定量蛋白質組學在動物睪丸蛋白研究中的應用進展

盧曾奎馬友記，2

（1. 甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070；2. 甘肅肉羊繁育生物技術工程實驗室，民勤 733300）

定量蛋白質組學在動物睪丸蛋白研究中的應用進展

盧曾奎1馬友記1，2

（1. 甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070；2. 甘肅肉羊繁育生物技術工程實驗室，民勤 733300）

蛋白質組學是后基因時代重要的研究領域之一。而定量蛋白質組學是蛋白質組學研究的主要方法之一，可以反映蛋白質的動態本質。睪丸作為雄性動物重要的生殖器官，具有產生精子和分泌雄激素的功能。因此，應用蛋白質組學方法來探索睪丸中蛋白質的組成具有重要意義。就定量蛋白質組學的概念、研究技術手段及其在動物睪丸發育、疾病和各種應激條件下等方面的應用進行綜述，旨在為睪丸蛋白質的進一步研究提供參考。

定量蛋白質組學；睪丸；動物；進展

睪丸是雄性動物的主要生殖器官，具有產生精子、分泌雄激素等功能。精子發生即精子形態的變化，該過程是在睪丸曲精細管內進行的，包括精原干細胞的增殖和分化、精母細胞的減數分裂、精子形成和精子釋放等過程［1］。睪丸內分泌水平變化主要指雄激素的變化，雄激素由睪丸間質細胞產生，對維持精子發生和副性腺發育作用重大。精子發生和雄激素分泌相互作用，共同影響雄性動物生殖生理過程。目前，對雄性生殖生理的研究主要集中在精液品質測定、睪丸組織學、睪丸組織基因的克隆與表達以及睪丸中激素分泌水平等［2-5］。這些研究只能反映睪丸組織形態結構和基因、轉錄水平，而不能反映蛋白質翻譯水平、翻譯后的修飾以及蛋白質間的相互作用等多個水平上的調控。因此，從蛋白質水平研究睪丸發育、雄性生殖疾病和睪丸應對刺激等具有十分重要的意義。

1 定量蛋白質組學及技術手段

蛋白質組（proteome）的概念是1994年澳大利亞的兩位學者首先提出的，指生物體中所有蛋白質的組成和活動方式［6］。由于生物體中大多數活動是動態的，蛋白質組研究并不能完全了解蛋白質對生物體的功能。隨著后基因組時代的到來，研究人員提出了蛋白質組學（proteomics）的概念。蛋白質組學指從整體水平上研究機體或細胞內動態變化的蛋白質組成、表達水平及翻譯后的修飾，進而研究蛋白質之間的相互作用。

定量蛋白質組學（quantitative proteomics）是對生物體復雜組織或體液中所有蛋白質進行鑒定，并對蛋白質的量及量的變化進行準確的測定。根據技術手段不同，將定量蛋白質組學分為基于凝膠和質譜兩大類，共5種不同方法，即雙向電泳法（twodimensional electrophoresis，2-DE）、熒光差異凝膠電泳（differential in-gel electrophoresis，DIGE）、非標記定量蛋白質組學（lable free）、標記定量蛋白質組/穩定同位素標記技術（isobaric tags for relative and absolute quantitation/Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，iTRAQ/SILAC）和質譜選擇反應監測/多反應監測技術（selective reaction monitoring/Multi reaction monitoring，SRM/MRM）。這些方法各具優缺點（表1），可根據需要選擇合適的方法。定量蛋白質組學技術已經在動物疾病、動物發育、肉品質、乳品質和蛋品質等畜牧獸醫研究中廣泛應用［7-11］，但有關睪丸蛋白質組學的研究相對較少。因此，深入了解和闡明睪丸發育、病理狀態下及應激狀態下蛋白質的變化至關重要。

