超聲波輔助酶法優化油茶粕蛋白的提取條件

◎曹海燕 桂 花 李維峰 陳小龍 王婭玲

超聲波輔助酶法優化油茶粕蛋白的提取條件

◎曹海燕 桂 花 李維峰 陳小龍 王婭玲

為提高油茶粕蛋白的提取率，先對油茶粕進行超聲波輔助、酶預處理，然后利用傳統堿提酸沉法進行提取。采用單因素和正交試驗選出最佳的超聲參數、酶條件并得出最佳提取工藝條件：超聲溫度50℃，超聲功率300W，超聲時間60min，纖維素酶添加量1.0%，酶解溫度50℃，酶解時間120min，料液比為1∶20（g/ml）pH為4.5。此條件下，油茶粕蛋白質的提取率可達80.83%。而未經超聲和酶處理蛋白質提取率僅為49.30%，表明此法可顯著提高油茶粕蛋白的提取率。

油茶粕也叫茶籽餅、茶麩、茶枯，呈紫褐色顆粒，是油茶籽經榨油后的渣餅，含有大量的活性物質如酚類、皂苷、多糖、黃酮、蛋白質等。由于茶粕的蛋白質含量較高，可作為高效有機肥，應用在農作物及果樹栽種中，效果極佳。

目前，提取油茶粕蛋白研究較多的是采用堿溶酸沉法或油茶籽先用酶預處理再采用堿溶酸沉法提取，都或多或少限制了油茶籽蛋白的利用。為提高油茶籽蛋白的提取率，先對油茶粕進行超聲波處理，再經酶處理，再利用傳統的堿溶酸沉法提取，為提高油茶粕蛋白的利用提供了參考依據。

材料和方法

材料與試劑

材料：茶粕來源于普洱云南淳普油脂有限公司，茶粕經干燥、粉碎、80目過篩等預處理備用。

試劑：無水乙醇、鹽酸、濃硫酸、硫酸銅、氫氧化鈉，均為分析純；活性炭；a-淀粉酶(活力單位2000～5000U／g)、纖維素酶(活力單位大于等于15000U／g)。

主要儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋(DSY-2.8)：浙江余姚工業儀表三廠；85.2型微型織物試樣粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；臺式離心機(TDL-5)：上海安亭科學儀器廠；TL-18M型臺式高速冷凍離心機：上海市安亭科學儀器廠；生化培養箱(PYX-280S. A)：寧波江南儀器有限公司；AB204-E型電子分析天平、pH計：Mettlertoledo，Switzerland；101-1-S型數顯鼓風干燥箱、101-1-S型真空干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；K9840型自動凱氏定氮儀、SH220型石墨消解儀、SOX406型脂肪測定儀：濟南海能儀器股份有限公司；DF-1型集熱式磁力攪拌器：常州市國華電器有限公司；FZ102型微型植物粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；CX-500型超聲波清洗機：北京醫療設備二廠。

試驗方法

原料預處理。油粕經70℃～80℃的烘箱中烘干，粉碎，過80目篩。稱取適量的上述茶粕粉末，加入10倍體積的70%乙醇溶液，以功率100W，超聲波輔助處理10min以去除茶皂素，抽濾，取渣，得到脫脂脫皂茶粕。

茶粕蛋白的提取方法。茶葉籽→去殼→去皮→粉碎→烘干(真空干燥)→過篩(80目)→脫脂(有機溶劑萃取)→脫溶→溶解(加水)→超聲波處理→酶處理→浸提(堿液)→離心(4000r／min，30min)→提取液(上清液)→調等電點→離心(4000r／min,20min)→沉淀→調至中性→冷凍干燥→茶葉籽蛋白

實驗經過超聲波處理、酶預處理后，又參考丁丹華等堿提酸沉工藝的較佳條件進行油茶粕蛋白的提取。

分析方法。粗蛋白含量的測定：微量凱氏定氮法，參照GB／T5009.5—2003；粗脂肪含量的測定：索氏抽提法，參照GB 5512—85；水分含量的測定：常壓烘干法，參照GB／T 3543．6一1995；粗纖維的測定：參照GB 5514—85；灰分的測定：參照GB／T 8307—2002；還原糖的測定3，5一二硝基水楊酸法，參考GB／T 5513—85。

