一株產胞外多糖海洋弧菌的分離鑒定及其多糖抗腫瘤活性初步研究

龍寒陳盛峰陳佳楊迪李曉燕黃玉油何秀苗，2禤金彩

（1. 廣西民族大學海洋與生物技術學院 廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室，南寧 530006；2. 廣西民族大學 廣西林產化學與工程重點實驗室，南寧 530006）

一株產胞外多糖海洋弧菌的分離鑒定及其多糖抗腫瘤活性初步研究

龍寒1陳盛峰1陳佳1楊迪1李曉燕1黃玉油1何秀苗1，2禤金彩1

（1. 廣西民族大學海洋與生物技術學院 廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室，南寧 530006；2. 廣西民族大學 廣西林產化學與工程重點實驗室，南寧 530006）

為初步探究廣西北部灣海洋細菌所產胞外多糖（Extracellular polysaccharide，EPS）的生物學活性，通過LB-苯胺藍培養基分離產EPS的海洋細菌，苯酚-硫酸法測定EPS產量，16S rDNA法鑒定多糖產量較高的菌株，通過凝膠滲透色譜測定多糖分子量，紅外光譜分析該多糖的結構；最后運用MTT（噻唑藍）法測定該EPS對Vero細胞的毒性，以及對HeLa細胞的抑制作用。結果顯示，從海水及紅樹林泥樣中共分離獲得167株產EPS的海洋細菌，其中一株BHc-09 EPS產量較高，達0.306 mg/mL，通過16S rDNA序列分析鑒定BHc-09為弧菌屬，其EPS分子量約為184.5 kD，結構中含有糖醛酸；該胞外多糖對正常Vero細胞無毒性而對腫瘤細胞的生長具有明顯的抑制作用。

海洋弧菌；胞外多糖；分離鑒定；抗腫瘤

生物多糖（Polysaccharide）是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結構復雜且數量龐大的糖類物質，廣泛分布于動物、植物和微生物中［1］。其中，微生物的種類和數量龐大，是研究生物多糖的重要來源。微生物多糖可分為胞內多糖和胞外多糖［2］，其中微生物胞外多糖因具有產量高、性質穩定且易與菌體分離等特點備受關注。微生物的胞外多糖主要包括黏附在其表面的莢膜多糖（Capsular polysaccharide，CPS）和合成分泌到環境介質中的胞外多糖（Extracellular polysaccharides，EPS）。海洋細菌因其特有的高鹽濃度、高壓、高溫差、寡營養和高毒性濃度等特殊環境，具有產生結構新穎、功能獨特的新型活性多糖的潛力［3］。如日本學者Umezawa［4］對167株海洋細菌所產EPS進行抗腫瘤活性的篩選發現，6%的菌株其EPS具有明顯的抗腫瘤活性。

廣西北部灣為半封閉大海灣，特殊的地理和氣候環境使得該海域微生物資源豐富且復雜多樣，具有產生新型活性多糖的潛力。王英等［5］發現，來源于紅樹林的真菌PH1008 EPS可刺激小鼠脾細胞增殖，并促進 NK細胞殺傷能力。梁靜娟等［6］從廣西北部灣紅樹林泥樣中篩選到一株短小芽孢桿菌Bacillus pumilus PLM4，該菌EPS對人喉癌細胞Hep22、肝癌細胞BEL27404和舌癌細胞TCA8123的生長都具有抑制作用。基于以上研究，廣西北部灣海洋細菌所產胞外多糖具有多種生物活性，應用前景良好。為了進一步探究廣西北部灣海洋細菌胞外多糖及其生物學活性，本研究對來源于北部灣相關樣品通過LB-苯胺藍固體培養基進行產胞外多糖細菌的篩選和分離以及PCR等方法的鑒定，通過MTT法初步研究其EPS的抗腫瘤活性，以期獲得具有良好生物活性的細胞胞外多糖，為北部灣海洋細菌資源的開發和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 用于分離產EPS細菌的樣品取自北海和欽州兩地的近海水樣（2 m深左右水樣）和茅尾海紅樹林泥樣（地面下50 cm深左右泥樣），樣品保存于4℃備用。

