PKCβ／p66Shc介導高尿素引起的人臍靜脈內皮細胞　ROS的產生

何菲，樊春華，郭珮，王弘凱，周宏宇，陳益，李晉芳，冉建華*

（重慶醫科大學1基礎醫學院解剖學教研室，2神經科學研究中心，3附屬第二醫院神經內科，重慶 400016）

論 著

PKCβ／p66Shc介導高尿素引起的人臍靜脈內皮細胞ROS的產生

何菲1，2，樊春華1，2，郭珮1，2，王弘凱1，2，周宏宇1，2，陳益1，2，李晉芳3，冉建華1，2*

（重慶醫科大學1基礎醫學院解剖學教研室，2神經科學研究中心，3附屬第二醫院神經內科，重慶 400016）

目的 探討PKCβ／p66Shc通路在高濃度尿素引起的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產生中的作用。方法 體外培養HUVECs，分為正常對照組、甘露醇組、尿素組和尿素＋LY333531（PKCβ抑制劑）組。采用CCK8法檢測高濃度尿素對細胞活性的影響，倒置顯微鏡觀察細胞形態改變；DCFH-DA法檢測細胞內ROS含量；Western blot檢測細胞中p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平；免疫熒光技術觀察細胞內p-p66Shc水平。結果 25mmol／L尿素明顯抑制HUVECs活力，并引起細胞排列紊亂、細胞間隙增大、鋪路石樣排列結構受到破壞等形態學改變。與對照組相比，25mmol／L尿素引起細胞內ROS水平明顯升高，在6h達到峰值；加入PKCβ抑制劑LY333531后ROS水平明顯降低。Western blot結果顯示，25mmol／L尿素誘導p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平隨作用時間的延長而逐漸增加。25mmol／L尿素負荷6h后可見細胞胞質內p-p66Shc免疫反應性明顯增強，LY333531可阻斷該作用；Western blot檢測也顯示LY333531可顯著抑制高濃度尿素對p-p66Shc水平的上調。結論 PKCβ／p66Shc信號通路是高濃度尿素誘導HUVECs內ROS產生的重要途徑。

尿素；人臍靜脈內皮細胞；PKCβ／p66Shc；活性氧簇

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）患者最常見的并發癥和最主要的死亡原因，其致死率比其他并發癥高10～20倍［1］；而ESRD并發CVD中以動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）多見。與普通人群不同，ESRD患者并發AS具有發病率高、發病年齡早、病變累及廣等特點，并以氧化應激和炎癥反應為主要病理改變，但目前的病理機制尚不清楚。近年來的研究證實，高濃度尿素可誘導多種細胞中活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的大量產生，造成蛋白質氧化、脂質過氧化及DNA損傷，是導致慢性腎衰竭氧化應激（oxidative stress）、胰島素抵抗等多種病理改變的重要致病因素［2，3］。我們前期研究也證實了高濃度尿素誘導人腦內皮細胞炎癥反應的產生［4］。眾所周知，氧化應激可促進炎癥反應的發生，而ROS產生過多是導致氧化應激發生的主要因素。那么，ESRD患者體內的高尿素水平是否通過 ROS大量產生介導血管內皮氧化應激及后續炎癥反應的發生，其具體機制如何都不清楚。p66Shc是調控細胞氧化應激的關鍵蛋白，磷酸化的p66Shc通過轉位進入線粒體介導產生的ROS在誘導細胞氧化損傷中發揮重要作用［5-8］。研究報道，高血糖、高血脂、高濃度酒精等可通過激活PKCβ，進而導致p66Shc蛋白磷酸化及其線粒體轉位，引起ROS過量產生和氧化應激的發生［9-11］。目前PKCβ／p66Shc通路在高濃度尿素誘導內皮細胞氧化應激中的作用尚未見報道。因此，本研究采用高濃度尿素負荷HUVECs細胞，觀察細胞活性、形態的改變以及ROS的產生，檢測PKCβ／p66Shc通路在ROS產生過程中的改變，為闡明ESRD患者并發AS的病理機制提供實驗基礎。