蛋白質提取率。采用凱氏定氮法測定蛋白質含量。

蛋白質提取率=(干燥后茶粕蛋白中蛋白質含量／原料中蛋白質含量)×100%。

油茶籽粕蛋白等電點的測定。稱取10g樣品，料液比為1∶20,用NaOH調pH至10,溫度30℃磁力攪拌浸提1h。離心（3000r/min，20min）取上清液,分別取上清液7份各10mL,加鹽酸調pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,離心（3000r/ min，20min),棄上清液后稱重,重復一次，繪出沉淀量與pH值的曲線圖,圖1中沉淀量最大時的pH為蛋白質等電點。

試驗設計方案

采用單因素和正交試驗選出最佳的提取參數，以堿浸提液pH、浸提溫度、浸提時間、超聲頻率、酶用量、酶解溫度、酶解時間、液料比為變量因素，以茶葉籽蛋白提取率為評價指標．優化超聲波輔助提取茶葉籽蛋白的工藝條件。

結果與分析

油茶籽粕蛋白等電點測定

油茶籽餅粕蛋白等電點結果見圖1。

加酸至等電點是從提取液中分離蛋白的最簡便方法，它能確保提取液中蛋白質最大量的沉淀。因此，等電點的選擇是關鍵步驟。由圖1可知，油茶籽粕蛋白的沉淀量在pH為4.5時最大，故油茶籽蛋白提取最佳等電點為4.5。

超聲處理條件對蛋白質提取率的影響

超聲溫度對油茶籽蛋白提取率的影響。將過80目篩的脫脂粕取等量，按料液比

1∶20、pH10、超聲時間60min、超聲功率300W，考察超聲溫度對油茶籽蛋白提取率由圖2可知，超聲溫度為50℃時，油茶籽提取率最大。因為超聲溫度低于50℃時，分子擴散運動小，油茶籽粕中的蛋白質與溶劑的相互作用不夠完全，從而降低了油茶籽蛋白提取率；而溫度高于50℃后，由于物料略有糊化，且部分蛋白質發生局部變性可能使得油茶籽蛋白提取率降低，故選擇超聲波處理溫度為50℃。

超聲時間對油茶籽蛋白提取率的影響。將80目篩的脫脂粕取等量，在料液比1∶20、pH10、超聲溫度50℃、超聲功率300W的條件下，考察超聲時間對油茶籽蛋白提取率的影響，結果見圖3。

由圖3可知，一開始油茶籽蛋白提取率隨時間的增加而增大，當超聲波處理時間為60min時，達到最大值，之后隨時間的延長得率逐漸下降。這是由于在前60min內超聲波對細胞膜的破碎作用較強，蛋白溶出物增多，得率不斷升高；而60min后內蛋白質得率下降，這可能是因為隨著超聲時間的增加，溫度急劇升高，導致蛋白質分解或變性所致，故超聲波處理時間選擇60min。

超聲功率對油茶籽蛋白提取率的影響。將過80目篩的脫脂粕取等量，按料液比1∶20、pH10、超聲溫度50℃、超聲時間60min，考察超聲功率對油茶籽蛋白提取率的影響，結果見圖4。

由圖4可知，起初油茶籽蛋白提取率隨著超聲功率的增大而逐漸增大，在300W時達到最大值，之后蛋白提取率下降，這可能是超聲波功率未達到300W前對細胞的空化作用逐漸增大，導致細胞破壁更充分，蛋白分離出來，到達300W后，油脂又和蛋白結合，導致蛋白提取率下降，所以選擇超聲波處理功率300W。

