磁性修飾的工程酵母吸附水中銀離子研究

陶虎春 崔曉冰 李金波 石剛

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磁性修飾的工程酵母吸附水中銀離子研究

陶虎春?崔曉冰 李金波 石剛

北京大學深圳研究生院環境與能源學院, 深圳市重金屬污染控制與資源化重點實驗室, 深圳 518055; ? E-mail: taohc@pkusz.edu.cn

采用水基磁性Fe3O4納米顆粒修飾表面展示CueR蛋白的釀酒酵母(), 獲得磁響應性能良好的磁修飾工程酵母細胞。傅里葉變換紅外光譜分析表明, 磁修飾細胞較好地保留了工程酵母細胞和磁性材料的官能團。研究吸附動力學、等溫吸附模型以及不同因素(如時間、溫度和 pH 值)對磁修飾細胞吸附Ag+的影響, 結果表明, 磁修飾酵母對 Ag+的吸附速率很快, 18分鐘基本上達到吸附平衡; 最適宜吸附溫度為20~30℃; 最佳吸附pH值等于 7。磁修飾酵母對Ag+的吸附符合準一級動力學模型和Langmuir等溫吸附模型。多金屬等摩爾濃度競爭條件下的吸附結果表明, 磁修飾后的工程酵母對Ag+仍具有選擇吸附性, Ag+的吸附量為Ni2+的10.6倍, Zn2+的9.0倍, Co2+的7.5倍, Cu2+的3.0倍。

磁修飾; 工程酵母; 銀離子; 選擇性吸附; 磁分離

隨著工業的迅猛發展, 大量的重金屬廢水排入環境中, 造成嚴重的污染問題。廢水中的銀主要來源于化工、電子、感光材料和電鍍等行業[1], 自由態的銀離子毒性很強, 危害水生生物及人體健 康[2]。此外, 銀屬于貴金屬, 具有較高的經濟價值。因此, 對工業廢水中銀離子進行去除、富集和回收, 具有環境保護和資源利用的雙重意義。

重金屬廢水的處理方法包括化學沉淀、活性炭吸附、離子交換和電滲析等[3–4]。相較于傳統的物理化學處理方法, 微生物吸附法因其高效、廉價、環保以及在低濃度情況下去除效果良好等優點, 受到廣泛關注[5–7]。國內外學者對微生物吸附劑進行基因工程改造, 大大提高了吸附效率[8–9]。但是, 游離和懸浮微生物的體積小, 機械強度低, 處理后的生物體與出水難以分開, 成為工業化進程中需要解決的問題。常用的固液分離方法包括離心、過濾、沉降和浮選等, 但存在成本高或耗時長等問題。污水處理廠利用固定床等設備可將微生物固定化, 解決固液分離困難問題, 但工藝龐大復雜, 且固液兩相接觸不充分, 難以達到最佳效果[10]。

磁分離技術具備分離迅速、操作方便等優點, 可以有效地解決這一問題。利用磁鐵礦(Fe3O4)或磁赤鐵礦(γ-Fe2O3)的納米或微米顆粒對微生物進行表面修飾, 使微生物負載上磁性, 進而利用磁場進行快速的固液分離, 可以很好地解決微生物吸附后難以與出水分離的問題[11]。同時, 進行磁性修飾后的細胞在反應的過程中可以均勻地分散在廢液中, 使兩相充分接觸, 達到良好的吸附效果。目前已有很多研究采用磁修飾微生物去除 Cu2+, U6+, Hg2+, Pb2+, Cd2+和 Ni2+等重金屬[12–17]以及水溶性染料[18–19], 實驗證明磁修飾微生物具備良好的吸附性能。

本文結合基因工程菌的吸附優勢和磁性材料的分離技術, 利用磁性 Fe3O4納米顆粒對本研究組改造所得的表面展示 CueR 蛋白釀酒酵母進行磁性修飾, 構建一種對 Ag+具有高效吸附和選擇吸附能力的磁性修飾工程菌, 在達到高效去除Ag+的前提下, 實現微生物與水溶液的快速分離。

1 材料與方法

1.1 菌種

本研究采用的菌種為表面展示 CueR 蛋白的釀酒酵母(), 由本研究組改造保存。CueR 蛋白是對 Ag+/Cu+具有選擇性識別功能的轉錄調控因子, 來源于惡臭假單胞菌。基于CueR 蛋白, 利用細胞表面工程技術對釀酒酵母進行改造強化, 構建對 Ag+具有特異性吸附的工程酵母。

1.2 主要藥品及培養基

聚烯丙基胺鹽酸鹽(Poly allylamine hydrochlo-ride, PAH), 購自 Sigma-Aldrich, 四甲基氫氧化銨溶液(Tetramethylammonium hydroxide, TMA)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司, 氯化鐵、氯化亞鐵及氨水等均為分析純級藥品。

