低深度測(cè)序在檢測(cè)單細(xì)胞染色體微小變異中的應(yīng)用探索

陳大洋甄賀富劉萍邱詠謝林劉弘泰陳芳

（1. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)華大教育中心，深圳 518083；2. 深圳華大基因研究院，深圳 518083）

低深度測(cè)序在檢測(cè)單細(xì)胞染色體微小變異中的應(yīng)用探索

陳大洋1甄賀富2劉萍2邱詠2謝林2劉弘泰1陳芳2

（1. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)華大教育中心，深圳 518083；2. 深圳華大基因研究院，深圳 518083）

旨在探討低深度測(cè)序在檢測(cè)單細(xì)胞染色體微小變異中的應(yīng)用。以經(jīng)過(guò)比較基因組雜交（array CGH，aCGH）檢測(cè)的5例陽(yáng)性細(xì)胞系為研究對(duì)象，從中分離的單細(xì)胞分別用兩種單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，采用Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全基因組測(cè)序，然后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，將檢測(cè)結(jié)果與已被aCGH證實(shí)的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，5個(gè)單細(xì)胞的全基因組擴(kuò)增成功，通過(guò)低深度測(cè)序均獲得明確的檢測(cè)結(jié)果。在用GenomePlex?Single Cell WGA Kit試劑盒的處理中檢出區(qū)域與aCGH檢測(cè)區(qū)域均有80%以上的重疊，1個(gè)樣本檢出了8 Mb（Megabase）左右的假陽(yáng)性；在用PicoPLEX?WGA Kit試劑盒處理時(shí)檢出信號(hào)與aCGH區(qū)域也有80%以上的重疊且無(wú)假陽(yáng)性信號(hào)產(chǎn)生。證實(shí)在數(shù)據(jù)量為0.1 X左右時(shí)可以檢出單細(xì)胞染色體上7 Mb以上的拷貝數(shù)變異。

單細(xì)胞；低深度；染色體變異；擴(kuò)增

基于單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)（single-cell sequencing）的變異檢測(cè)方法極大促進(jìn)了我們對(duì)大腦、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，及其組成這些系統(tǒng)的細(xì)胞之間異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)。隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞測(cè)序?yàn)槔斫獠煌?xì)胞類(lèi)型分化過(guò)程中的基因組穩(wěn)定性提供了新視角。例如，Hou等［1］將多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplification，MDA）和單細(xì)胞深度測(cè)序相結(jié)合應(yīng)用到原發(fā)性血小板增多癥（一種血癌）

和腎透明細(xì)胞癌（一種腎癌）的腫瘤內(nèi)部遺傳特征研究中，解決了用組織樣本測(cè)序時(shí)無(wú)法解決的腫瘤高異質(zhì)性難題。McConnell等［2］以單個(gè)腦神經(jīng)元細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了大段的DNA缺失或重復(fù)突變。尤其在植入前篩查或診斷領(lǐng)域，通過(guò)對(duì)人極體活檢和單細(xì)胞測(cè)序能夠準(zhǔn)確檢測(cè)胚胎染色體非整倍體，從而挑選正常胚胎進(jìn)行植入［3］。

單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphisms，SNPs）和拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）是兩種主要的遺傳多態(tài)類(lèi)型。SNP是指由單個(gè)核苷酸改變而引起的DNA序列的改變，造成包括人類(lèi)在內(nèi)的物種之間染色體基因組的多樣性，基于單細(xì)胞檢測(cè)SNP通常需要30X以上的測(cè)序深度［4］，測(cè)序成本較高。CNV是指與參照基因組比較，1 kb-1 Mb的DNA片段的缺失、插入、重復(fù)、倒位和復(fù)雜多位點(diǎn)的變異［5］。CNV包含數(shù)千個(gè)基因、疾病位點(diǎn)、功能性因子和部分重復(fù)序列，多發(fā)生在富含重復(fù)序列的位置。例如，端粒、著絲粒和異染色質(zhì)；作為遺傳標(biāo)記，與SNP具有較好的互補(bǔ)性。目前熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)、比較基因組雜交（array CGH，aCGH）、單核苷酸多態(tài)性-微陣列比較基因組雜交技術(shù)（single nucleotide polymorphism array based comparative genomic hybridization，SNP-array CGH）和高通量測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)單細(xì)胞CNV方面均有應(yīng)用。