纖維素酶預處理條件對茶粕蛋白質提取的影響

纖維素酶添加量的確定。稱取一定量的脫脂脫皂茶粕，過80目篩后平均分為3份。設定預處理溫度為50℃，時間為9.0h，纖維素酶添加量分別為0.1%、0.4%、0.7%、1.0%、1.3%。測定茶粕蛋白質含量并計算蛋白質提取率確定合適的加酶量范圍。提取結果見圖5。

結果表明，隨著加酶量的增加，蛋白質提取率也不斷增大；加酶量在0.4%至0.7%區域，蛋白質提取率增幅較小并略有降低；加酶量在0.1%至0.4%和0.7%至1.0%區域，蛋白質提取率增福最大，但加酶量在0.1%時，蛋白質提取率最高，達74.2%；加酶量為1.0%至1.3%區域，蛋白質提取率增福平緩。經酶處理后的蛋白質提取率比不加酶時的提取率(49.30%)明顯增加。最后,考慮到成本等因素,纖維素酶1.0%。

酶解時間的確定。在淀粉酶2.0%、纖維素酶1%，酶解溫度50℃，pH5條件下對茶粕處理，酶解時間分別為30、60、90、120、150min，酶滅活后按較佳堿提工藝對茶粕蛋白提取，提取結果見圖6。

由圖6可知，隨著時間的延長，蛋白質提取率相應提高。酶解時間為30min時，茶粕蛋白提取率在62.5%，酶解時間為150min時，茶粕蛋白提取率在76.5%。酶解時間為120min時，茶粕蛋白提取率趨于平穩。但考慮到節約能源等因素，酶預處理茶粕蛋白時間為120min。

酶解溫度的確定。淀粉酶添加量2.0%、纖維素酶添加量1%，酶解時間120min，pH為5條件下對茶粕蛋白預處理，酶解溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，酶滅活后按較佳堿提工藝對茶粕蛋白提取，提取結果見圖7。

由圖7可知，溫度對蛋白質提取有較大影響。蛋白質提取率在溫度30℃至40℃范圍內不斷升高，40℃至50℃范圍內變化不大，當溫度超過50℃時，蛋白質提取率開始下降，可能由于高溫使酶蛋白變性失活所致，所以在提取茶粕蛋白時選取50℃為最適溫度。

pH的確定。在淀粉酶添加量2.0%、纖維素酶添加量1%，料液比1∶20，酶解溫度50℃，酶解時間120min的條件下對茶粕預處理，pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，酶滅活后按較佳提取工藝對油茶粕蛋白提取，提取結果見圖8。

由圖8可知，隨著pH值的變化，茶粕蛋白的提取率變化較大.在pH4.5時，提取率達到最大值，為77.40%。在pH5.0時，油茶粕蛋白的提取率為73.10%。此后，隨著pH值的增加，提取率繼續下降,但下降緩慢。所以在提取茶粕蛋白時選擇酶預處理的pH值為4.5。

討論

對于提取油茶粕蛋白，報道最多是酶預處理方法的研究，實驗采用超聲波輔助，酶預處理后，再采用傳統的堿溶酸沉法提取。超聲輔助酶預處理后再結合堿溶酸沉法提取油茶籽粕蛋白，與傳統的堿溶酸沉法相比，具有提取時間更短、提取溫度更低、油茶籽蛋白提取率更高等優點。

結論。油茶籽粕蛋白的等電點pH值為4.5時，此時蛋白質的沉淀量最大。采用超聲波輔助，酶預處理油茶籽粕的最佳條件為：超聲波處理溫度為50℃,超聲處理時間60min，超聲波處理功率為300W，料液比1∶20，纖維素酶1.0%，酶預處理時間為120min，酶解溫度50℃，酶預處理的pH值為4.5，在此條件下，按照堿溶酸沉法提取油茶籽粕蛋白，蛋白質的提取率可達80.83%。實驗結果表明，采用傳統的堿溶酸沉法再結合超聲輔助和酶預處理，能夠從油茶籽粕中獲得較高提取率的油茶籽蛋白。這對于油茶籽蛋白的產品開發具有重要的指導意義。

(作者單位：云南農業大學熱帶作物學院熱帶作物與食品工程系)