不同Ca2+濃度養殖環境下三角帆蚌外套膜和內臟團組織鈣調蛋白基因的表達

尚朝施楊李文娟周子睿施志儀

（1. 上海海洋大學水產與生命學院 農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306；2. 上海市食品研究所，上海 200235）

不同Ca2+濃度養殖環境下三角帆蚌外套膜和內臟團組織鈣調蛋白基因的表達

尚朝1施楊2李文娟1周子睿1施志儀1

（1. 上海海洋大學水產與生命學院 農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306；2. 上海市食品研究所，上海 200235）

為了探索鈣調蛋白基因（CaM）在淡水貝類珍珠形成中的作用，研究0、0.5、1.25、2和3 mmol/L 5個不同Ca2+濃度水環境下養殖三角帆蚌，并在插核后的0、20、50、90和120 d對外套膜和內臟團組織采樣，采用熒光定量方法檢測組織CaM表達量。結果表明：（1）在不同Ca2+濃度中，CaM基因外套膜和內臟團組織在0 mmol/L Ca2+濃度下始終處于過低表達水平；0.5 mmol/L濃度下先降低后升高并維持穩定；1.25 mmol/L濃度下在20 d內臟團出現降低，之后升高至0 d水平并保持穩定；在2 mmol/L濃度下表達量在20 d時顯著上升達到各濃度中最高后保持高表達量狀態；3 mmol/L濃度下在插核后20 d表達量升高，之后時期表達量開始不斷降低（P＜0.05）。（2）在插核后不同天數中，0 d各濃度表達差異不明顯；之后各天數的表達出現明顯差異。（3）相同條件養殖下，內臟團CaM基因表達量高于外套膜。研究發現，0.5 mmol/L和2 mmol/L Ca2+濃度會促進CaM基因的表達，但0 mmol/L和3 mmol/L的濃度則會抑制CaM基因的表達。內臟團部位更有利于珍珠的形成。

三角帆蚌；鈣調蛋白；鈣濃度；內臟團；外套膜

鈣調蛋白（Calmodulin protein，CaM）是生物體中的多功能調節蛋白，廣泛存在于所有的真核細胞中，是生物體最豐富的Ca2+結合蛋白，參與調節離子轉運、細胞鈣代謝、防御反應等重要的生理過程［1］。珍珠由CaCO3和基質蛋白等有機質組成，其中絕大多數成分為CaCO3。珍珠的形成是貝類Ca2+吸收、轉運、貯存和分泌等代謝活動的過程［2，3］，受到CaM等多個調節因子調控［4，5］。CaM被廣泛認為是涉及到珍珠形成的關鍵蛋白。在合浦珠母貝（Pinctada fucata）中，CaM可以通過和16 kD珍珠層基質蛋白的結合誘導CaM文石晶體的成核，又可以調節棱柱層方解石晶體的的生長，參與貝殼損傷的修復［6，7］。

三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）作為我國重要的淡水育珠蚌，具有生長速度快，育珠質量好的特點［8］。研究表明，三角帆蚌的外套膜和內臟團均可作為插核手術部位進行珍珠培育［9］。兩個部位各具優勢，外套膜培育出的珍珠光澤度和圓潤度好，而內臟團分布空間大，更適宜培育大顆粒的珍珠［10］。但是，珍珠形成過程中重要的鈣代謝相關基因在育珠部位的表達差異鮮有報道。有研究表明，在淡水貝類中，適當增加鈣的供應能夠提高貝類CaCO3的沉積［11］，然而其調節機制仍不清楚。本研究對三角帆蚌外套膜和內臟團部位分別進行插核手術后，飼養于不同鈣離子濃度水環境下，在不同養殖時期進行采樣，探究CaM基因在不同插核部位及不同鈣離子濃度下的表達變化，旨在探索CaM在淡水貝類珍珠形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