因?yàn)楦咄繙y(cè)序成本較高，如何降低檢測(cè)成本成為迫切需要解決的問(wèn)題。低深度測(cè)序方法檢測(cè)染色體變異方法具有成本低、準(zhǔn)確性高、通量大等優(yōu)點(diǎn)。Zong等［6］發(fā)現(xiàn)每一百個(gè)基因組位點(diǎn)中挑出一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序就足夠檢測(cè)胚胎非整倍體。本研究從5例細(xì)胞系中挑選出單個(gè)細(xì)胞分別用兩種常用的商業(yè)試劑盒進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，用Hiseq2000進(jìn)行低深度測(cè)序，旨在研究低深度測(cè)序在檢測(cè)單細(xì)胞CNV方面的可行性。org/上查詢(xún)；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基（含2 mmol/L的L-谷氨酰胺）、D-PBS緩沖液、胰酶-EDTA、未滅活的小牛血清、Qubit?dsDNA Broad-Range Assay kit購(gòu)自Life Technologies公司；單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒分別購(gòu)自Sigma公司的GenomePlex?Single Cell WGA Kit和Rubicon Genomics公司的PicoPLEX?WGA Kit；在深圳華大基因研究院完成文庫(kù)構(gòu)建和Hiseq2000平臺(tái)測(cè)序。

表1 細(xì)胞系核型標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果

1 材料與方法

1.1 材料

5例B淋巴細(xì)胞系購(gòu)于Coriell研究所，具體細(xì)胞系信息可根據(jù)表1在網(wǎng)址https://catalog.coriell.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞挑選 本研究在倒置顯微鏡下完成單細(xì)胞挑取，利用口吸管技術(shù)從懸浮細(xì)胞中挑取狀態(tài)理想、形狀圓潤(rùn)的單細(xì)胞。首先，吸取1 μL細(xì)胞懸浮液，在D-PBS緩沖液進(jìn)行梯度稀釋至能觀察到單細(xì)胞分散的狀態(tài)，用口吸管挑取單個(gè)細(xì)胞，然后在一新D-PBS緩沖液中進(jìn)行洗滌至少3遍。最后，將洗滌干凈的單細(xì)胞轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有4 μL D-PBS緩沖液（或單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒提供的細(xì)胞裂解液）的0.2 mL的PCR管中，短暫離心后放置于-20℃暫時(shí)保存（一周內(nèi)）或-80℃長(zhǎng)期保存（一周以上）。

注意轉(zhuǎn)移單細(xì)胞后的口吸管，可以返回洗滌液中反復(fù)吹打，以確保單細(xì)胞沒(méi)有殘留。

1.2.2 全基因組擴(kuò)增 分別將單細(xì)胞取出解凍后，進(jìn)行短暫離心。同時(shí)利用兩種單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒按各自的操作說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增。

擴(kuò)增完成后，用Qubit?2.0 Fluorometer核酸熒光分析儀進(jìn)行PCR產(chǎn)物濃度檢測(cè)，計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)量。然后取1-2 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)PCR產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度范圍以及統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增成功率。

1.2.3 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序 本項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)在Illumina Hiseq2000測(cè)序儀上獲得，文庫(kù)構(gòu)建方法按照Hiseq2000的PCR Free PE index文庫(kù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)操

作進(jìn)行，主要過(guò)程如下：首先取500 ng的PCR產(chǎn)物進(jìn)行超聲打斷，目標(biāo)片段范圍為150-450 bp，然后進(jìn)行末端修復(fù)，加3'-dA末端，以及連接測(cè)序的帶標(biāo)簽接頭。最后用Qpcr對(duì)文庫(kù)進(jìn)行濃度定量，將測(cè)序文庫(kù)混合成上機(jī)文庫(kù)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，本研究選擇SE50+8 index的測(cè)序類(lèi)型。