1.1.2 培養基 LB-苯胺藍固體培養基：酵母粉5.0 g，氯化鈉5.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂18-20 g水溶苯胺藍5.0 g，蒸餾水500 mL，人工海水500 mL，pH7.4-7.6。LB-培養基：酵母膏5.0 g，氯化鈉5.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂18-20 g，蒸餾水500 mL，人工海水500 mL，pH7.4-7.6。搖瓶培養基：蔗糖4 g，酵母粉3 g，CaCO30.1 g，蒸餾水500 mL，人工海水500 mL，pH7.4-7.6。以上培養基均121℃，30 min滅菌處理。

1.1.3 主要試劑 氯仿、正丁醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸等均為國產分析純；DMEM培養液購自Gibco公司），RPMI-1640培養液為Thermo公司產品，碳酸氫鈉和臺酚藍均為Sigma公司產品，青霉素、鏈霉素、噻唑藍（MTT）均為Amresco公司產品。

1.1.4 引物 參照Anna等［7］設計針對16S rDNA引物，引物序列如下：GM5F：5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'，907R：5'-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3'，預期的目標片段長度為590 bp，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌初篩、純化及保存 將采集的泥樣或水樣用無菌海水稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六種不同稀釋度，分別取100 μL均勻涂布于LB-苯胺藍固體平板中，于30℃恒溫箱中培養48 h。挑選出顏色較深、厚度較大、粘稠度較大的菌落，劃線接種于LB固體培養基進行純化。最后進行單一菌落斜面固體培養基培養，30 %無菌甘油進行菌種保存，并做標記。

1.2.2 菌種復篩 菌種經LB斜面培養基復蘇，30℃培養24 h。菌落轉接種于25 mL LB液體培養液中，30℃，180 r/min搖床振蕩培養9 h，得到細菌種子液。取種子液1.5 mL接種于48.5 mL搖瓶培養基中，27℃，180 r/min振蕩培養36 h，得到發酵液。復篩采用搖瓶發酵產糖量分析法，即取發酵液10 mL于50 mL離心管中，加入等體積的2 mol/L NaOH，靜置20 min后離心（12 000 r/min，30 min）；取上清，用3 mol/L HCl調pH至接近6.0后3000 r/min離心30 min；目測EPS沉淀量，選出沉淀明顯的菌株，用于后續EPS含量測定。

1.2.3 EPS含量測定方法 采用苯酚-硫酸法［8］測定EPS含量，以葡萄糖為標準，按常規方法制作葡萄糖標準曲線。

1.2.4 細菌種屬鑒定 細菌種屬鑒定采用16S rDNA序列分析法。細菌DNA的提取：取適量菌體加入50 μL Lysis for microorganism to Direct PCR溶液中混勻，后將EP管置于80℃水浴鍋中熱變性15 min后，8 000 r/min離心1 min，取4 μL上清液作為PCR反應的模板。

PCR反應體系：12.5 μL 2×Taq mix，6.5 μL無菌水，4 μL模板DNA，引物各2 μL，總體積25 μL。PCR程序：94℃預變性3 min，94℃變性1 min，50℃退火1.5 min，72℃延伸3 min，30個循環；72℃延伸6 min。

產物經1 %的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，陽性PCR產物經純化送到北京華大基因公司深圳分公司進行測序。序列于NCBI數據庫比對，采用MEGA5.0繪制遺傳進化樹。

1.2.5 EPS的粗提取 苯酚-硫酸法獲得的粗多糖，采用常規的Sevage法［9］去除雜蛋白，獲得的純化樣品經雙光束紫外光可見分光光度計對200-400 nm波段進行掃描，觀察 260 nm 和 280 nm 處的蛋白吸收峰有無峰值來檢測蛋白質是否去除干凈。