三角帆蚌取自上海海洋大學濱海養殖基地，選取體長均一，個體差異較小的2齡三角帆蚌75只。在實驗室中暫養兩周后，對三角帆蚌外套膜和內臟團部位進行插核手術。

插核手術使用的珠核經貝殼打磨而成，手術之前將珠核進行高壓滅菌干燥。清洗實驗蚌外殼泥土和藻類，插核前將其離水放置30-60 min，減弱實驗蚌的活力，降低應激反應。手術器械經75%酒精消毒后，將蚌置于手術架上，腹緣朝上。在蚌的偏后端腹緣部位，用開殼器將蚌開口，并用U型架支撐。在每只實驗蚌的外套膜和內臟團靠近性腺前端部位分別插入直徑為2.5 mm的珠核，并將制作好的外套膜小片貼在珠核上。取下U型架，插核手術完成。

將插核后的75只實驗組三角帆蚌隨機分成5組，每組15只。本校公共實驗樓取的去離子水作為水源，使用CaCl2·2H2O作為外源鈣源，采用EDTA滴定法分別將5個水缸中的Ca2+濃度調節至0、0.5、1.25、2和3 mmol/L，其余實驗條件相同。將5組三角帆蚌養于5個不同濃度的水缸中。每周定期用豆漿進行投喂，定期調節水缸中Ca2+濃度。

三角帆蚌插核后養殖5 h，從每個濃度中取出3只三角帆蚌，對其進行外套膜和內臟團插核部位采樣，作為插核后0 d樣品組織。之后在插核后第20、50、90和120天分別取出3只三角帆蚌進行外套膜和內臟團采樣。采樣前將實驗所需器材進行滅菌除酶。首先切斷其閉殼肌，快速取出三角帆蚌插核位點處的外套膜和內臟團組織置于裝有Trizol（Invitrogen，美國）的除酶離心管中，供后續繼續進行總RNA提取實驗。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取、檢測與反轉 將Trizol（Invitrogen，美國）中的各個時期不同Ca2+濃度的外套膜和內臟團組織，按照試劑說明書的方法進行總RNA提取。提取完畢后，用Nanodrop 2000C（Thermo Fisher Scientific，美國）分光光度儀檢測其純度和濃度，用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

按照M-MLV Reverse Transcriptase（Promega，北京）的操作要求進行反轉錄實驗實驗，反轉錄成cDNA。

1.2.2 基因mRNA水平測定 根據NCBI上公布的三角帆蚌β-actin基因（HM045420）序列設計定量引物：β-actin F（TCAACCCTAAAGCCAACA）β-actin R（TCTCTACCTGCCAAGTCAA）。CaM基因（HM-483521.1）定量引物：CaM F（TTCAAGGAGGCATTCAGC）和CaM R（TTACCATCGGCATCCACT）。

熒光定量采用CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System（Bio-Rad，美國）平臺進行實驗。首先進行目的基因和內參基因（β-actin）的標準曲線實驗，然后進行目的基因的定量實驗。反應

體系為20 μL，包括10 μL 的 2×iQTMSYBR Green Supermix（Bio-Rad，美國）、1.0 μL cDNA、上下游引物各0.5 μL和8.0 μL dH2O。反應條件為 95℃預變性 1 min；95℃ 10 s，60℃ 15 s和72℃ 20 s，采集熒光40次，72℃ 7 min，反應終止，添加溶解曲線生成程序：95℃ 到 60℃ 每降 0.5℃（5 s）采集一次熒光。實驗結束后，用溶解曲線分析產物專一性，結果用2-ΔΔCt法進行初步數據統計分析。實驗結果中R值均大于0.9，相應的擴增效率（E）均在 95%-100%之間。

然后數據采用 SPSS 16.0軟件中的One-Way 方差分析（ANOVA），使用Dunnett's T multiple comparisons 進行相對表達分析，P＜0.05 表示存在顯著性差異。

