HSP70敲低對AD轉基因果蠅的神經保護作用

顧鳳鳴　李清華　劉開祥　郭豐寧　陳梅玲　曾愛源

摘要：目的：探討HSP70敲低（HSP70RNAi）在阿爾茨海默病（AD）發病機制中的作用。方法：利用經典的GAL4/UAS系統，選用ninaE-GAL4啟動子，將突變位點在R406W處的Tau蛋白在果蠅復眼內選擇性表達，構建ninaE-GAL4/UAS系統AD轉基因果蠅模型。然后觀察在敲低和不敲低分子伴侶HSP70表達的情況下，HSP70在AD轉基因果蠅模型中的作用。結果：HSP70RNAi明顯抑制了AD轉基因果蠅模型的復眼視網膜光感受神經元變性。結論：HsP70RNAi對AD轉基因果蠅模型具有神經保護作用。

關鍵詞：阿爾茨海默病；Tau；HSP70；果蠅

中圖分類號：Q969.462.2 文獻標志碼：A 文章編號：1008—2409（2015）04—0001—04

AD是一種年齡相關的、不斷進展的神經退行性突病，以記憶障礙和多重認知損害為特征。隨著人類壽命的增長，AD可能成為人類健康的焦點，給個人及家庭帶來了負擔。AD患者大腦的組織病理學研究表明，突觸丟失、線粒體異常和炎性反應是其特征性表現，除此之外還有分布在大腦學習和記憶區的細胞外的淀粉樣（AB）蛋白及細胞內TAU蛋白過度磷酸化所致的神經纖維纏結（NFTs）。過度磷酸化的TAU蛋白在AD中更容易聚集，因此，降低這些TAU蛋白的水平成為治療AD的有期望的途徑。TAU蛋白的穩態通常是由分子伴侶來調控，如熱休克蛋白70。因其調節TAU蛋白穩態方面潛在的治療作用，HSP70引起了越來越多研究者的重視。細胞模型中，HSPT0的ATP酶活性抑制劑可以促進TAU蛋白的逆轉和恢復它的穩定。第一代HSP70抑制劑，如亞甲藍（MB），能提高TAU蛋白病小鼠模型的學習和記憶能力。本研究探討HSP70RNAi對AD的作用，采用遺傳干預使HSP70RNAi在ninaE-GAIA/UAS系統的AD轉基因果蠅模型視網膜光感受神經元中表達，觀察HSP70RNAi對AD轉基因果蠅模型是否具有保護作用。

1材料與方法

1.1材料

果蠅品系：w1118、ninaE-GAL4購自美國Bloomington果蠅中心；模型UAS-hTauR406W購自美國哈佛大學；雙平衡系果蠅sco/CyO；TM3/TM6由中南大學醫學遺傳學國家重點實驗室惠贈；HSP70RNAi由清華大學惠贈。

1.2方法

1.2.1果蠅雜交

1.2.1.1構建w1118/+；ninaE-GALA/+的果蠅

將w1118的處女蠅與ninaE-GAIA的雄性果蠅雜交，收取F1代，即基因型為wlll8/+；ninaE-GAIA/+的目的果蠅。即正常對照果蠅。

1.2.1.2構建ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/+的果蠅將ninaE-GAIA處女蠅與UAS-hTauR406W雄性果蠅雜交即得到ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/+果蠅。

1.2.1.3構建HSP70RNAi對AD轉基因模型干預的果蠅將ninaE-GAIA處女蠅與sco/CyO；TM3/TM6雄性果蠅雜交，構建基因型為ninaE-GAL4/sco；+/TM3的果蠅；同時將UAS-hTauR406W處女蠅與sco/CyO；TM3/TM6雄性果蠅雜交，構建基因型為+/CyO；UAS-hTauR406W/TM6的果蠅；再將ninaE-GAIA/sco；+/TM3的處女蠅與+/CyO；UAS-hTauR406W/TM6雄性果蠅雜交，篩選卷翅且短剛毛的子代，即基因型為ninaE-GAIA/CyO；UAS-hTauR406W/TM3的目的果蠅。再將HSP70RNAi的處女蠅與ninaE-GAIA/CyO；UAS-hTauR406W/TM3的雄性果蠅雜交，篩選基因型為ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi的目的果蠅。即ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi的果蠅。

1.2.2數據采集

1.2.2.1觀察果蠅復眼形態并拍照 用奧林巴斯體視顯微鏡觀察第7天的雄性目的果蠅復眼結構。

1.2.2.2應用試劑盒檢測線粒體三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）濃度取第7天的w1118/+；ninaE-GAL4/+果蠅（正常對照組），ninaE-GAL4/+；UAS-hTauR406W/+果蠅（疾病模組），ninaE-GAL4/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi果蠅（基因干預組）各10只雄性果蠅，切取果蠅頭部；分別將果蠅加入0.1 LATP反應液中進行研磨，充分反應后調離心機轉速為10 000 r/min離心15 min，分別取出0.01 L上清液加入96孔板后，再分別加入0.09 LATP反應液；將標準品按一定的濃度梯度稀釋，并加入96孔板；室溫避光反應15 min后，酶標儀測定OD值；減去本底發光值，制作標準曲線；根據標準曲線計算ATP濃度，計算ATP濃度與正常對照組的百分比。