1.2.6 多糖分子量的測定及紅外光譜分析 多糖樣品分子量及純度采用Waters高效凝膠色譜儀測定，色譜柱為Waters Μltrahydrogel Linear 7.8×300，并通過2414示差檢測器進行測定。首先，用不同分子量的標準葡聚糖（含4.4 kD，9.9 kD，21.4 kD，43.5 kD，124 kD，196 kD，277 kD）制作標準曲線，其次根據樣品的洗脫體積與標準曲線對照求出樣品分子量，最后根據出峰情況判定樣品純度。同時將3.0 mg經sevage法純化的胞外多糖樣品與KBr一同壓片進行紅外掃描檢測，初步分析多糖的結構和化學鍵。

1.2.7 EPS細胞毒性檢驗 純化的多糖溶液經0.22 μm過濾除菌，濾液經含10%胎牛血清的DMEM完全培養基分別配置成10、30、50、100、300和500 μg/mL 6種不同的濃度備用。

運用MTT能與活細胞產生藍色結晶的原理來檢測胞外多糖對Vero細胞的毒性［10］：將Vero細胞（濃度為1×106/mL）以50 μL/孔傳至96孔細胞培養板，再分別加入BHc-09不同濃度的胞外多糖溶液50 μL/孔，并設置空白對照，每組均設5個復孔。培養板放置于37℃，5% CO2培養箱中培養48 h后，于每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續培養4 h后取出，于各孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩10 min，酶標儀測吸光度，檢測波長為490 nm，參考波長為630 nm。

1.2.8 EPS對腫瘤細胞體外增殖的抑制作用 常規復蘇并培養HeLa細胞，待長滿細胞瓶后用胰酶處理，改良RPMI-1640完全培養基調整細胞濃度至1×106/mL并以50 μL/孔傳至96孔細胞培養板，再分別加入不同濃度的BHc-09胞外多糖溶液50 μL/孔，并設置空白對照，每組均設5個復孔。培養板放置于37℃，5% CO2培養箱中培養，并于24 h、48 h、64 h三個時間段觀察細胞形態，64 h后取出于每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續培養4 h后取出，于各孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩10 min，酶標儀測吸光度，檢測波長為570 nm，參考波長為630 nm。計算多糖對腫瘤細胞的抑制率（IR）［11］。IR=（1-實驗孔吸光度/對照孔吸光度）×100%。

2 結果

2.1 產EPS細菌的篩選結果

經過LB-苯胺蘭培養基初篩最終獲得167株產胞外多糖（EPS）的細菌。通過發酵培養基復篩，最終獲得1株EPS產量較高的菌株，命名為BHc-09，其EPS產量達到0.306 mg/mL。

2.2 細菌種屬鑒定

以BHc-09菌體裂解物為模板，通過PCR擴增，獲得590 bp 的目的產物，與預期的目的片段大小相符。測序得到的BHc-09 16S rDNA序列于NCBI數據庫中的應用程序blast，將所得的16S rDNA基因序列進行相似性比對，結果BHc-09與弧菌（Vibrio）相似性為99%，將BHc-09 16SrDNA序列與部分弧菌菌株及其它菌屬的相應序列繪制遺傳進化樹（圖1），發現BHc-09與弧菌屬親緣關系最近，同屬于一個分支中，因此，確定BHc-09為弧菌屬。

圖1 BHc-09菌的遺傳進化樹

2.3 EPS分子量及結構測定結果

將經過Sevage法除蛋白后的EPS溶液進行紫外吸收檢測，結果（圖2）顯示，該EPS溶液在260 nm和280 nm處均無吸收峰，表明通過Sevage法已經除干凈粗多糖中的雜蛋白。經高效凝膠滲透色譜檢測，BHc-09弧菌所產EPS分子質量約為184.5 kD（圖3），BHc-09弧菌所產EPS溶液色譜圖顯示單峰，樣品純度較高。