表1 定量蛋白質組學各種方法的比較

定量蛋白質組學研究主要依賴于蛋白質分離、質譜和生物信息學這三大技術。蛋白質分離技術中的2-DE技術是O’Farrell’s于1975年首次提出并建立，也是目前最常使用的技術［12-14］。但是2-DE技術存在重復性差、靈敏度低和耗時長等缺點。針對這些缺點，后來發展起來的DIGE、Lable free、iTRAQ/SILAC和SRM/MRM等技術重復性好、操作簡單和勞動強度小。質譜技術的出現為蛋白質鑒定起到了支撐作用［15，16］。目前質譜技術主要有點噴霧離子化質譜（electrospray ionizationmass spectrometry，ESI-MS）和基質輔助的激光解吸電離飛行時間質譜（matrix assisted laser-desorption ionization-mass spectrometry，MAL-DI-MS）。 這2種技術具有高靈敏度、高通量和高質量的檢測范圍，從一定程度上促進了蛋白質組學的發展［17］。蛋白質生物信息學分析主要包括數據庫的查閱和生物信息學軟件在蛋白質組學研究中的應用。其中，GO分析（gene ontology）、通路分析（KEGG pathway）和蛋白質相互作用分析（STRING network）是目前蛋白質組學研究中最常用的生物信息學分析方法。

2 定量蛋白質組學在動物睪丸發育研究中的應用

對于雄性動物而言，睪丸的正常結構和正常生理機能是繁殖活動的基礎。隨著蛋白質組學的出現，研究人員將其應用到睪丸發育的研究中，并為睪丸發育的研究提供可靠的技術支撐，1997年，Cossio等［18］首次應用2-DE技術分離了大鼠（Rattus norvegicus）睪丸的蛋白質，之后Witzmann等［19］應用同樣的方法分離了牛（Bos taurus）睪丸的蛋白質，二者均只得到了一張蛋白質分布圖，沒有對其進行質譜鑒定和生物信息學分析。2003年，朱葉飛等［20］應用2-DE和質譜技術對成年雄性小鼠（Mus musculus）睪丸總蛋白質進行研究，從圖譜中共分離出1 621個蛋白點，成功鑒定出血清白蛋白和蛋白質二硫化物異構酶2種蛋白質，雖然鑒定出的蛋白質較

少，但是肯定了蛋白質組學技術在動物睪丸發育研究中的可行性。Huang等［21］應用2-DE技術對1歲左右的杜洛克公豬（Sus scrofa）睪丸蛋白質進行研究，通過質譜鑒定出447個蛋白點對應于337種蛋白質并提交于NCBI數據庫，為豬睪丸發育生物學和病理學研究提供了重要理論數據。Paz等［22］應用2-DE技術研究了第8、18、45日齡小鼠睪丸蛋白質表達的差異，3個發育階段的睪丸蛋白質存在顯著變化，最終鑒定出44種蛋白質，這些蛋白質主要與抗氧化和氧化還原反應相關，主要包括脂類和碳水化合物代謝等途徑。同年霍然［23］應用2-DE技術首次研究了正常人（Homo sapiens）睪丸的蛋白質組成并建立了人睪丸蛋白質數據庫，之后通過質譜技術成功鑒定出541種蛋白質，生物信息學分析發現80%的蛋白質參與了代謝過程，并發現糖酵解通路和精氨酸代謝通路對睪丸發育具有重要作用。Li等［24］利用同樣的方法進一步對已證明可育的正常人睪丸蛋白質組成進行分析，從1 920個蛋白點中發現725種特殊蛋白質，并建立了相應的抗體庫。其中240種蛋白為精液蛋白，167種蛋白存在于成熟精子中。利用免疫組織化學方法對319種精子蛋白或精子附著蛋白進行定位，47%的蛋白為精子固有蛋白，23%蛋白為外部蛋白，可能源于附睪或成熟過程中蛋白的黏附。盡管525種精液蛋白中有408種蛋白已被鑒定為附睪豐富表達蛋白，但其余的22%的蛋白更像是睪丸蛋白而非附睪蛋白。對精液、睪丸、精子和精子黏著蛋白的鑒定，有利于加深對精子成熟過程產物以及功能形成的探索。Huang等［25］探討了豬出生后睪丸發育不同階段蛋白質表達的差異，選取1周、3月齡和12月齡的杜洛克公豬各4頭，通過2-DE技術分析共得到264個蛋白點，其中108個蛋白點在不同發育階段存在顯著差異，最終鑒定出90種蛋白質。這些蛋白質的表達水平隨年齡增加而增加的占36.1%、隨年齡增加而降低的占38%。之后對這些差異蛋白質進行GO分析發現25%的蛋白質參與細胞組成，22%的蛋白質參與代謝過程。2015年盧曾奎等［26］進行了有關綿羊（Ovine）睪丸蛋白質組學的研究，建立并優化了綿羊睪丸蛋白質2-DE圖譜。后續通過2-DE技術研究不同發育期綿羊睪丸差異蛋白質組成，共得到37種在5個發育期均存在差異的蛋白質。GO分析發現12個蛋白質參與生長發育過程，2個蛋白質參與繁殖過程。這些差異蛋白質的發現，將有助于公羊生長和繁殖性能的研究。