材料和方法

1 主要試劑

人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）由重慶醫科大學神經科學研究中心實驗室提供。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Excell公司）；1640培養基（Gbico公司）；胰酶細胞消化液（碧云天生物技術有限公司）；青-鏈霉素溶液（100 X）（碧云天公司）；DMSO、甘露醇（Sigma公司）；尿素（Solaibao生物技術公司）；活性氧測定試劑盒（貝博生物有限公司）；RIPA裂解液（碧云天生物技術有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司）；ECL化學發光試劑盒（Milipore公司）；PVDF膜（Milipore公司）；β-actin抗體（博士德公司）；p66Shc和p-p66Shc抗體（Santa公司）；PKCβ和 p-PKCβ抗體（abcam公司）；PKCβ抑制劑LY333531（Santa公司）；Alexa Fluor 488標記的羊抗兔IgG（H＋L）（碧云天公司）；辣根過氧化物酶二抗（Santa公司）。

2 人臍靜脈內皮細胞株培養

HUVECs復蘇后，加入含10%FBS和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養液，在孵育箱中以37℃、5% CO2的飽和濕度進行培養。每兩天換液一次，待其達對數生長期時，以胰蛋白酶消化細胞并傳代培養或進行相應的實驗分組。

3 尿素對細胞活性影響的CCK8檢測

取對數期的HUVECs經胰酶消化后，細胞計數后制成細胞懸液（約1×105個／ml），種于96孔板中，每孔加入含10%FBS的培養液0.1ml，放入37℃、5%CO2環境中培養24h后，加入不同濃度（0、3.125、6.25、12.5、25、100、200mmol／L）的尿素，每種濃度設3個復孔，置于培養箱中孵育24h。然后向每個孔中加入10μl CCK-8溶液，在37℃、5%CO2培養箱中繼續孵育2h后，用酶標儀測定其在450nm（A450值）的吸光度值。用下列公式計算 HUVECs細胞活力抑制率（IR）∶IR（%）＝［（對照組A值實驗組A值）／（對照組A值-空白組A值）］×100%。

4 活性氧測定

以25mmol／L尿素在不同時間點干預HUVECs后，按照ROS檢測試劑盒說明書進行操作，用DCFH-DA探針孵育30min后用0.01mol／L的PBS洗3次，再置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。鏡下的熒光強度越高代表ROS的產生越多，反之則越少。

5 免疫熒光技術檢測p-p66Shc的表達

HUVEC細胞培養后，待細胞增殖至70%～80%后，用胰蛋白酶消化并制成細胞懸液，然后接種于12孔板的蓋玻片上，培養24h后進行分組。進行相應的干預后用0.01mol／L的PBS洗3次，每次5min，4%多聚甲醛37℃固定30min，然后用0.01mol／L的PBS洗3次，每次5min；加入0.2%Triton X-100室溫孵育15min，PBS洗滌后，加入含10%的馬血清于37℃封閉30min。然后加入一抗（陰性對照以PBS代替一抗），4℃過夜。第2天用PBS洗3次，每次10min，然后避光滴加熒光二抗（1∶200）于37℃孵育1h。DAPI染核5min后PBS洗3次，每次10min，用防猝滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖片。

6 Western blot檢測細胞內p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平

培養的HUVEC按實驗要求干預后收集細胞。加細胞裂解液冰上裂解30min，4℃低溫離心機、12000r／min離心20min后，上清即為細胞總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度。以10%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳進行蛋白分離，電泳結束后將蛋白電轉至PVDF膜，于37℃用5%BSA封閉2h，加入一抗（均為1∶1000），4℃孵育過夜。次日TBST洗膜3次，每次15min，再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗鼠抗體 IgG（1∶10000）37℃雜交1h，TBST洗膜3次，每次20min；ECL顯色液顯色，Image Lab Tool機器曝光。Image Lab Tool分析軟件對目的條帶進行灰度值分析，實驗重復3次。

7 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件系統處理實驗數據。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩樣本均數的比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

結　果

1 高濃度尿素抑制HUVECs活力

為了明確尿素對細胞活力的影響，應用CCK-8法檢測不同濃度尿素負荷24h后細胞抑制率。結果顯示，細胞的抑制率隨尿素濃度的升高呈逐漸上升的趨勢，25mmol／L及更高濃度的尿素對細胞的活性有明顯的抑制作用（圖1）。

圖1　不同濃度的尿素負荷對　HUVECs活力的影響；*，與0mmol／L組相比，0.01＜P＜0.05（n＝3）Fig.1　Effects of different concentrations of urea on HUVECs viability；*，0.01＜P＜0.05，compared with the 0 mmol／L group（n＝3）