圖2 粗純化多糖的紫外掃描曲線

圖3 BHc-09細菌所產EPS的高效凝膠滲透色譜

紅外分析結果（圖4）表明，BHc-09 EPS具有多糖的特征吸收峰：3401-3405 cm-1處為糖類多羥基中O-H伸縮振動峰；2935-2942 cm-1出現弱吸收峰，為C-H伸縮振動峰；1623 cm-1為結晶水中O-H彎曲振動吸收峰或C=O伸縮振動峰；1407-1419 cm-1是C-H變角振動吸收峰；1126 cm-1為C-O變角振動峰。除此之外，多糖在1685 cm-1處有吸收峰，該峰為糖醛酸吸收峰，說明多糖中具有糖醛酸基團。此外，多糖未出現S=O及C-O-S的吸收峰，表明這種多糖結構內無硫酸根基團。

圖4 BHc-09細菌所產EPS的紅外色譜圖

2.4 BHc-09 EPS對細胞的毒性實驗結果

BHc-09 EPS對細胞的毒性實驗結果（表1）表明，BHc-09 EPS在10-500 μg/mL的濃度范圍內對Vero細胞沒有直接毒性。通過MTT的作用，Vero細胞在多糖濃度升高的情況下，細胞A490nm值略微增高，但與對照組比，差異性不顯著（P＞0.05）。此外，通過倒置顯微鏡的觀察，實驗組與對照組在細胞形態和生長趨勢上沒有差別。

表1 BHc-09 EPS對Vero細胞的毒性

2.5 BHc-09 EPS對腫瘤細胞體外增殖的抑制作用

BHc-09 EPS對HeLa細胞體外增殖的抑制作用結果，如表2。當BHc-09 EPS濃度為100 μg/mL、300 μg/mL和500 μg/mL時，其抑制率分別為60.8 %、89.8 %和92.7 %，且與對照組的差異性非常顯著（P＜0.01）；濃度為50 μg/mL時，其抑制率為28.4 %，與對照組差異性顯著（P＜0.05）；濃度為10 μg/mL和30 μg/mL時，抑制率為18.3 %和19.3 %，且差異性不顯著。此外，倒置顯微鏡的觀察也發現，當多糖濃度達到100 μg/mL時，可以觀察到腫瘤細胞細胞變圓，形態不飽滿，細胞呈拉絲狀，當濃度達到300 μg/mL，腫瘤細胞大部分開始漂浮、成團和死亡，極少一部分貼壁，濃度為500 μg/mL，細胞漂浮、成團和死亡更為嚴重，而低濃度下HeLa細胞形態及生長情況與對照組差別不大。分析表明，BHc-09胞外多糖對HeLa細胞的體外增殖具有抑制作用，且在高濃度區抑制作用明顯。

表2 BHc-09 EPS對腫瘤細胞的抑制作用

3 討論

海洋細菌EPS無毒副作用，具有生產周期短、成本低廉及顯著的生物活性［12］等優點，因此，從海洋細菌中探索新的具有生物學活性的多糖和多糖復合物，已成為海洋藥物開發的熱點。廣西北部灣地區地理和氣候獨特，微生物資源豐富且復雜多樣，為研究海洋細菌胞外多糖奠定了基礎。從廣西北海近海海域和欽州茅尾海紅樹林采集的樣品中共分離出167株具有產EPS的海洋細菌，從中篩選出一株EPS產量達到0.306 mg/mL的海洋弧菌BHc-09，其多糖產量與馬波等［13］進行海洋細菌M4產EPS發酵條件優化后48 h的產糖量相當。因此，BHc-09屬于產量較高的產EPS海洋弧菌，其EPS的分子量為184.5 kD，對Vero細胞無毒副作用，對腫瘤細胞系HeLa細胞有抑制生長作用。