3 定量蛋白質組學在動物睪丸疾病研究中的應用

定量蛋白質組學可以分析比較不同病理狀態下蛋白質的變化，從而鑒定出疾病狀態下發生變化的蛋白質，為疾病診斷和治療提供理論依據。2007年，蔣榮江等［27］研究了正常大鼠與尿道下裂大鼠睪丸差異蛋白質的表達，從2-DE圖譜中共發現9個差異蛋白點，其中4個在正常大鼠睪丸中高表達，5個在尿道下裂大鼠睪丸中高表達，為進一步鑒定尿道下裂發生的蛋白質奠定基礎。Huo等［28］對3名正常和3名無精癥病人的睪丸組織進行蛋白質組成的比較分析，發現10個蛋白點在正常人與無精癥病人睪丸中存在顯著差異，這些蛋白點被鑒定為Prx4（peroxiredoxin-4）、Prx2（peroxiredoxin-2）、HSP27（heat shock proteins27）、CTSD（cathepsin D）、GPX4（phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase 4）等，代謝通路分析發現Prx2、HSP27、CTSD和GPX4這4種蛋白與睪丸細胞增殖、凋亡相關。李飛等［29］建立并優化了成年無精癥男性睪丸2-DE圖譜，為無精癥發病機制從蛋白質組學水平上的研究提供思路。

4 定量蛋白質組學在特殊環境刺激下動物睪丸研究中的應用

動物時刻面臨著各種特殊環境刺激，包括金屬元素、微波輻射、有毒物質及溫度變化等。這些特殊環境刺激會對動物的生殖系統造成一定的危害，但是目前對于動物如何應對和適應這些特殊環境刺激的分子機制尚不明確。因此應用定量蛋白質組學技術比較特殊環境刺激前后動物生殖系統中蛋白質的變化，將有助于了解動物如何應對和適應這些特殊環境刺激的分子機制。2005年，張建鵬等［30］探討了金屬元素鎘對大鼠睪丸的毒性機制，通過2-DE技術比較了生理鹽水對照組、鎘處理組和鎘加維生素C處理組之間的差異發現，16個蛋白點發生變化，其中8種蛋白質可能與睪丸鎘中毒機制有關，同時發現添加維生素C對鎘中毒有減緩作用。陳浩