2 高濃度尿素負荷對HUVECs形態的影響

為了明確25mmol／L尿素是否引起HUVECs形態的變化，用倒置顯微鏡觀察25mmol／L負荷 24h對HUVECs形態的影響。結果顯示，未負荷尿素的HUVECs為短梭形或小三角形，單層貼壁生長，呈鋪路石樣鑲嵌排列（圖2A）。以25mmol／L尿素負荷24h后，細胞間隙明顯增大，細胞體積變小，排列較為紊亂，典型的鋪路石樣鑲嵌排列方式消失（圖2B）。

3 高濃度尿素誘導HUVECs中ROS的產生

為了明確25mmol／L尿素負荷 HUVECs后可通過產生ROS來引起細胞損傷，用熒光倒置顯微鏡觀察25mmol／L尿素負荷HUVECs 0h、1h、3h和12h后ROS產生情況。以甘露醇組（25mmol／L）作為滲透壓對照，以排除滲透壓對ROS產生的影響。結果顯示，12h內甘露醇組中均未見綠色熒光表達，排除了滲透壓的改變會引起ROS的產生；尿素負荷HUVECs細胞1h后，細胞內熒光強度明顯增加，并隨時間延長而增高，在6h熒光強度達到峰值（圖3）。

4 PKCβ抑制劑減少高濃度尿素誘導的HUVECs中ROS的產生

為了驗證HUVECs中PKCβ是否參與尿素誘導的ROS的產生，應用PKCβ抑制劑LY333531（10μmol／L）預培養HUVECs 2h后，再負荷尿素6h，用DCFH-DA方法檢測細胞內ROS的改變。熒光倒置顯微鏡可見，與對照組相比，負荷尿素的細胞內綠色熒光強度較未負荷尿素的對照細胞明顯增強，而用LY333531預孵育再負荷尿素的細胞，其綠色熒光強度明顯低于單純尿素負荷細胞，但仍高于未負荷尿素的對照細胞（圖4）。

5 高濃度尿素激活PKCβ／p66Shc信號通路

為了證明高濃度尿素是否激活PKCβ／p66Shc信號通路，應用Western blot檢測了25mmol／L尿素負荷HUVECs、0h、3h、6h、12h、24h后 PKCβ、p-PKCβ、p66Shc和p-p66Shc水平的變化。結果顯示，隨著尿素負荷HUVECs的時間延長，p66Shc、pp66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平均呈逐漸上升趨勢（圖5），提示高濃度尿素可激活PKCβ／p66Shc信號通路。

6 LY333531抑制高濃度尿素對HUVECs中pp66Shc水平的上調

為了進一步明確PKCβ是否為p66Shc的上游信號分子，用免疫熒光染色和Western blot檢測了LY333531是否阻斷25mmol／L尿素負荷上調HUVECs內p-p66Shc的作用。免疫熒光檢測顯示，HUVECs負荷25mmol／L尿素6h后，p-p66Shc免疫反應性（綠色熒光強度）明顯增強，即p66Shc磷酸化水平明顯升高（圖6A）；而用LY333531預孵育后的HUVECs內p-p66Shc免疫反應性在負荷尿素后不再明顯增強（圖6A）。Western blot檢測顯示，加入LY333531預孵育的HUVECs內p-p66Shc水平明顯低于未用LY333531預孵育的HUVECs（圖6B）。由此表明，PKCβ抑制劑可顯著抑制高濃度尿素誘導的HUVECs中p66Shc蛋白的磷酸化水平上調，提示PKCβ是P66shc的上游信號分子。

圖2　尿素負荷前后人臍靜脈內皮細胞的形態。A，正常的人臍靜脈內皮細胞；B，尿素負荷24h后的人臍靜脈內皮細胞；比例尺，100μmFig.2　Morphology of HUVECs before and after urea loading.A，normal HUVECs；B，HUVECs after 24h urea loading；scale bar，100 μm

圖3　高濃度尿素誘導HUVECs ROS的產生。A，尿素和甘露醇負荷HUVECs后ROS產生的變化；比例尺，100μm；B，相對熒光強度統計學分析；與0h組相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n＝3Fig.3　ROS produced in HUVECs induced by high concentration urea.A，change of ROS production in HUVECs after urea treatment and mannitol treatment.Scale bar，100 μm；B，statistical analysis of the relative fluorescence intensity；compared with the 0h group；*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n＝3