有資料表明，大腸桿菌、根瘤菌、多粘芽孢桿菌等細菌多糖均具有抑制腫瘤細胞生長、誘導細胞凋亡及增強免疫功能［12］等作用。Marjut等［14］證實大腸桿菌莢膜多糖經O-硫酸化后可有效抑制癌細胞的轉移。Zhao等［15］證實根瘤菌胞外多糖可抑制荷肉瘤180、肝癌22和艾氏腹水癌中腫瘤細胞的進一步增殖，促進單核細胞和淋巴細胞的增殖和吞噬能力，具有較強的抗腫瘤活性。本研究初步的結果表明，海洋弧菌BHc-09 EPS也具有抑制HeLa細胞系

增殖的作用，顯示了初步的抑制腫瘤細胞效果，該多糖是否能抑制其它腫瘤細胞系的增殖有待于進一步的研究。此外，目前針對產多糖弧菌的研究主要是在弧菌表面的莢膜多糖和其細胞壁成分脂多糖方面，與這些被證明具有良好的免疫活性的多糖相比，從弧菌菌內產生的并分泌到胞外的多糖的研究較少，且BHc-09的特殊來源，其抗腫瘤活性如何有待于進一步深入的研究。

微生物胞外多糖的生物活性與其自身的結構密切相關，這類多糖大多由多種單糖按一定比例組成雜多糖，其中以葡萄糖、半乳糖和甘露糖為主，另外還含有葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基糖和丙酮酸等。研究通過紅外光譜分析表明，BHc-09海洋弧菌胞外多糖產物具有多糖特征吸收峰，并含有糖醛酸。據研究報道，多糖的抗氧化性與其糖醛酸含量呈正相關［16］，因此，BHc-09海洋弧菌EPS產物可能具有一定的抗氧化活性。此外，BHc-09海洋弧菌EPS產物的分子量高達184.5 kD，有研究［17］表明，分子量高于90 kD的多糖具有較強的免疫學活性，因此，BHc-09 EPS的其他活性有待于進一步研究。

4 結論

本研究分離獲得了一株高產EPS的海洋弧菌BHc-09，其分子量為184.5 kD，結構中含有糖醛酸成分，BHc-09胞外多糖具有抗腫瘤細胞系Hela細胞增殖的作用。

［1］ 劉潔, 李文香, 王文亮, 等. 生物多糖研究進展［J］. 山東農業科學, 2011（5）：98-101.

［2］ 魏培蓮. 微生物胞外多糖研究進展［J］. 浙江科技學院學報, 2002, 14（2）.

［3］ 孫海紅, 毛文君, 錢葉苗, 等. 海洋微生物活性胞外多糖的研究進展［J］. 海洋科學, 2011（11）：134-138.

［4］ Umezawa H, Okami Y, Kurasawa S, et al. Marinactan, antitumor polysaccharide produced by marine bacteria. ［J］. Journal of Antibiotics, 1983, 36（5）：471-477.

［5］ 王英, 貝寧, 王永霞, 等. 紅樹林真菌PH1008胞外多糖增強小鼠免疫功能的研究［J］. 食品研究與開發, 2015（12）：16-18.

［6］ 梁靜娟, 王松柏, 龐宗文, 等. 海洋細菌Bacillus pumilus PLM4產抗腫瘤多糖的發酵條件優化研究［J］. 廣西農業生物科學, 2006（03）：256-260.

［7］ Clarke A, Kirby R, Rose PD. Molecular microbial ecology of lignocellulose mobilisation as a carbon source in mine drainage wastewater treatment［J］. Water Sa, 2007, 30（6）：11-12.

［8］ Mishra A, Jha B. Microbial Exopolysaccharides［M］. Springer Berlin Heidelberg, 2013.

［9］ 郭丹釗, 黃為一. 一株葡糖桿菌胞外多糖的體外抗氧化活性及其組成研究［J］. 南京農業大學學報, 2005（2）：50-54.