1.3統計學處理

采用SPSS 18.0統計軟件進行分析，用t檢驗。

2結果

2.1 AD轉基因果蠅模型

為鑒定AD轉基因果蠅模型，本研究分別從果蠅表型、果蠅ATP分析比較正常對照組與AD轉基因果蠅模型。結果顯示。AD轉基因果蠅模型復眼表面粗糙凹凸不平，面積較正常果蠅明顯減小，色素沉著減少。詳見圖1。AD轉基因果蠅模型與正常對照組相比較，其ATP明顯降低，t=10.544 P<0.01。詳見圖2。

2.2 HSP70RNAi對AD轉基因果蠅模型的影響

為了探討HSP70RNAi對AD轉基因果蠅模型是否有保護作用，本研究從果蠅表型、果蠅ATP分析HSP70RNAi對AD轉基因果蠅模型的影響。結果顯示HSP70RNAi對疾病模型干預后，果蠅復眼較疾病組呈現明顯的好轉，復眼表面光整，復眼面積稍增大，色素沉著加深。詳見圖3。ATP水平升高，t=-6.653，P<0.01。詳見圖4。

3討論

神經元內異常的TAU蛋白在AD的神經變性進程中起到了重要的作用。TAU是微管相關蛋白，可幫助調節神經元微管的穩定性。當TAU蛋白被異常的過度磷酸化，微管與TAU結合減少使微管不穩定，影響軸突運輸，導致NTFs聚集。一些研究表明減少TAU蛋白可能有益，而另一些研究表明TAU蛋白的完全丟失有毒性作用。TAU敲除的老鼠在特定的遺傳背景下表現正常。但是人類的MAPT（micro-tubule associated protein））基因刪除表現出嚴重的智力低下。這表明在不同的研究背景下，TAU蛋白的量不同，有可能造成截然不同的結果。人類TAU蛋白突變頻率最高的位點是R406W，將人類的R406W突變位點轉入果蠅，運用ninaE-GAL4啟動子，使R406W在果蠅復眼特異性表達，建立了AD模型。

HSP70似乎能從本質上區分功能型TAU、與微管結合的TAU和異常的游離TAU。所有的HSP70變體可以識別游離TAU是因為它的結合位點位于微管結合域。因而當TAU和微管結合，它就和HSP70分離。同時，改變TAU和微管關系的磷酸化位點已被證明影響它與分子伴侶之間的相互作用。尸檢AD患者大腦皮層發現HSP70蛋白水平增高，證明HSP70與大腦的患病區域關系密切。

研究顯示，多種神經退行性疾病存在能量代謝障礙，在阿爾茨海默病和遺傳性脊髓小腦型共濟失調等神經退行性疾病中，均發現存在能量代謝障礙。蛋白降解是一個耗能過程，ATP的生成減少必然影響到蛋白降解效率。研究表明透過血腦屏障的HSP70抑制劑，可以降低人工培育腦組織TAU蛋白水平。細胞模型中抑制HSPT0活性，導致快速的依賴蛋白酶體的TAU降解，降低了TAU水平。由此可見，HSP70與TAU的降解密切相關。為明確HSP70RNAi對AD疾病是否具有神經保護作用，筆者在ninaE-GAIA/UAS系統AD轉基因果蠅模型的光感受神經元中干擾HSP70表達，結果發現HSP70RNAi干預AD轉基因果蠅模型ninaE-GAL4/+：UAS-hTauR406W/+后，與疾病模型組比較，ninaE-GALA/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi果蠅復眼表面結構較光整，復眼面積稍增大，色素沉著加深，且ATP水平增高。

本研究表明HSP70RNAi可以抑制AD轉基因果蠅神經變性，HSP70RNAi對AD轉基因果蠅具有神經保護作用。但它的具體保護機制卻仍未可知。近年來，關于分子伴侶HSPT0的研究越來越多，除AD外，HSP70還與SCA3/MJD的毒性蛋白ataxin-3有關聯。這些研究表明HSP70在神經退行性疾病中起到舉足輕重的作用。除作為分子伴侶外，HSP70是否還有其他功能？是杏會啟動其他路徑來進行蛋白降解？這些都需要進一步驗證。總之，本研究發現了HSP70RNAi對AD的神經保護作用。這將為今后的基因及藥物治療提供一個很好的方向。