圖4　PKCβ抑制劑對尿素誘導HUVECs ROS產生的影響。A，DCFH-DA法檢測HUVECs中ROS；比例尺，100μm；B，DCFH-DA法檢測HUVECs中ROS的統計學分析；與對照組相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；＃，與尿素組比較，0.01＜P＜0.05；n＝3Fig.4　Effect of PKCβ inhibitor on ROS production induced by urea in HUVECs.A，DCFH-DA detection of ROS production in HUVECs，scale bar，100 μm；B，statistical analysis of ROS production detected by DCFH-DA in HUVECs；compared with the control group：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；＃，compared with the urea group，0.01＜P＜0.05；n＝3

圖5　高濃度尿素對 HUVECs中p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平的影響。A，p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ的Western blot檢測；B，p66Shc／p-p66Shc和PKCβ／p-PKCβ Western blot檢測的統計學分析，與0h組相比：*，0.01＜P＜0.05；n＝3Fig.5　Effect of high concentration urea on the levels of p66Shc，p-p66Shc，PKCβ and p-PKCβ in HUVECs.A，Western blot detection of p66Shc，pp66Shc，PKC and p-PKC；B，statistical analysis of p66Shc／p-p66Shc；C，statistical analysis of PKCβ／p-PKCβ；*，0.01＜P＜0.05，compared with the 0h group；n＝3

圖6　PKCβ抑制劑對高濃尿素上調HUVECs中p-p66Shc水平作用的影響；A，HUVECs中p-p66Shc水平的免疫熒光檢測；比例尺，50 μm；B，HUVECs中p-p66Shc水平的 Western blot檢測；*，與尿素組相比：0.01＜P＜0.05；n＝3Fig.6　Effect of PKCβ inhibitor on urea-induced up-regulation of p-p66Shc level in HUVECs.A，immunofluorescent detection of the level of p-p66Shc in HUVECs；scale bar，50 μm；B，Western blot detection of the level of p-p66Shc in HUVECs；*，0.01＜P＜0.05，compared with the urea group；n＝3

討　論

尿素是體內氮質潴留的主要形式。盡管尿素本身相對無毒，但目前的研究發現，高濃度的尿素可引發ROS大量產生，通過氧化應激導致腎髓質細胞損傷、胰島素抵抗等多種病理改變的發生［12］。正常人體內尿素水平約為 5mmol／L，而ESRD患者血漿尿素水平可升至80mmol／l；心血管系統作為尿素運輸的主要途徑，高濃度的尿素可能直接作用于血管內皮，引起細胞損傷而觸發動脈粥樣硬化的發生發展。本實驗通過細胞活性檢測發現，25mmol／L尿素能明顯的抑制HUVECs活力，并可引起細胞數量減少，出現細胞間隙增大、排列紊亂等形態學改變，證實了高濃度尿素卻可引起血管內皮細胞的損傷。

活性氧是指含有氧分子的自由基，包括超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基、烷氧基和O2衍生的原子種類。生理條件下的活性氧作為重要的信號分子參與了體內多種生理活動的調控；而異常堆積的ROS可能會導致脂質過氧化和DNA的損傷，引起細胞或組織的損傷［13］。本研究中，對照組和25mmol／L甘露醇組未見ROS產生，采用甘露醇組作對照排除了滲透壓改變引起ROS產生的可能；25mmol／L尿素引起HUVECs細胞內ROS水平隨時間延長明顯升高，6 h達到峰值，但12 h仍高于對照組，這可能與后期線粒體內抗氧化系統的激活有關，與臨床報道ESRD患者體內ROS水平的結果相符［14］。因此，高濃度尿素誘導ROS產生的機制是值得探討的問題。

線粒體是ROS產生的主要場所。在高血糖、腫瘤等不同病理因素刺激下，p66Shc（銜接蛋白SHC的一個亞型）在ROS產生過程中具有關鍵作用，其通過S36位點的磷酸化引起蛋白由胞漿轉位進入線粒體，氧化細胞色素C而誘導ROS大量產生及氧化應激的發生。本研究采用25mmol／L尿素負荷 HUVECs后，出現胞漿內p66Shc的磷酸化表達上調，提示高濃度尿素可能通過p66Shc引起線粒體ROS的產生。