［10］ 趙嘉惠, 張華屏, 王春芳. MTT法在檢測細胞增殖方面的探討［J］. 山西醫科大學學報, 2007（3）：262-263.

［11］ 戴碧濤, 蔣紀愷, 等. 苦參堿聯合抗腫瘤藥抑制K562細胞增殖的研究［J］. 第三軍醫大學學報, 2005（5）：392-394.

［12］ 林俊, 李萍, 陳靠山. 近5年多糖抗腫瘤活性研究進展［J］.中國中藥雜志, 2013（8）：1116-1125.

［13］ 馬波, 陳桂光, 李瑋, 等. 產胞外多糖海洋細菌M4的發酵動力學研究［J］. 現代食品科技, 2006（3）：32-34.

［14］ Marjut B, Anni W, Katri H, et al. O-Sulfated bacterial polysaccharides with low anticoagulant activity inhibit metastasis［J］. Semin Thromb Hemost, 2007, 33（5）：547.

［15］ Zhao L, Chen Y, Ren S, et al. Studies on the chemical structure and antitumor activity of an exopolysaccharide from Rhizobium sp. N613［J］. Carbohydrate Research, 2010, 345（5）：637-643.

［16］ 申明月, 聶少平, 等. 茶葉多糖的糖醛酸含量測定及抗氧化活性研究［J］. 天然產物研究與開發, 2007, 19（5）：830-833.

［17］ Ohno N, Miura T, Miura NN, et al. Structure and biological activities of hypochlorite oxidized zymosan［J］. Carbohydrate Polymers, 2001, 44（4）：339-349.

（責任編輯 李楠）

Isolation and Identification of Marine Vibrio Producing Extracellular Polysaccharide（EPS）and the Preliminary Study on Anti-tumor Activity of the EPS

LONG Han1CHEN Sheng-feng1CHEN Jia1YANG Di1LI Xiao-yan1HUANG Yu-you1HE Xiu-miao1，2XUAN Jin-cai1
（1. School of Marine Sciences and Biotechnology/Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Utilization of Microbial and Botanical Resources，Guangxi University for Nationalities，Nanning 530006；2. Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products，Nanning 530006）

In order to investigate the bio-activities of the extracellular polysaccharide（EPS）from the marine bacteria in the Guangxi Beibu Gulf，the marine bacteria of EPS-producing were isolated from water/mud samples by LB-aniline blue medium. Phenol-sulfuric acid method was used for measuring the yield of the EPS. The marine bacterial strains with high-yield of ESP were further identified by the sequence analysis of 16S rDNA. The molecular weight and the preliminary structure of the EPS were tested by Gel permeation chromatography（GPC）and infrared spectrometry，respectively. Finally，the cytotoxicity of the EPS on Vero cells and the inhibitory effect of the EPS on Hela cells were tested by the MTT method. The results showed that totally 167 marine bacteria producing EPS were isolated from sea water/mud of mangrove，one of which（named BHc-09）yielded ESP as high as 0.306 mg/mL and was identified to be Vibrio by the analysis of its 16S rDNA sequence. The molecular weight of the EPS from BHc-09 was 184.5 kD，and there was uronic acid in the EPS structure. The EPS produced by BHc-09 presented no cytotoxicity on Vero cell，but significantly inhibitory effects on tumor cells. The results suggested that an EPS-producing marine Vibrio was successfully isolated and identified，and its extracellular polysaccharide has anti-tumor activity.

marine Vibrio；extracellular polysaccharide；isolation and identification；anti-tumor

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.026

2016-05-30

國家自然科學基金項目（31560706），2014廣西民族大學相思湖青年學者創新團隊資助，廣西林產化學與工程協同創新高水平研究項目（2013B01）

龍寒，女，實驗師，研究方向：海洋微生物學；E-mail：longhoo@163.com

何秀苗，女，博士，教授，研究方向：微生物與免疫學；E-mail：xiumiaohe0839@sina.com