1.2.4 數(shù)據(jù)質(zhì)控和過(guò)濾 對(duì)于測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)首先通過(guò)FastQCv0.11.2軟件對(duì)樣本的數(shù)據(jù)指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)控；對(duì)于質(zhì)控合格的樣本去掉低質(zhì)量，測(cè)序接頭污染和擴(kuò)增接頭污染的序列，隨機(jī)抽取2 M（百萬(wàn)條序列）序列用于后續(xù)分析。

1.2.5 序列比對(duì) 利用短序列比對(duì)軟件BWA（Version0.7.7）［7］將過(guò)濾后的序列比對(duì)到人類(lèi)參考基因組上（GRCh37，UCSC release hg19）；BWA的參數(shù)設(shè)置為bwa aln -l 15 -t 12，比對(duì)結(jié)果以SAM文件輸出；根據(jù)SAM文件［8］中的FLAG，POS和MAPQ信息挑出非重復(fù)且唯一比對(duì)的序列用于下游分析，并統(tǒng)計(jì)樣本比對(duì)指標(biāo)。

1.2.6 均勻性評(píng)估 基于之前報(bào)道的方法將參考基因組劃分為長(zhǎng)度不同的窗口，根據(jù)比對(duì)上序列的坐標(biāo)信息，統(tǒng)計(jì)落入每個(gè)窗口內(nèi)的序列數(shù)，之后對(duì)序列數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和GC含量矯正［9］，得到代表每個(gè)窗口的拷貝數(shù)值，用每條染色體的變異系數(shù)來(lái)評(píng)估基因組的均勻性大小。

1.2.7 CNV檢測(cè) 對(duì)于單個(gè)樣本，以全基因組范圍內(nèi)劃分好的窗口為檢測(cè)單元，對(duì)檢驗(yàn)窗口中所包含的測(cè)序序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用標(biāo)準(zhǔn)化后的落入每個(gè)窗口的序列數(shù)比值代表該窗口的測(cè)序深度。對(duì)不同GC含量的窗口計(jì)算每個(gè)GC含量間隔內(nèi)的測(cè)序深度，并對(duì)相應(yīng)GC含量的窗口進(jìn)行深度校正。用waldwolfowitz游程檢驗(yàn)對(duì)全基因組內(nèi)的窗口進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，找出不同于群體的窗口，將這些顯著性窗口進(jìn)行合并，最終根據(jù)合并區(qū)域的長(zhǎng)度，深度值和顯著性大小確定拷貝數(shù)變異的具體坐標(biāo)［9］。

2 結(jié)果

2.1 試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)量

表2表示在最終體積一致的情況下兩種不同試劑盒的擴(kuò)增產(chǎn)量；圖1表示兩種不同商業(yè)擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增濃度比較；從中可以看出同一樣本Sigma公司的試劑盒（以下簡(jiǎn)稱(chēng)Sigma）擴(kuò)增濃度較高，但樣本間差異較大，而Rubicon公司（以下簡(jiǎn)稱(chēng)Rubicon）的樣本間擴(kuò)增濃度波動(dòng)較小，且耗時(shí)較短。

表2 兩種不同擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)量

圖1 兩種不同擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增濃度分布

2.2 數(shù)據(jù)產(chǎn)出

表3為經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾后單個(gè)樣本比對(duì)的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。Sigma試劑盒唯一比對(duì)率的波動(dòng)范圍為62.8%-65.1%，Rubicon試劑盒唯一比對(duì)率的波動(dòng)范圍為59.1%-60.1%。在唯一比對(duì)到參考基因組上的序列中Sigma擴(kuò)增的重復(fù)序列占比為7.6%-20.1%，Rubicon的占比為2.5%-3.0%。另外Rubicon擴(kuò)增的序列GC含量平均為43.5%，Sigma的平均為39.0%。