2 結果

2.1 不同Ca2+濃度養殖下外套膜和內臟團組織CaM基因的表達

觀察插核后0、20、50、90和120 d在不同Ca2+濃度養殖下CaM基因表達的變化，結果如圖1、圖2和圖3所示。

由圖1可以看出，插核0 d在外套膜中CaM基因表達量沒有顯著差異，內臟團中CaM基因表達量也沒有顯著差異（P＞0.05）。而內臟團表達量明顯高于外套膜表達量（P＜0.05）。插核后20 d，各濃度培養下的表達量差異明顯。0 mmol/L Ca2+濃度在外套膜和內臟團中CaM基因表達量明顯低于其他濃度（P＜0.05）。外套膜中，0.5 mmol/L Ca2+濃度與0 mmol/L濃度情況下表達量無顯著差異（P＞0.05）；濃度升高后，在1.25 mmol/L Ca2+濃度時表達量明顯高于0.5 mmol/L；2 mmol/L、3 mmol/L Ca2+濃度時表達量都高于1.25 mmol/L（P＜0.05），但2 mmol/L和3 mmol/L并無差異（P＞0.05）。內臟團中，0.5 mmol/L Ca2+濃度相比0 mmol/L表達量已經表現出顯著升高；2 mmol/L Ca2+濃度時CaM基因表達量高于1.25 mmol/L濃度；而3 mmol/L Ca2+濃度表達量較2 mmol/L出現明顯下降的情況（P＜0.05）。

圖1 插核后0 d（A圖）、20 d（B圖）不同Ca2+濃度對三角帆蚌外套膜和內臟團中CaM基因表達的影響

圖2中，在插核后50 d，0 mmol/L Ca2+濃度時相較其他濃度CaM基因表達量明顯最低；而2 mmol/L Ca2+濃度時相較其他濃度CaM基因表達量明顯最高（P＜0.05）。在外套膜中，0.5 mmol/L、1.25 mmol/L和3 mmol/L Ca2+濃度表達量互相之間沒有明顯變化（P＞0.05）。而內臟團中，0.5 mmol/L和3 mmol/L Ca2+濃度時表達明顯相差不大，但是明顯低于1.25 mmol/L時的表達量（P＜0.05）。插核后90 d，在外套膜中表達趨勢和插核后50 d相似。在內臟團中，0.5 mmol/L Ca2+濃度明顯高于0 mmol/L、1.25 mmol/L和3 mmol/L時的表達量；而2 mmol/L時表達量還是明顯高于其他濃度表達量（P＜0.05）。

圖2 插核后50 d（A）、90 d（B）不同Ca2+濃度對三角帆蚌外套膜和內臟團中CaM基因表達的影響

在圖3中，插核后120 d在外套膜和內臟團中，0 mmol/L和3 mmol/L Ca2+濃度較1.25 mmol/L CaM基因顯著降低；而2 mmol/L Ca2+濃度表達量較1.25 mmol/L時表達量顯著升高（P＜0.05）。在外套膜中，0.5 mmol/L Ca2+濃度表達量明顯升高（P＜0.05），而內臟團中，0.5 mmol/L Ca2+濃度時表達沒有顯著變化（P＞0.05）。

