE電泳法對菌株全細胞蛋白模式進行分析后，11株菌株被劃分為2大類，最后對2大類的代表菌株16s rDNA基因序列進行分析， 11株菌株均被鑒定為發酵乳桿菌，且2種傳統發酵米酒的發酵過程均有發酵乳桿菌的參與。

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Diversity analysis of lactic acid bacteria in traditional Chinese-Korean rice wine

MIAO Chengyuan, ZHENG Lin, CHENG Yayun, JIN Qing, CUI Taihua*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,JilinYanji133002,China)

In order to investigate lactic acid bacterial diversity, 28 strains were isolated from the traditional Chinese-Korean rice wine based on the colony morphological characteristics using the dilution plating method. Among these, 11 strains screened out based on the gram staining were inferred as lactate acid bacteria and divided into 2 patterns by whole-cell protein pattern analysis using SDS-PAGE. By 16S rRNA gene sequencing, the strains screened were identified asLactobacillusfermentumparticipating in the fermentation of both traditional rice wines.

rice wine; lactic acid bacteria; SDS-PAGE electrophoresis; 16S rRNA

2015-12-09 基金項目：國家自然科學基金資助項目 (31260362)；延邊大學大學生創新創業訓練計劃項目(ydbksky2015249)

苗乘源(1993—)，女，吉林通化人，在讀學士，研究方向為食品微生物發酵。崔泰花為通信作者，

E-mail:Lich@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)03-0248-03

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.012

TS262.4

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