水稻白葉枯病菌c-di-GMP受體Clpxoo關鍵結合功能位點的確定

李建宇 李波 陳華民 楊鳳環 何晨陽 田芳

（中國農業科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

水稻白葉枯病菌c-di-GMP受體Clpxoo關鍵結合功能位點的確定

李建宇 李波 陳華民 楊鳳環 何晨陽 田芳

（中國農業科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

旨在確定水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）c-di-GMP信號受體Clpxoo的關鍵功能位點。通過對Clpxoo蛋白氨基酸位點基因突變，表達載體構建、蛋白誘導表達及其Ni-NTA Resin親和層析，進行了Clpxoo 及其點突變蛋白的原核表達和產物純化；通過等溫滴定量熱法（ITC），檢測了Clpxoo 及其點突變蛋白與c-di-GMP的結合作用。利用基因定點突變和橋接PCR方法，在優化的誘導表達和純化條件下，成功地獲得了Clpxoo點突變蛋白和與c-di-GMP不發生結合的Clpxoo點突變體。結果表明，Clpxoo蛋白第70位天冬氨酸和第99位谷氨酸是與c-di-GMP結合的關鍵功能位點。

水稻白葉枯病菌；c-di-GMP；信號受體蛋白；點突變體；結合作用

水 稻 白 葉 枯 病 菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae，Xoo）菌株PXO99A的clp基因（基因組序號：PXO_04006）編碼產物蛋白Clpxoo（CRP-like protein）作為一種信號受體和全局性轉錄調控因子，在Xoo毒性表達上發揮著重要的作用［1］。當clp基因缺失后，Δclp突變體的致病力、運動性、胞外多糖產生能力和對H2O2的抗性都顯著降低［2，3］。Clpxoo含有兩個保守的結構域，N端為cNMP的結合結構域，其可以作為第二信使環二鳥苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）信號受體結構域，C端為保

守的DNA結合結構域（HTH），HTH可以識別和結合下游靶基因［4，5］。

c-di-GMP作為一種新型的第二信使，可以通過改變結構與受體蛋白結合而發揮作用，從而調控細胞生物膜形成、運動性和毒性因子表達等諸多生物學功能［6-11］。在Xoo中，Clpxoo作為c-di-GMP信號受體，通過與c-di-GMP的結合介導c-di-GMP信號途徑，并調控生理生化功能。但是Clpxoo調控Xoo基因表達的機理并不完全清楚。通過對野油菜黃單胞菌（X. campestris pv. campestris，Xcc）Clpxcc晶體結構分析和等溫滴定量熱法（ITC）等試驗研究，發現Clpxcc蛋白第70位天冬氨酸位點D70或第166位精氨酸位點R166定點突變成丙氨酸A后，Clpxcc與c-di-GMP結合的能力顯著降低［12］。Clpxcc的cNMP結構域中谷氨酸E99也是Clpxcc結合c-di-GMP的關鍵氨基酸，當第99位谷氨酸位點E99突變成絲氨酸S時，Clpxcc大大降低了對胞外c-di-GMP濃度變化的敏感性［13］。而通過序列同源性分析，發現Xoo和Xcc中的Clp蛋白具有很高的同源性，其中D70、R166和E99更是高度保守。因此，本研究也同樣選擇了轉錄調控蛋白Clpxoo中的3個氨基酸位點做下一步研究。

為了進一步闡明Clpxoo在Xoo中的調控作用機制，以及c-di-GMP對Clpxoo的調控作用的影響，本研究構建Clpxoo的3個點突變體；用優化的條件原核誘導表達和純化點突變蛋白；利用ITC試驗檢測Clpxoo點突變蛋白與c-di-GMP結合情況，旨在確定Clpxoo蛋白缺失的氨基酸位點是否為Clpxoo和c-di-GMP結合的關鍵功能位點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株、質粒及培養條件 Xoo菌株PXO-99A由本實驗室保存；大腸桿菌（Escherichia coil，E. coli）DH5α和BL21（TIANGEN）。Xoo培養基：PSA固體培養基（蛋白胨10 g/L，蔗糖10 g/L，谷氨酸1 g/L，瓊脂粉15 g/L）；M210液體培養基（酶水解干酪素8 g/L，蔗糖5 g/L，酵母提取物4 g/L，K2HPO43 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L）；E. coli 培養液為LB培養基，液體與固體的LB培養基在使用前加入終濃度100 μg/mL的Amp抗生素。本研究所用的所有質粒見表1。

