玉米磷轉運蛋白基因ZmPht3；1的克隆和功能分析

吳珊林丹

（1. 成都農業科技職業學院，成都 611130；2. 成都丹鳳科技有限公司，成都 611130）

玉米磷轉運蛋白基因ZmPht3；1的克隆和功能分析

吳珊1林丹2

（1. 成都農業科技職業學院，成都 611130；2. 成都丹鳳科技有限公司，成都 611130）

Pht3（phosphate transporter 3）磷轉運子家族屬于一類低親和力磷轉運蛋白，在調節植株體內磷素的動態平衡中發揮重要作用。為了初步探討玉米中ZmPht3；1基因的結構特征及其磷饑餓的響應機制，利用同源克隆的方法從耐低磷玉米自交系Mo17中分離得到ZmPht3；1基因，并運用實時熒光定量PCR和亞細胞定位的方法對其進行深入研究。結果表明，ZmPht3；1的編碼區全長1 101 bp，編碼366個氨基酸，含有典型的線粒體轉運家族（mitochondrial carrier family，MCF）結構特征與6個疏水跨膜結構。熒光定量PCR分析表明，該基因在兩個極端材料的根系與葉片中均有表達，而表達模式差異顯著，在耐低磷玉米自交系Mo17的根系和葉片中表現為缺磷脅迫前期的一般性反應和后期的特異性反應。轉化煙草的亞細胞定位結果顯示，ZmPht3；1主要分布于細胞膜上，可能是一個雙親和轉運體，在玉米響應磷饑餓脅迫過程中發揮重要的適應性調節作用。

玉米；磷轉運蛋白；基因表達；亞細胞定位

玉米是集糧飼經于一體的栽培作物，在全球范圍內廣泛種植。提高糧食作物的產量是滿足全球人口指數增長的重要前提和基礎。但在玉米生產上一直面臨土壤有效磷濃度低和磷素利用率低的制約［1-3］，嚴重影響了玉米的品質和產量，磷作為一種不可再生的資源而備受關注。在植物的生長和發

育中，磷作為三大營養元素之一，在能量轉移和代謝調節以及抗逆性等過程中起著至關重要的作用。而磷在土壤中極易被螯合固定且利用率低，提高作物耐低磷能力和磷高效利用水平是一個全球性的研究熱點［4］。因此，發掘提高玉米低磷脅迫能力的基因，為分子育種改良玉米基因資源提供基礎，對農業生產具有重要的意義。

在長期的磷饑餓脅迫下，植物進化出以根系形態結構變化為主的形態學變化［5］和代謝通路中生理生化的綜合調節，以及低磷脅迫適應性相關基因分子水平表達調控［6，7］等復雜的適應性機制來滿足自身生長發育的需要。已有的研究發現，分子水平的適應性調節基因主要包括紫色酸性磷酸酶基因PAPs［8］、核糖核酸酶基因Rnase［9］、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因PEPC［10］、焦磷酸酶基因［11］、轉錄因子PHR［12］和ARF［13］以及磷轉運蛋白基因PHT［6］等。其中磷轉運蛋白對植物磷素營養的吸收和利用至關重要，按基因序列的相似性和功能的保守性，可將植物基因組中的磷轉運蛋白分為五大家族，分別為Pht1、Pht2、Pht3、Pho1和Pho2［14］。