表3 兩種不同擴(kuò)增試劑盒比對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3 均勻性評(píng)估

圖2為用變異系數(shù)衡量全基因組波動(dòng)情況示意圖。Sigma試劑盒的變異系數(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為

0.35±0.05，Rubicon試劑盒變異系數(shù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差為0.28±0.04。使用SPSS軟件對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，得出t=2.515，P=0.066。經(jīng)過(guò)Rubicon處理的樣本變異系數(shù)平均要比Sigma少0.07，說(shuō)明Rubicon的均勻性較好。圖3顯示樣本各條染色體上標(biāo)準(zhǔn)化后的深度均在1附近波動(dòng)，19號(hào)染色體GC含量是所有染色體中最高的，導(dǎo)致測(cè)到的序列較少。

圖2 兩種試劑盒擴(kuò)增樣本的均勻性比較

圖3 樣本內(nèi)各個(gè)染色體上的深度分布

2.4 CNV檢測(cè)

參考之前報(bào)道的檢測(cè)CNV方法對(duì)10個(gè)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測(cè)，表4中列出了最終的檢測(cè)結(jié)果?？梢钥闯鰴z出的區(qū)帶與標(biāo)準(zhǔn)區(qū)帶均有80%以上的重合，根據(jù)之前報(bào)道［10］的判別標(biāo)準(zhǔn)可以認(rèn)為1、3、4、5號(hào)細(xì)胞系兩種試劑盒檢出的區(qū)域與標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域一致。在用Sigma擴(kuò)增的產(chǎn)物中1個(gè)樣本檢出了8 Mb左右的假陽(yáng)性；在用Rubicon擴(kuò)增的產(chǎn)物中無(wú)假陽(yáng)性信號(hào)產(chǎn)生。2號(hào)細(xì)胞系核型為46，XX，der（3）dup（3q）inv（p26q22）說(shuō)明3號(hào)染色體在3q區(qū)帶發(fā)生重復(fù)，且斷裂和鏈接（倒位）發(fā)生于p26和q22區(qū)域，說(shuō)明此數(shù)據(jù)分析方法不能檢測(cè)倒位事件。從圖4可以看出采用低深度測(cè)序策略變異區(qū)域缺失信號(hào)明顯，這也證明了低深度測(cè)序可以檢出有效的CNV。

表4 十個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果

2.5 最低數(shù)據(jù)量測(cè)試

隨機(jī)抽取 0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75和2 M測(cè)序序列來(lái)評(píng)估鑒定拷貝數(shù)變異的最低數(shù)據(jù)量。從表5中可以看出當(dāng)數(shù)據(jù)量在0.75 M以上時(shí)可以有效檢測(cè)出全部變異。

表5 不同數(shù)據(jù)量檢測(cè)結(jié)果匯總.

3 討論

在人類(lèi)已知的200多種染色體疾病中大多數(shù)是由染色體數(shù)目異常引起，如常見(jiàn)的13、18和21號(hào)染色體異常。另有部分染色體疾病因缺失或重復(fù)一段染色體片段而引起，統(tǒng)稱(chēng)為染色體微缺失/微重復(fù)綜合征［11］?；诘蜕疃葴y(cè)序?qū)渭?xì)胞染色體非整倍體進(jìn)行篩查在臨床上已有報(bào)道［12］，但缺乏基于此策略對(duì)染色體微小變異的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)5例已知核型的單細(xì)胞采用低深度測(cè)序策略檢測(cè)染色體微小變異，為這一策略在臨床上的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rubicon試劑盒具有較好的均勻性，原因可能在于Rubicon試劑盒先以原始基因組為模板進(jìn)行復(fù)制，經(jīng)過(guò)12次循環(huán)后，再以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板

進(jìn)行擴(kuò)增可有效降低擴(kuò)增誤差，增加保真性［13］。而Sigma試劑盒是以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，其指數(shù)擴(kuò)增會(huì)放大誤差導(dǎo)致擴(kuò)增均勻性差［14］。