宇等［31］研究了微波輻射對大鼠睪丸蛋白質表達的影響，微波輻射72 h后的大鼠睪丸2-DE圖譜與正常情況相比共有136個蛋白點發生變化，發生變化的蛋白質參與了睪丸細胞骨架組成、能量代謝、信號轉導等過程，微波輻射可導致睪丸蛋白質表達的改變，進而影響精子的生成。Ma等［32］應用2-DE技術檢測了低劑量的四氯雙苯環二惡英（2，3，7，8-Detrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）對大鼠睪丸和精子蛋白質的影響，將32只雄性大鼠隨機分成3組，分別飼喂140、350和875 ng TCDD/kg/周，29周后發現TCDD對睪丸蛋白質的表達以及精子數的改變與飼喂玉米油的對照組有顯著差異，質譜鑒定后發現隨著TCDD 飼喂量的增加PERF15蛋白表達量呈下降趨勢，而SSP411、泛素羧基末端水解酶-3和真核翻譯延伸因子-1蛋白表達量呈增加趨勢，這些數據為研究TCDD對睪丸毒性機制奠定理論基礎。趙珺［33］研究了高溫熱應激對雄性小鼠生殖機能的影響，通過比較正常組與高溫組的2-DE圖譜共發現18個差異蛋白點，質譜鑒定出16種蛋白質，這些蛋白質主要包括DNA損傷修復蛋白、熱應激蛋白、細胞周期蛋白和細胞凋亡蛋白等。黃禮元［34］應用2-DE技術研究了香煙煙霧對小鼠睪丸蛋白質表達的影響，通過質譜分析共得到35種差異蛋白質，其中PEBP蛋白（phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP）可能與精子發生相關，可作為臨床上評估吸煙對生殖不良影響的分子標記。Li等［35］應用2-DE技術探討了碳離子輻射對青春期小鼠睪丸蛋白質表達的差異，通過質譜鑒定出8種蛋白質，這些蛋白質主要參與能量供給、細胞增殖和抗氧化等功能，對睪丸響應碳離子毒性的研究起重要作用。

5 展望

定量蛋白質組學為睪丸發育、雄性生殖疾病以及應對刺激的研究提供了新的思路和技術手段。目前，定量蛋白質組學雖然在睪丸的研究中取得了一些成果，但仍然存在一些問題尚未解決，如（1）2-DE技術作為首選方法，重復性差、鑒定蛋白質數目有限、容易受外界因素影響等，而其他方法較昂貴；（2）研究者缺乏生物信息學知識，數據分析不夠深入；（3）睪丸定量蛋白質組學與其他組學聯合分析不夠。針對以上不足，睪丸定量蛋白質組學有必要在以下3個方面進行深入研究：（1）開發較便宜蛋白質定量技術，快速、大通量檢測差異表達蛋白質；（2）加強對差異蛋白質的生物信息學分析，達到對實驗數據信息的最大挖掘；（3）聯合應用睪丸基因組學數據庫、轉錄組學數據庫、代謝組學數據庫和蛋白質組學數據庫，綜合分析睪丸發育、雄性生殖疾病以及應對刺激的機制。相信隨著測序技術的快速發展和生物信息學分析技術的不斷進步，睪丸定量蛋白質組學在如何提高動物繁殖力、提高雄性動物生殖疾病的治療效率以及更好地適應環境等方面的研究將獲得重大進展。

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（責任編輯 狄艷紅）

Application Advances of Quantitative Proteomics in the Studies of Animal Testis Protein

LU Zeng-kui1MA You-ji1，2
（1. College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；2.Gansu Engineering Laboratory of Sheep Breeding Biotechnology，Minqin 733300）

Proteomics is one of the most important research areas at post-genomics era and quantitative proteomics is one of the main methods to study proteomics，which may reflect the dynamic nature of proteins. As a key male reproductive organ，testis produces sperms and secrets androgens. Thus it is of great significance to investigate the protein compositions of testis by the method of proteomics. In this review，we mainly focus on the concept of proteomics and the technological means of quantitative proteomics，as well as its application in the studies of testicular development，and responses to diseases and various stress conditions, stress conditions which provids insight into the further research on protein in testis.

quantitative proteomics；testis；animal；advances

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.002

2016-04-01

甘肅省農業生物技術研究與應用開發項目（GNSW-2012-19），國家肉羊產業技術體系（CARS-39），甘肅省高校基本科研業務費（2014）

盧曾奎，男，碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種與繁殖；E-mail：963081020@qq.com

馬友記，男，教授，研究方向：動物遺傳育種與繁殖；E-mail：yjma@gsau.edu.cn