隨著玉米自交系B73全基因組測序的完成，為分子水平上進行抗逆相關基因的克隆和功能研究提供了便利。本研究即是通過同源克隆的方法，在極端耐低磷玉米自交系中克隆得到一個磷轉運蛋白基因ZmPht3；1，并利用熒光定量PCR的方法分析其時空表達模式，結合亞細胞定位實驗初步探索其可能的生物學功能，旨在為玉米分子育種的耐低磷遺傳改良奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料和處理 選用玉米耐低磷自交系Mo17和低磷敏感自交系B73為試驗材料［15，16］，以3%的雙氧水浸泡處理30 min，并用無菌水沖洗3次，置于培養皿中浸種催芽至萌發，再播入無菌蛭石中恒溫光照培養。培養溫度控制為白天28℃，夜間22℃，每天光照12 h。玉米幼苗長至三葉期，選取長勢一致的植株移至營養液中進行水培。分別進行6、12、24和72 h的磷脅迫（缺磷營養液）處理，根和葉均3株混合取樣。同時在各相應處理時段以全營養液（供磷水平為1 mmol/L）培養為對照，培養條件不變。營養液配制參考Hoagland營養液配方，脅迫處理組和對照組取材后迅速置于液氮中速凍，-80℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取以及cDNA第一鏈合成 利用Aidlab公司（北京）的EASYspin plus植物RNA提取試劑盒分別提取Mo17和B73在低磷脅迫處理和正常對照組各個時間段的總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，-80℃保存備用。分別以總RNA為模板，按照TaKaRa公司的反轉錄試劑盒（Code：DRR037A）反轉錄合成cDNA，-20℃保存備用。

1.2.2 基因克隆 參照玉米基因組網站MaizeGDB（http://www.maizegdb.org/）中玉米B73的cDNA序列和CDS序列，用Primer5.0設計特異性引物（F：5'-CACGAGAGAGACGAATCT-3'，R：5'-TGATCTCAGGGAACACAG-3'），以Mo17的cDNA為模板進行ZmPht3；1同源序列克隆。高保真酶KOD FX Neo（Toyobo） 擴 增 體 系 包 含2×Buffer、200 μmol/L dNTP、0.2 μmol/L上下游引物、0.5 U DNA聚合酶、1 μL cDNA模板。擴增程序為：95℃預變性2 min；98℃ 10 s，54.5℃ 20 s，68℃ 1 min，40個循環；68℃延伸3 min，4℃保存。PCR擴增產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離、檢測，將目標條帶切下后，用OMEGA公司的DNA凝膠回收試劑盒回收、純化，并連接pEASY-Blunt載體（北京全式金公司）轉化大腸桿菌DH5α，將挑取的陽性克隆菌液進行ABI 3730測序，并對測序結果進行序列比對驗證。

1.2.3 序列分析 根據測序驗證的基因序列，用NCBI Conserved Domain Database（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/index.shtml）對其編碼蛋白功能域進行預測。利用SOPMA軟件在線預測蛋白質二級結構類型及其分子量和等電點等理化特性。利用在線工具HMMTOP、Signal P V4.0、SMART V4.0［17］和Cello v.2.5［18］等分析克隆基因是否含有跨膜區、信號肽以及功能域和亞細胞定位預測。

1.2.4 基因表達分析 依據克隆基因的測序結果，在其非保守區設計特異性引物，并以玉米基

因18S（F：5'-CTGAGAAACGGCTACCACA-3'，R：5'-CCCAAGGTCCAACTACGAG-3'）作為內參對照，對不同處理的樣品進行qRT-PCR。將反轉錄合成的cDNA稀釋10倍作為qRT-PCR的模板。按照SsoFastTMEvaGreen?Supermix試劑盒（Bio-Rad公司）說明配制反應體系，在Bio-Rad CFX96TMPCR儀上進行擴增，每個樣品設3個技術重復。反應體系總體積為10 μL，包含2×EvaGreen Supermix 5 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL。反應程序設定為：98℃預變性2 min；98℃ 2 s，54.6℃（內參基因18S為58℃）10 s，并在此溫度收集熒光，讀板（Plate Read）共40個循環。之后從65℃開始，以每步0.5℃的溫度梯度升高至95℃，每步溫度保持1 s并讀板，繪制熔解曲線。采用2-ΔΔCT法分析數據計算基因的相對表達量。