圖3 插核后120 d不同Ca2+濃度對三角帆蚌外套膜和內臟團中CaM基因表達的影響

2.2 不同插核天數外套膜和內臟團組織CaM基因的表達

分析三角帆蚌0、0.5、1.25、2和3 mmol/L Ca2+濃度下培養下，每個濃度中不同插核后天數的CaM基因表達變化，結果如圖4、圖5和圖6所示。

圖4 0 mmol/L Ca2+濃度（A）、0.5 mmol/L Ca2+濃度（B）在不同插核天數后三角帆蚌外套膜和內臟團中CaM基因表達

如圖4所示，在0 mmol/L Ca2+濃度下培養，外套膜和內臟團中CaM基因表達量在插核后20 d出現顯著降低，50 d時相較于20 d表達量明顯升高，但仍低于0 d時表達量（P＜0.05）；90 d時相比于50 d有顯著降低，120 d時繼續降低，出現最低表達量。在0.5 mmol/L Ca2+濃度下培養，外套膜中CaM基因表達量在插核后20 d出現顯著降低，50 d時相較于20 d表達量明顯升高，但仍低于0 d時期表達量，在之后時間繼續升高，90 d時明顯高于0 d表達量（P＜0.05），120 d時相比90 d無顯著變化（P＞0.05）。在內臟團中，CaM基因表達量在插核后20 d時并無顯著變化（P＞0.05），在第50 d時相比之前時期顯著降低，在插核后90 d較0 d時期顯著升高（P＜0.05），

120 d時與90 d表達量無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 1.25 mmol/L Ca2+濃度（A）、2 mmol/L Ca2+濃度（B）在不同插核天數后三角帆蚌外套膜和內臟團中CaM基因表達

圖6 3 mmol/L Ca2+濃度在不同插核天數后三角帆蚌外套膜和內臟團中CaM基因表達

從圖5中可以看出，在1.25 mmol/L Ca2+濃度下培養，外套膜中CaM基因表達量在各時期無顯著變化（P＞0.05）。內臟團在插核后20 d表達量出現降低情況（P＜0.05），之后時期又上升至與0 d無顯著差異（P＞0.05）。在2 mmol/L Ca2+濃度下培養，外套膜和內臟團都在插核后20 d時CaM基因表達量顯著增加（P＜0.05），之后各時期保持高表達量并且無顯著差異（P＞0.05）。

根據圖6可以看出，在外套膜中CaM基因表達量在插核后20 d顯著增高；在50 d時表達量下降到與0 d無顯著差異；插核后90 d，繼續下降，較50 d顯著降低（P＜0.05）；120 d與90 d無顯著變化（P＞0.05）。在內臟團中CaM基因表達量在插核后20 d出現明顯升高，之后時間內表達量不斷下降，50 d比20 d顯著降低，90 d比50 d顯著降低（P＜0.05），直到插核120 d時，表達量與90 d無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

Ca2+作為第二信使參與動物的各種生理活動，不同濃度Ca2+對淡水貝類的生長率、繁殖能力、珍珠沉積率都有影響，密切關系著貝類的生理狀態［12］。貝類體內Ca2+的一系列生理活動，如吸收、貯存、轉運、分泌等都受到機體復雜并嚴格的調控，參與調控的蛋白眾多并發揮著不同的作用［13］。

分析GenBank中已有的三角帆蚌CaM基因的全長序列（HM483521）［14］可以得到，CaM基因中含有的4個EF-hand結構域。EF-hand結構域是常見的Ca2+結合結構域高度保守，在生物礦化過程，如Ca的運輸、肌肉收縮、信號轉導等過程中起著重要的作用［15，16］。貝類的EFhand蛋白能通過調控Ca代謝，從而調節珍珠質的形成，是CaCO3晶體形成珍珠質的有機成分之一［17］。有研究表明該基因可能是珍珠形成過程中一個重要的調節因子［18］，貝類的EFhand蛋白也具有與脊椎動物EF-hand蛋白類似的功能［19］。

3.1 不同Ca2+濃度養殖下外套膜和內臟團組織CaM基因的表達

有研究表明，三角帆蚌育珠過程中，Ca2+的代謝具有明顯的變化波動［20］。0 mmol/L Ca2+濃度各個時期表達量較其他Ca2+濃度都表現出顯著降低，CaM基因在0 mmol/L Ca2+濃度下，外套膜和內臟團