表1 本研究所用質粒

1.1.2 主要試劑和儀器 TaqTMDNA聚合酶、T4 DNA連接酶和各種限制性內切酶（TaKaRa公司），膠回收試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、核酸和蛋白 Marker（TIANGEN）、isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）和蛋白純化 Ni SepharoseTM填料（哈爾濱海基生物公司），PCR儀（Biometra）、電泳儀。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆引入點突變 首先選定Clpxoo蛋白序列中第70位天冬氨酸位點D70、第99位谷氨酸E99和第166位精氨酸R166。通過兩輪PCR擴增，在clp基因上相應的編碼氨基酸序列位點上引入點突變D70A、E99S、R166。在突變位點處合成一對互

補的引物（D70A-F和D70A-R、E99S-F和E99S-R、R166A-F和R166A-R）（表2），分別和外側引物（F和R）（表2）組合進行第一次擴增，PCR擴增條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，35個循環；72℃ 10 min。回收相應的 PCR產物后，等摩爾數混合后作為模板，再以外側引物（F和R）進行第二次PCR，擴增條件為：95℃ 5 min；95℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，35個循環；72℃ 10 min［14，15］。最后，將擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠檢測、回收純化。回收純化產物與 pEASY-Blunt載體在 25℃下連接反應5 min后，通過熱激法將連接產物轉化至E. coli DH5α 感受態細胞。提取質粒進行酶切驗證，獲得的陽性質粒pEASY-Blunt-clpxooD70A、pEASY-Blunt-clpxooE99S、pEASY-Blunt-clpxooR166A進行測序確證（北京華大基因生物公司）。分別測序確認編碼第70位氨基酸（天冬氨酸）密碼子GAU被GCU（丙氨酸）代替；第99位氨基酸（谷氨酸）密碼子GAG被UCG（絲氨酸）代替；第166位氨基酸（精氨酸）密碼子CGC被GCC（丙氨酸）代替。

表2 本研究所用引物

1.2.2 重組表達載體構建和轉化 按照文獻［16-18］的方法，進行重組表達載體的構建和轉化。用BamH I和Sal I分 別 對pEASY-Blunt-clpxooD70A、pEASYBlunt-clpxooE99S、pEASY-Blunt-clpxooR166A和蛋白表達載體pCold-SUMO進行雙酶切，利用T4連接酶在16℃條件下過夜連接，通過熱激法將連接產物轉化到E. coli感受態細胞BL21中，涂布Amp抗性平板，對篩選的轉化子進行質粒提取、酶切和測序驗證，得到陽性克隆pCold-SUMO-clpxooD70A、pCold-SUMO-clpxooE99S、pCold-SUMO-clpxooR166A。

1.2.3 蛋白表達、純化和驗證 按照文獻［16，19］的方法，進行蛋白表達和純化。通過調整IPTG濃度、誘導時間、咪唑洗脫液濃度，對點突變蛋白ClpxooD70A、ClpxooE99S、ClpxooR166A的誘導表達和純化條件進行了優化。挑取E. coli BL21菌落接種至LB（100 μg/mL Amp）培養基，37℃ 200 r/min劇烈振蕩培養至OD600為 0.6-0. 8。將培養液冷卻至15℃，靜置30 min，加入終濃度0.5 mmol/L或1 mmol/L IPTG，在15℃下誘導16 h或24 h。離心（4 000×g、15 min、室溫）收集菌體，重懸細胞，置于冰上進行超聲破碎 5 min，離心（10 000×g、30 min、4℃）取上清，經 SDS-PAGE 凝膠電泳和考馬斯亮藍染色，檢測蛋白的表達。

1.2.4 ITC試驗 參照文獻［12，13，20］報道以及等溫滴定量熱儀操作說明，進行ITC試驗操作。用超純水和滴定緩沖液進行清洗。量熱池內注滿30 μmol/L Clpxoo野生型蛋白或者點突變蛋白，滴定針內為60 μL的300 μmol/L c-di-GMP溶液，設置每2 μL一滴，間隔100 s，1 000 r/min拌速率進行滴定，記錄熱量和變化。滴定試驗需重復3次，使用軟件MicroCal ORIGIN version 7.0進行數據分析。