1.2.5 亞細胞定位檢測 依據克隆基因的測序結果，設計并合成含有限制性酶切位點的引物，上游引物為：5'-TAGGATCCATGGCGCTCTCCGAC-3'，下游引物為：5'-CGGTCGACTCAAGCACTGGCTTTCAA-3'（下劃線部分分別為BamH I和Sal I酶切位點）。通過酶切連接的方法將純化后的PCR產物與改造后的表達載體pCAMBIA2300-eGFP連接構建融合表達載體，轉化大腸桿菌DH5α并擴大培養陽性菌液提取質粒。分別將測序鑒定正確的重組質粒和空載體質粒（對照試驗組）轉化農桿菌GV3101，涂板后置于28℃培養48 h挑取單菌落進行菌液PCR檢測和測序驗證。再將測序驗證的陽性單克隆擴大培養12 h，收集菌體并用10 mmol/L的MgCl2懸浮混勻。采用注射滲透法轉化本生煙草，正常培養36 h后用于共聚焦顯微鏡檢測。

2 結果

2.1 基因克隆和序列分析

圖1 ZmPht3；1的全長CDS序列及其推導的氨基酸序列

通過RT-PCR的方法，根據玉米B73的參考序列設計的特異性引物，以耐低磷玉米自交系Mo17的cDNA為模板，擴增獲得ZmPht3；1的CDS序列。測序驗證后分析發現該基因開放閱讀框全長1 101 bp，編碼366個氨基酸（圖1），分子量為38.65 kD，等電點（pI）為9.29，其中親水氨基酸只有84個，

疏水氨基酸為150個。保守結構域預測顯示該編碼區包含有Mito_carr超家族（圖2），結構特征與線粒體轉運家族（mitochondrial carrier family，MCF）高度一致，是行使其特定生物學功能的基礎。6個保守的跨膜區與5段親水序列相間連接，N端和C端序列均位于膜外側基質面，膜內側的親水環為一段極端保守的基序Px［D/E］xx［R/K］。氨基酸序列的功能性修飾位點分析表明，該序列中不存在N連接的糖基化位點，但包含有一個潛在的酪氨酸激酶II的磷酸化位點（圖1）。推導的氨基酸序列疏水性分析結果（圖3），進一步證實了該基因具有6個疏水的跨膜結構。Cello v2.5預測顯示該基因的表達蛋白定位于細胞膜周質。

圖2 ZmPht3；1的保守結構域預測

圖3 ZmPht3；1的疏水性分析

2.2 基因表達分析

為了探究基因ZmPht3；1的時空表達特征，對耐低磷自交系Mo17和低磷敏感自交系B73分別進行缺磷脅迫處理，并通過熒光定量PCR的方法，檢測該基因在根系和葉片中的表達模式差異。實驗結果（圖4）表明，ZmPht3；1 在根系與葉片中的表達模式在兩個極端材料中差異顯著。在低磷敏感自交系B73根系與葉片中的表達模式極為相似，表達水平整體上表現為一定程度的動態平衡（圖4-A）。缺磷脅迫早期6 h時，在根系與葉片中均強烈響應缺磷環境，顯著的下調抑制表達；脅迫中期，表現為對缺磷環境的適應性，表達量有所增加；在脅迫后期（72 h）的相對表達量又下降至穩態水平。而在耐低磷自交系Mo17的根系與葉片中，ZmPht3；1的表達模式截然相反（圖4-B）。缺磷脅迫早期，在根系與葉片中均誘導上調表達，但隨著脅迫時間的延長，脅迫中期在葉片中的相對表達量繼續增加，而在根系中表現為下調的抑制表達。在脅迫后期，葉片中ZmPht3；1的相對表達量逐步降低，在72 h時達到最低值；而在根系中顯著的上調增強表達，在72 h時達到最高值，表現為對缺磷脅迫環境的誘導表達現象，這可能與該材料對磷環境的敏感性和適應性有關。

圖4 ZmPht3；1在B73（A）和Mo17（B）根系與葉片中的表達模式

2.3 亞細胞定位分析

為了驗證該基因表達蛋白亞細胞定位的在線預測結果，構建了融合表達載體pCAMBIA2300-ZmPht3；1-eGFP，并以空載體pCAMBIA2300-eGFP

為對照。通過注射農桿菌滲透法轉化本生煙草，經10 μmol/L的FM4-64染色后，置于熒光顯微鏡上進行鏡檢觀察，再用共聚焦顯微鏡成像（圖5）。結果顯示，空載體pCAMBIA2300-eGFP表達的綠色熒光蛋白分布于整個細胞（圖5-B），而染色劑FM4-64將細胞膜染成紅色（圖5-D），重組質粒pCAMBIA2300-ZmPht3；1-eGFP 表達的融合蛋白分布于細胞膜和細胞膜周質（圖5-E），與基因序列在線預測（Cello v.2.5）的亞細胞定位結果一致，初步證實ZmPht3；1定位于細胞膜或其周質。