由于Ca2+缺乏嚴重而都表現出顯著下降趨勢，之后時期因為鈣代謝無法正常進行而保持著極低的表達量［21］。2 mmol/L Ca2+濃度各個時期表達量較其他Ca2+濃度都表現出顯著升高，在Ca2+含量適當高于自然淡水水體（1.0 mmol/L-1.3 mmol/L）的情況下，Ca2+起到了促進了的作用［22，23］，此時CaM基因表達量最高。3 mmol/L Ca2+濃度時相較于2 mmol/L Ca2+濃度CaM基因表達量明顯降低，這說明CaM基因表達量不會隨著Ca2+濃度不斷升高而一直升高，Ca2+濃度超過一定程度不僅不會增加表達量，反而會降低。由此可以看出，Ca2+濃度影響著CaM基因的表達。

圖1中，由于插核后在不同Ca2+濃度下養殖5 h就對其采樣，以作為0 d樣品與其他時期比較。此時，CaM基因受Ca2+濃度影響較小，所以表達量幾乎無差異。0.5 mmol/L Ca2+濃度在低于1.25 mmol/L Ca2+濃度情況下，CaM基因表達量依然出明顯增加，推測CaM基因需要更多表達來促進較低Ca2+濃度下Ca的吸收。

3.2 不同插核天數外套膜和內臟團組織CaM基因的表達

由圖4可以看出，0 mmol/L Ca2+濃度養殖下，整體呈明顯下降趨勢。在0.5 mmol/L Ca2+濃度培養下，外套膜和內臟團都出現了CaM基因表達量先降低再顯著升高的趨勢，在插核后90 d和120 d表達水平明顯高于0 d時期。0.5 mmol/L Ca2+濃度低于正常淡水水體中Ca2+濃度［23］，而插核后期的表達量升高，推測在長期Ca2+缺乏的情況下，為了調節機體的鈣離子的平衡，以穩定機體的正常Ca代謝，機體內需要補充更多的Ca2+，此時會促進CaM基因的表達來適應低濃度Ca2+的生活，以穩定機體的正常Ca代謝［24］，證明了CaM基因在Ca2+的重要作用。在1.25 mmol/L Ca2+濃度培養下，可以看出，外套膜表現比較穩定，各時期沒有顯著差異。

0 mmol/L、1.25 mmol/L Ca2+濃度下，對比插核后20 d和50 d發現內臟團都出現了短期內的表達量升高情況，有研究表明，研究表明三角帆蚌進行內臟團插核手術后，傷口需要20 d左右時間進行修復愈合［25］。推測三角帆蚌在插核后20 d還處于機體修復期，三角帆蚌尚未恢復活力，且免疫活力較高，CaM基因表達受到抑制［26，27］，后期機體修復完成后機體為獲取所缺失的鈣，CaM基因較平時表達量增加。但在0 mmol/L Ca2+濃度養殖下短期增加后由于長期處于缺乏Ca而完全得不到補充，CaM基因無法正常表達而不斷降低。

在圖5中可以發現，2 mmol/L Ca2+濃度培養下，插核后CaM基因的表達量在插核后20 d已經顯著升高。但是，在插核20之后的各個時期表達沒有顯著變化。由此可見，在適當的高Ca2+濃度下，會刺激鈣的代謝使CaM基因的表達量迅速升高［14］，但是促進作用到達一定程度后CaM基因會在一個高表達量狀態保持穩定，并沒有出現持續性的增長。

在3 mmol/L Ca2+濃度下（圖6），外套膜和內臟團表達量都出現先升高再降低的趨勢，在插核后90 d和120 d，表達量甚至低于0 d。可以看出，Ca2+濃度在超過一定范圍后，機體內Ca2+濃度過飽和鈣代謝出現紊亂［28］，出現抑制CaM基因表達的情況。