蛋白激酶C（PKC）作為一種鈣磷脂依賴性磷酸化酶，是應激狀態下細胞生理功能的主要調節器，其因同工酶結構、特性以及激活劑的不同大致分為4類，PKCβ是其中的一個亞型。PKCβ作為p66Shc上游的信號分子在多種病理生理過程中發揮作用。氧化型低密度脂蛋白可通過PKCβ激活p66Shc促進內皮的吸收，導致動脈粥樣硬化的發生［15］。在小腸缺血再灌注損傷中，PKCβ抑制劑LY333531可抑制p66Shc的磷酸化以及隨后的線粒體易位氧化細胞色素C等病理過程，從而緩解缺血再灌注引起的氧化應激和細胞凋亡［16］，而PKCβ／p66Shc信號通路在高濃度尿素引起HUVECs損傷的過程中的作用還未見報道。本研究PKCβ抑制劑LY333531可明顯阻斷高濃度尿素上調HUVECs內p66Shc磷酸化水平的作用，提示PKCβ是p66Shc的上游信號分子，調控其表達水平及磷酸化過程可影響尿素誘導HUVECs細胞ROS的產生。

我們的研究表明，高濃度尿素可能通過激活PKCβ，增加p66Shc蛋白水平及磷酸化水平，經p66Shc線粒體轉位而誘導ROS的大量產生和氧化應激的發生，引起HUVECs細胞損傷。而高濃度尿素誘導的氧化應激是否引起后續的炎癥反應及其機制還需要進一步的研究。

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《中國組織化學與細胞化學雜志》編輯部2016年10月

PKCβ／p66Shc pathway mediates the production of ROS induced by high concentration urea in human umbilical vein endothelial cells

He Fei1,2,Fan Chunhua1,2,Guo Pei1,2,Wang Hongkai1,2,Zhou Hongyu1,2,Chen Yi1,2,Li Jinfang3,Ran Jianhua1,2*
（1Department of Anatomy，College of Basic Medicine，2Neuroscience Research Center，3Department of Neurology，the 2nd Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing，400016，China）

Objective To investigate the role of PKCβ／p66Shc pathway in the production of reactive oxygen species(ROS)in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)treated with urea.Methods HUVECs cultured in vitro were randomly divided into normal control group,mannitol group,urea group,and urea＋LY333531(PKCβ inhibitor)group.The activities and morphological changes of the cells treated with high concentration urea were detected by the CCK 8 assay and observed under an inverted microscope. ROS content was measured by DCFH-DA method.The levels of p66Shc,p-p66Shc,PKCβ and p-PKCβ were detected by Western blot.Immunofluorescence assay was used to observe the level of p-p66Shc in the HUVECs.Results The vitality of HUVECs in culture was inhibited greatly by urea at the concentration of 25 mmol／L with morphological changes including disordered arrangement,enlarged cell gap and destructive cobblestone appearance.Compared with the control group,the fluorescence intensity of ROS in the cytoplasm was enhanced significantly in HUVECs treated with 25 mmol／L urea and reached peak at 6h treatment,while decreased obviously with the addition of PKCβ inhibitor LY333531.Western blot results showed the levels of p66Shc,p-p66Shc,PKCβ and p-PKCβ were increased by by 25mmol／L urea treatment,and enhanced gradually with time extension.The immunoreactivity of p-p66Shc in the cytoplasm increased significantly after 6h of 25 mmol／L urea treatment,and LY333531 could block this effect；western blot results also showed that increased expression of p-p66Shc induced by high concentration of urea was inhibited by LY333531.Conclusion PKCβ／p66Shc signaling pathway plays an important role in the excessive production of ROS in HUVECs treated with high concentration urea.

Urea；HUVECs；PKCβ／p66Shc；ROS

R363.1

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.001

2016-07-28

2016-10-09

重慶市科技計劃項目（cstc2015jcyjA10036）；重慶市衛生局項目（2012-1-038）；重慶市教委項目（KJ120330，KJ120314）；重慶醫科大學大學生科學研究與創新實驗項目（201403，201609）；國家（市）級大學生創新創業訓練計劃項目（201410631003）

何菲，女（1990年），漢族，碩士研究生

（To whom correspondence should be addressed）：ranjianhua＠cqmu.edu.cn