圖5 融合蛋白ZmPht3；1-eGFP在煙草中的亞細胞定位

3 討論

隨著測序技術和基因組學的發展，越來越多物種的全基因組序列測序完成，為分子水平上鑒定和克隆特定的功能基因提供了便利。本研究利用同源克隆的方法，在耐低磷玉米自交系Mo17中克隆得到一個磷轉運蛋白基因ZmPht3；1，并對該基因的序列進行生物信息學預測分析發現其翻譯氨基酸的理化性質和結構特征與MCF高度一致（圖1-圖3），并且膜內側的親水環包含一段MCF家族所特有的基序Px［D/E］xx［R/K］［19］，暗示該家族基因在進化中相對保守。本研究發現ZmPht3；1蛋白定位于細胞膜上，同時基因序列的功能性修飾預測顯示在親水環中存在一個酪氨酸激酶II的磷酸化位點（圖1），可能與其在低磷信號的識別和傳導中作出響應有關。

磷轉運蛋白基因作為一類具有特定生物學功能的功能基因，在植物響應磷脅迫過程中發揮重要的調節作用［6，10］。根據磷轉運蛋白對土壤中可溶性磷吸附能力的差異，可將其劃分為高親和力磷轉運蛋白（Km值為1.8-9.9 μmol/L）和低親和力磷轉運蛋白（Km值為mmol/L數量級）［20］。其中屬于高親和力磷轉運蛋白的Pht1家族是H2PO4-/ nH+共運體［21］，而歸屬于低親和力的線粒體轉運家族（MCF）的Pht3主要位于線粒體膜或質膜上，負責將細胞質中無機磷轉入質體［22］，維持植株體內的磷素循環和再利用。不同磷轉運蛋白的基因家族間存在功能分化，而同一家族中部分成員之間的生物學功能存在補償效應或疊加效應［23］。有研究表明，玉米中屬于高親和力的Pht1家族基因ZmPht1；9響應低磷脅迫誘導，但主要功能是調節根系與葉片中磷素的動態平衡［24］。推測磷轉運蛋白五大家族成員之間可能存在功能互補或協同調節作用，以及復雜的反饋抑制調節系統，綜合應答低磷脅迫環境。

已有的研究發現，多種植物的磷轉運蛋白基因分別有其組織表達特異性和時空表達特征。本研究

中ZmPht3；1在兩極端材料的根系和葉片中均有表達，而相對表達量的變化模式差異顯著（圖4），是MCF蛋白維持植株體內磷素動態平衡的生物學功能的基本體現。在耐低磷玉米自交系Mo17根系和葉片中，缺磷脅迫早期ZmPht3；1均不同程度的上調誘導表達，后期隨著脅迫時間的延長表達模式變化差異顯著（圖4-B），表明該基因的表達特征屬于缺磷脅迫早期的一般性反應和脅迫后期的特異性反應［25］。然而，缺磷脅迫條件下，ZmPht3；1在耐低磷玉米自交系Mo17的根系中脅迫早期被誘導上調表達，相對表達量在脅迫中期有所減少，在24 h時達到最低值，脅迫后期又逐漸增加（圖6），表明該基因對缺磷脅迫的響應存在階段性差異。正常供磷條件下，ZmPht3；1在前期顯著增強表達，后期的相對表達水平逐漸降低（圖6），暗示該基因的表達可能存在不同生長發育時期的差異［26］。由此有理由推測ZmPht3；1可能與少數Pht1家族的高親和力磷轉運蛋白一樣，是一個在高磷條件下和低磷條件下均起作用的雙親和轉運體［23］，在玉米響應磷饑餓脅迫過程中發揮重要的適應性調節作用，為玉米磷高效分子育種研究奠定了基礎。