通過上述分析可以看出，CaM基因在一定Ca2+濃度范圍內，低濃度表達量升高，過高濃度表達量降低，通過自身基因表達水平的改變來維持體內Ca代謝的穩定。

3.3 外套膜和內臟團組織CaM基因表達分析

總結所有CaM基因表達水平變化可以看出，外套膜中CaM基因表達量都顯著低于相應時期和濃度下內臟團表達量（P＜0.05）。這與內臟團插核部位有關，本實驗內臟團插核所在位置為靠近性腺部前端，珠核緊貼性腺。推測因為三角帆蚌性腺中含有大量的Ca2+［29］，組織之間進行比較，Ca含量更為豐富的內臟團比外套膜部位更具優勢。此外，內臟團組織相比外套膜，結構更加復雜，功能更加完善，Ca2+濃度發生改變時，對內臟團的影響較?。?0］。

綜上所述，本研究針對三角帆蚌珍珠形成過程中的關鍵蛋白鈣調蛋白進行不同Ca2+濃度養殖，檢測不同時期外套膜和內臟團的表達量進行研究。研究發現Ca2+濃度和CaM之間相互作用，在不同Ca2+濃度下CaM基因表達會有不同的變化，適當升高Ca2+濃度對CaM基因表達起促進作用，濃度過高和過低都會造成表達量降低，引發機體的鈣代謝紊亂。

內臟團表達量整體高于外套膜，鈣代謝水平升高，更有利于珍珠沉積［31］，但其在珍珠質沉積的作用還有待進一步深入研究。

4 結論

本實驗研究了不同Ca2+濃度養殖環境下，檢測了三角帆蚌CaM在外套膜和內臟團中的表達變化。研究發現，適當升高（2 mmol/L）和降低（0.5 mmol/L）Ca2+濃度都會促進CaM基因的表達，但過低（0 mmol/L）和過高（3 mmol/L）的濃度則會抑制CaM基因的表達。相同條件下，內臟團CaM基因表達量高于外套膜，更有利于珍珠的形成。

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（責任編輯 狄艷紅）

Expressions of Calmodulin Gene in Hyriopsis cumingii Mantle and Visceral Tissues Under the Culture Environment with Different Ca2+Concentrations

SHANG Chao1SHI Yang2LI Wen-juan1ZHOU Zi-rui1SHI Zhi-yi1

（1. Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources of Ministry of Agriculture，College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；2. Shanghai Institute of Food Research，Shanghai 200235）

In order to explore the role of calmodulin（CaM）gene in the formation of freshwater mussel，Hyriopsis cumingii was cultured in water environment at 5 different Ca2+concentrations of 0 mmol/L，0.5 mmol/L，1.25 mmol/L，2 mmol/L，and 3 mmol/L. At 0 d，20 d，50 d，90 d，and 120 d after nucleus inserted，mantle and visceral were sampled，then the CaM expressions in the tissues were detected using fluorescent quantitative PCR. The results showed that：1）The expression level of CaM gene in mantle and visceral mass were always low at 0 mmol/L Ca2+concentration，decreased and then increased and remained stable at 0.5 mmol/L，decreased at the 20 d in visceral mass，then rose to level at 0 d and remain stable at 1.25 mmol/L，significantly increased at 20 d，reached the highest which was maintained at 2 mmol/L among all 5concentrations，increased at 20 d after nucleus inserted，and decreased in the later period（P ＜ 0.05）at 3 mmol/ L. 2）There was no obvious difference among different concentrations at 0 d，and the expressions differentiated along different days after 0 d. 3）Under the same culture conditions，the expression of CaM gene in visceral mass was higher than that in mantle. It was found that the concentration of 0.5 mmol/L and 2 mmol/L promoted the expression of CaM gene，but the concentration of 0 mmol/L and 3 mmol/L inhibited the expression of CaM gene. Visceral mass was more conducive to the formation of pearl.

Hyriopsis cumingii；calmodulin；calcium concentration；visceral mass；mantle

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.024

2016-04-05

國家自然科學基金項目（31201991），教育部博士點基金（20123104120003），上海市優青項目（ssc11004）

尚朝，男，碩士研究生，研究方向：生物學；E-mail：shangchao1120@126.com

施志儀，男，教授，研究方向：生物學；E-mail：zyshi@shou.edu.cn