2 結果

2.1 Clpxoo蛋白定點突變、原核表達和產物純化

2.1.1 原核表達載體的構建、轉化和誘導表達 通過PCR擴增，成功引入點突變，獲得點突變的目的片段。將目的片段進行測序，通過與NCBI上的序列進行比對發現基因序列在定點的位置成功發生了突變。將點突變的目的片段連接到pCold-SUMO的相應的BamHⅠ和SalⅠ酶切位點后成功獲得重組表達質粒pCold-SUMO-clpxooD70A、pCold-SUMO-clpxooE99S、pCold-SUMO-clpxooR166A。 經BamHⅠ 和SalⅠ酶切驗證，得到大小約為700 bp的片段，與預期結果一致（圖1）。將重組質粒轉化至 E. coli 表達菌株 BL21感受態細胞中，在優化的誘導表達條件（在菌液濃度 OD600=0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG、15℃下誘導16 h）下，得到了大小為45 kD的融合蛋白（加上N端的SUMO和His 6標簽），其中點突變蛋白ClpxooD70A和ClpxooE99S以可溶形式在上清中大量表達，而ClpxooR166A則發生了嚴重的

降解現象（圖2-A）。隨后不同上樣量（5、10和15 μL）的SDS-PAGE分析也可以驗證ClpxooR166A降解成多個條帶（圖2-B）。因此，由于ClpxooR166A的降解，便采用ClpxooD70A和ClpxooE99S做蛋白純化以及后續的ITC試驗研究。

圖1 點突變clp基因原核表達載體酶切驗證

2.1.2 蛋白的純化和驗證 用不同濃度的咪唑緩沖液（100 mmol/L、200 mmol/L）對鎳柱蛋白進行洗脫，發現使用200 mmol/L咪唑洗脫效率高，可獲得高純度的可溶性點突變蛋白（圖2-C）。經過Bradford 法測定點突變蛋白濃度約為2 mg/mL。

圖2 Clpxoo和點突變體蛋白誘導表達以及純化蛋白的SDS-PAGE分析

2.2 Clpxoo和點突變蛋白與c-di-GMP結合檢測

在ITC試驗過程中，通過數據處理軟件轉化計算，得到Clpxoo蛋白與c-di-GMP發生結合比例為N=0.92±0.03，解離常數Kd=（1.64±0.17）μM（圖3-A），而點突變蛋白ClpxooD70A沒有與c-di-GMP發生結合反應（圖3-B）；點突變蛋白ClpxooE99S與c-di-GMP發生結合比例為N=0.919±0.12，解離常數Kd=（23.9±18.1）μM（圖3-C）。通過比較解離常數可以得知，ClpxooE99S與c-di-GMP結合的解離常數大約是Clpxoo與c-di-GMP的15倍。所以與Clpxoo蛋白相比，ClpxooE99S與c-di-GMP的結合能力大大降低。因此，當Clpxoo蛋白的第70位天冬氨酸突變后，點突變蛋白ClpxooD70A喪失了與c-di-GMP結合的能力；當第99位谷氨酸突變后，點突變蛋白ClpxooE99S減弱了與c-di-GMP結合的能力。

圖3 ITC檢測蛋白與c-di-GMP的結合反應

3 討論

目前被研究清楚的是存在于綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）中的一類轉錄調控蛋白FleQ，而且研究表明FleQ也是小分子第二信使c-di-GMP的受體蛋白［21，22］。有研究表明，屬于CRP/ FNR家族蛋白的轉錄調控因子通常會受到小分子效應因子如cAMP、c-di-GMP、O2等的影響［23，24］。其中，小分子第二信使c-di-GMP可以與受體蛋白Clpxoo結合來影響轉錄調控因子Clpxoo對下游基因表達的調控，最終影響Xoo細菌的生理進程［2］。然而，作為c-di-GMP信號受體蛋白的Clpxoo轉錄調控靶基因的機制并不清楚。因此，本研究通過確定轉錄調控因子Clpxoo與c-di-GMP結合的關鍵功能位點，來揭示調控蛋白Clpxoo與小分子c-di-GMP的結合特征，并為進一步闡明c-di-GMP介導下的Clpxoo調控基因的機制奠定基礎。