圖6 ZmPht3；1在Mo17根系中的表達模式

4 結論

以耐低磷玉米自交系Mo17的總RNA反轉錄的cDNA為模板，通過同源克隆PCR獲得一個磷轉運蛋白基因ZmPht3；1。序列分析顯示其氨基酸序列中存在6個跨膜結構，包含有Mito_carr超家族保守結構域。基因表達分析表明，ZmPht3；1 在兩個極端材料中根系與葉片的表達模式差異顯著。亞細胞定位顯示該基因的表達蛋白主要分布于細胞膜上，結合其在耐低磷玉米自交系Mo17中的表達模式表現為缺磷脅迫早期的一般性反應和脅迫后期的特異性反應，推測ZmPht3；1可能是一個雙親和轉運體，在玉米響應磷饑餓脅迫的適應性過程中發揮重要的調節作用。

［1］Raghothama KG, Karthikeyan AS. Phosphate acquisition［J］. Plant and Soil, 2005, 274（1-2）：37-49.

［2］Shen J, Yuan L, Zhang J, et al. Phosphorus dynamics：from soil to plant［J］. Plant Physiology. 2011, 156（3）：997-1005.

［3］Calderon-Vazquez C, Sawers RJ, Herrera-Estrella L. Phosphate deprivation in maize：genetics and genomics［J］. Plant Physiology, 2011, 156（3）：1067-77.

［4］Lopez-Arredondo DL, Leyva-Gonzalez MA, Gonzalez-Morales SI, et al. Phosphate nutrition：improving low-phosphate tolerance in crops［J］. Annual Review of Plant Biology, 2014, 65：95-123.

［5］ York LM, Nord EA, Lynch JP. Integration of root phenes for soil resource acquisition［J］. Frontiers in Plant Science, 2013, 4：355.

［6］Secco D, Jabnoune M, Walker H, et al. Spatio-temporal transcript profiling of rice roots and shoots in response to phosphate starvation and recovery［J］. The Plant Cell, 2013, 25（11）：4285-4304.

［7］Wu P, Shou H, Xu G, et al. Improvement of phosphorus efficiency in rice on the basis of understanding phosphate signaling and homeostasis［J］. Current Opinion in Plant Biology, 2013, 16（2）：205-212.

［8］Li C, Gui S, Yang T, et al. Identification of soybean purple acid phosphatase genes and their expression responses to phosphorus availability and symbiosis［J］. Annals of Botany, 2012, 109（1）：275-285.

［9］Bariola PA, Howard CJ, Taylor CB, et al. The Arabidopsis ribonuclease gene RNS1 is tightly controlled in response to phosphate limitation［J］. The Plant Journal, 1994, 6（5）：673-685.

［10］Calderon V, Ibarra L, Caballero P, et al. Transcript profiling of Zea mays roots reveals gene responses to phosphate deficiency at the plant- and species-specific levels［J］. Journal of Experimental Botany 2008, 59（9）：2479-2497.

［11］Pei L, Wang J, Li K, et al. Overexpression of the llungiella halophila H+-pyrophosphatase gene improves low phosphate tolerance in

maize［J］. PLoS One, 2012, 7（8）：e43501.

［12］Wang X, Bai J, Liu H, et al. Overexpression of a maize transcription factor ZmPHR1 improves shoot inorganic phosphate content and growth of Arabidopsis under low-phosphate conditions［J］. Plant Molecular Biology Reporter, 2012, 31（3）：665-677.

［13］Wang S, Zhang S, Sun C, et al. Auxin response factor（OsARF12）, a novel regulator for phosphate homeostasis in rice（Oryza sativa）［J］. The New Phytologist, 2014, 201（1）：91-103.

［14］楊存義, 劉靈, 沈宏, 等. 植物Pht1家族磷轉運子的分子生物學研究進展［J］. 分子植物育種, 2006, 4（2）：153-159.