最近，高分辨率寡核苷酸和單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)（single nucleotidepolymorphismarray，SNP array）也被用于產(chǎn)前診斷，與熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）相比，SNP array 能在更廣范圍內(nèi)進(jìn)行染色體異常的檢測(cè)，可發(fā)現(xiàn)具有臨床意義的、小于5 Mb 的染色體微缺失/微重復(fù)［15］。然而，對(duì)某些罕見(jiàn)的、數(shù)據(jù)庫(kù)中未涵蓋的CNV，仍無(wú)法實(shí)現(xiàn)可靠的診斷。隨著二代測(cè)序技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用，特別是單細(xì)胞檢測(cè)領(lǐng)域，低深度的CNV篩查具有重要意義。例如，Navin等［16］利用單細(xì)胞測(cè)序定量基因組拷貝數(shù)變異數(shù)，通過(guò)對(duì)2例乳腺癌病人進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序進(jìn)而構(gòu)建腫瘤演變模型，研究腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性；McConnell等［17］從3位死者體內(nèi)分離了100個(gè)神經(jīng)元，采用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，結(jié)果顯示41%的神經(jīng)元擁有獨(dú)特的CNV，表明這些神經(jīng)元并不是來(lái)自于同一個(gè)親本；在輔助生殖領(lǐng)域能夠在D3對(duì)胚胎中的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行染色體變異的精確篩查并在D5選擇正常胚胎進(jìn)行植入，使篩查和植入在同一個(gè)周期完成。低深度檢測(cè)單細(xì)胞染色體微小變異還需更多的樣本驗(yàn)證才能應(yīng)用到臨床領(lǐng)域，其將為分析遺傳發(fā)育，疾病研究提供非常有價(jià)值的幫助。

4 結(jié)論

本研究以來(lái)自相同細(xì)胞系的單細(xì)胞為材料，用兩種不同的擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，并進(jìn)行

低深度測(cè)序，結(jié)果表明低深度測(cè)序可以檢測(cè)單細(xì)胞染色體的微小變異。

圖4 來(lái)自Sigma（左）和Rubicon（右）擴(kuò)增樣本的染色體變異檢測(cè)結(jié)果

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Application of Low-coverage Whole Genome Sequencing in Detecting Chromosome Micro Variations of Single Cell

CHEN Da-yang1ZHEN He-fu2LIU Ping2QIU Yong2XIE Lin2LIU Hong-tai1CHEN Fang2
（1. BGI Education Center，University of Chinese Academy of Sciences，Shenzhen 518083；2. Beijing Genomics Institute，Shenzhen 518083）

The paper aims to study the application of low-coverage whole genome sequencing in detecting chromosome micro variations of single cell. Using 5 cell lines with positive signal and validated by aCGH as research object，the complete genome of single cell amplified by two commercial kits was sequenced by Hiseq2000；then，comparing the results by bioinformatics with those validated by aCGH. Results showed that in preliminary tests，the whole genome amplification（WGA）was successful in the 5 single cells. Following the low-coverage whole genome sequencing，they all showed the expected karyotype. While using the GenomePlex? Single Cell WGA Kit，the overlapping rate of the detection results and aCGH results was more than 80%，but there was 1 false positive signal of about 8 Mb（Megabase）in 1 sample. While using PicoPLEX? WGA Kit，the overlapping rate of the detection results and aCGH results also was more than 80%，and there was no false positive signal in detection results. The results confirmed that the method would detect the copy number variations larger than 7 Mb via the low-coverage whole genome sequencing（0.1 X）.

single cell；low-coverage；chromosome variations；amplification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.011

2016-04-16

深圳市未來(lái)產(chǎn)業(yè)專(zhuān)項(xiàng)資金（CXZZ20140808170655268）

陳大洋，男，碩士研究生，研究方向：胚胎篩查；E-mail：chendayang@genomics.cn

陳芳，女，博士，研究方向：產(chǎn)前診斷；E-mail：fangchen@genomics.cn