本研究通過對Clpxoo蛋白的關鍵氨基酸位點進行定點突變，原核表達載體構建和轉化、蛋白誘導表達純化和驗證，在優化的誘導表達條件下，成功獲得了大量的Clpxoo點突變蛋白，為后續ITC試驗確定水稻白葉枯病菌c-di-GMP受體Clpxoo關

鍵功能位點的確定做準備。為了驗證Clpxoo蛋白第70位天冬氨酸、第166位精氨酸和第99位谷氨酸突變后是否會對蛋白的表達純化有影響，本研究首先優化了點突變蛋白的表達純化條件。設置了0.5 mmol/L、1 mmol/L終濃度的IPTG，以及 100 mmol/L、200 mmol/L的咪唑洗脫濃度，發現點突變蛋白在經0.5 mmol/L終濃度IPTG的誘導下表達量最高，經200 mmol/L濃度的咪唑洗脫效率最高。此外，對ITC試驗中蛋白與小分子c-di-GMP的比例進行了摸索，最終確定了最佳的點突變蛋白和c-di-GMP的摩爾比為1∶10，即點突變蛋白為30 μmol/L，小分子c-di-GMP為300 μmol/L。將Clpxoo蛋白第166位的精氨酸突變成丙氨酸后，點突變蛋白會發生嚴重的降解現象，而且隨著蛋白放置時間變長降解現象加劇。氨基酸位點的突變后會使蛋白發生降解，說明此位點對于蛋白的穩定性至關重要。而在前期對Clpxcc與c-di-GMP關鍵結合位點的研究中并沒有對點突變蛋白降解的報道。因此，Clpxoo蛋白第166位精氨酸突變成丙氨酸后發生降解的機制有待于進一步試驗研究。

通過ITC試驗分析，發現與Clpxoo蛋白相比，將第70位天冬氨酸突變后，ClpxooD70A蛋白無法與c-di-GMP結合；第99位谷氨酸突變成絲氨酸后，ClpxooE99S蛋白與c-di-GMP的結合能力大大減弱。表明在Clpxoo蛋白的許多氨基酸中，第70位天冬氨酸和第99位谷氨酸都是Clpxoo的關鍵功能位點。本研究獲得的不結合c-di-GMP的點突變體D70A和結合能力降低的點突變體E99S，為今后利用EMSA技術研究c-di-GMP對Clpxoo與目的基因啟動子結合的影響奠定了基礎。

4 結論

Xoo的轉錄調控因子Clpxoo蛋白中第70位天冬氨酸D和第99位谷氨酸E是Clpxoo與c-di-GMP結合的關鍵功能位點。

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（責任編輯 馬鑫）

Identification of Critical Residues in c-di-GMP Receptor Clpxoo from Xanthomonas oryzae pv. oryzae

LI Jian-yu LI Bo CHEN Hua-min YANG Feng-huan HE Chen-yang TIAN Fang
（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

The purpose of this study is to identify the critical residues in Clpxoo of a c-di-GMP signal receptor in Xanthomonas oryzae pv. oryzae（Xoo）. By the gene mutation of amino acid site of Clpxoo protein，the construction of expressing vector，induced protein expressed，and analysis of Ni-NTA Resin affinity chromatography，the prokaryotic expression of Clpxoo and point mutants was conducted and the protein was purified.. The binding affinities of c-di-GMP with native and variant Clpxoo were measured by isothermal titration calorimetry（ITC）experiments. Under optimized conditions for protein expression and purification，the proteins of Clpxoo point mutants and point mutants of Clpxoo that does not bind with c-di-GMP were acquired successfully while using gene site-directed mutagenesis and bridging PCR. Results showed that site 70 of aspartic acids and site 99 of glutamic acid were found to be the key residues for their binding to c-di-GMP.

Xanthomonas oryzae pv. pryzae；c-di-GMP；signal receptor protein；point mutant；binding affinity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.020

2016-05-04

國家自然科學基金項目（31100947），北京市自然科學基金項目（5142017）

李建宇，男，碩士，研究方向：分子植物病理學；E-mail：lijianyugood@126.com

田芳，女，博士，研究方向：分子植物病理學；E-mail：ftian@ippcaas.cn