［15］Zhang L, Li J, Rong T, et al. Large-scale screening maize germplasm for low-phosphorus tolerance using multiple selection criteria［J］. Euphytica, 2014, 197（3）：435-446.

［16］Kaeppler SM, Parke JL, Mueller SM, et al. Variation among maize inbred lines and detection of quantitative trait loci for growth at low phosphorus and responsiveness to arbuscular mycorrhizal fungi［J］. Crop Science, 2000, 40：358-364.

［17］Letunic I, Doerks T, Bork P. SMART 7：recent updates to the protein domain annotation resource［J］. Nucleic Acids Research, 2012, 40（D1）：D302-D5.

［18］Yu CS, Chen YC, Lu CH, et al. Prediction of protein subcellular localization［J］. Proteins：Structure, Function, and Bioinformatics, 2006, 64（3）：643-651.

［19］Picault N, Hodges M, Palmieri L, et al. The growing family of mitochondrial carriers in Arabidopsis［J］. Trends Plant Sci, 2004, 9（3）：138-146.

［20］Muchhal US, Pardo JM, Raghothama K. Phosphate transporters from the higher plant Arabidopsis thaliana［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1996, 93（19）：10519.

［21］Raghothama K. Phosphate transport and signaling［J］. Current Opinion in Plant Biology, 2000, 3（3）：182-187.

［22］Poirier Y, Bucher M. Phosphate Transport and Homeostasis in Arabidopsis［M］. The Arabidopsis Book, 2002.

［23］Shin H, Shin HS, Dewbre GR, et al. Phosphate transport in Arabidopsis：Pht1；1 and Pht1；4 play a major role in phosphate acquisition from both low- and high-phosphate environments［J］. Plant J, 2004, 39（4）：629-642.

［24］蘇順宗, 吳鋒鍇, 劉丹, 等. 一個玉米Pht1家族磷轉運蛋白基因克隆和功能分析［J］. 核農學報, 2013, 27（7）：885-894.

［25］Hammond JP, Bennett MJ, Bowen HC, et al. Changes in gene expression in Arabidopsis shoots during phosphate starvation and the potential for developing smart plants［J］. Plant Physiology, 2003, 132（2）：578-596.

［26］Ai P, Sun S, Zhao J, et al. Two rice phosphate transporters, OsPht1；2 and OsPht1；6, have different functions and kinetic properties in uptake and translocation［J］. The Plant Journal, 2009, 57（5）：798-809.

（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Characterization of ZmPht3；1，a Phosphate Transporter Gene in Maize

WU Shan1LIN Dan2
（1. Chengdu Agricultural College，Chengdu 611130；2. Danfeng（Chengdu）Technology Co.，Ltd.，Chengdu 611130）

Pht3（phosphate transporter 3）family belonging to low-affinity phosphate transporters play an important role in the regulation of phosphorus homeostasis in plants. In order to explore the characterization of gene structure and response mechanism of ZmPht3；1 to phosphorus（P）starvation，the gene ZmPht3；1 was isolated from low-phosphorus（low-P）tolerance maize inbred line Mo17 by homology cloning. Then the quantitative real-time PCR and subcellular localization of ZmPht3；1 were performed for further research in this study. The results showed that the complete CDS of ZmPht3；1 was 1 101 bp encoding 366 putative amino acids in length，and contained 6 hydrophobic transmembrane domains and had a typical conservation structure domain of mitochondrial carrier family. The PCR results exhibited that the gene expressed in roots and leaves，and the expression patterns were significantly different in the two extreme materials，respectively. While gene expression pattern in low-P tolerance maize inbred line Mo17 both roots and leaves revealed general and special response to P deficiency stress in early and late stages，respectively. Subcellular localization in the transformed tobacco（Nicotiana benthamiana）showed that ZmPht3；1 mainly expressed in cytoplasm membrane and it was a phosphate transporter in both low- and high-P environment，and played a key role in the process of adapting to P starvation in maize.

maize；phosphate transporters；gene expression；subcellular localization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.012

2016-04-08

吳珊，女，碩士，講師，研究方向：分子遺傳育種；E-mail：86015956@qq.com