含 2%葡萄糖的 YNB-CAA 培養基: 0.67% 無氨基酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acids, YNB), 0.5%酪蛋白氨基酸(casamino acids, CAA), 2% 葡萄糖; 含2%半乳糖的YNB-CAA培養基: 0.67% YNB, 0.5% CAA, 2%半乳糖。

重金屬測試液: 使用硝酸銀配制不同Ag+濃度和不同 pH 值的 Ag+溶液; 使用硝酸銀、硝酸銅、硝酸鋅、硝酸鎳和硝酸鈷配制多金屬混合溶液。上述所有重金屬溶液均溶于 50 mmol/L HEPES 緩沖液中。溶液 pH 值使用 0.1 mol/L NaOH 和 0.1 mol/L HNO3調節。

1.3 菌懸液制備

挑取轉化成功后的釀酒酵母菌株于含2%葡萄糖的YNB-CAA液體培養基中, 30 ℃振蕩培養過夜, 當菌懸液的 OD600值在 2 ~ 5 之間時, 將菌體轉移至含2%半乳糖的YNB-CAA液體培養基中, 調節OD600值至0.5~1.0, 20℃恒溫振蕩培養 24 小時即可成功誘導重組蛋白表達與展示。取已誘導表達CueR蛋白的菌液, 用50 mmol/L HEPES緩沖液洗去培養基并調節 OD600值至 4.0 (約為 3.6 mg 干重/ mL)待用。

1.4 磁性Fe3O4制備

參照 Massart[20]和 Fakhrullin 等[11]的方法制備磁性納米Fe3O4。將2.0 mL 1 mol/L FeCl3和0.5 mL 2 mol/L FeCl2水溶液混合, 置于磁力攪拌器上快速攪拌, 加入25 mL 1.0 mol/L氨水, 出現黑色磁鐵礦沉淀。用磁鐵將黑色沉淀分離, 并用超純水洗至上清液pH達到7.0。加入2 mL 25% TMA水溶液, 形成 Fe3O4磁性納米棒的穩定懸濁液。取 100 μL 該懸液稀釋于 10 mL 10 mg/mL 的 PAH 水溶液中, 超聲處理 20 分鐘, 得到 PAH 包裹著的磁性納米顆粒, 用超純水洗去游離的 PAH, 最終制成 0.5 mg 干重/mL 的 Fe3O4懸液, 顆粒直徑約為 30 nm (馬爾文Mastersizer 3000激光粒度儀測定)。

1.5 磁修飾酵母細胞及其表征

上述工程酵母菌懸液(yeast)及磁性納米顆粒懸液(magnetic nanoparticles, MNPs)按照yeast:MNPs= 4:1混合, 室溫下160 r/min振蕩20分鐘, 制成磁性納米Fe3O4修飾的酵母細胞, 約為 3 mg 干重/mL。取部分磁修飾前細胞懸液、磁修飾后細胞懸液和磁性材料離心去上清液后, 真空冷凍干燥 48小時, 稱取 2 mg 凍干樣品, 加入 100 mg 干燥的KBr, 充分研磨壓片, 用傅里葉變換紅外光譜儀(島津傅里葉變換紅外光譜儀, IRPrestige-21)測定其表面官能團。

1.6 磁修飾酵母細胞對重金屬的吸附試驗

將磁修飾酵母菌懸液離心棄上清液后, 于 1.5 mL 離心管中用 700 μL 重金屬測試液將菌體重懸, 使得溶液中磁修飾細胞濃度為 3 mg 干重/mL。置于恒溫搖床上振蕩吸附 2 小時, 然后離心分離(10000 r/min, 5 分鐘), 收集上清液, 稀釋后使用ICP-OES (Teledyne Leeman Labs, Prodigy XP)測定樣品重金屬濃度。每個試驗均設置3個平行樣。

在初始濃度影響試驗中, Ag+初始濃度設定為10, 20, 30, 40, 50, 60, 80 mg/L, pH = 5, 搖床溫度=30℃。在溫度影響試驗中, 搖床溫度設置為20, 30, 40和50℃, Ag+溶液濃度為50 mg/L, pH=5。在pH值影響試驗中, pH值設定為2, 3, 4, 5, 6, 7和8, Ag+溶液濃度為50 mg/L,= 30℃。在多金屬競爭吸附試驗中, 所有重金屬濃度為1 mmol/L, pH=5,=30℃。

吸附時間對吸附效率影響試驗方法: 向 100 mL錐形瓶中加入150 mg (干重)磁修飾細胞菌體和50 mL Ag+溶液(50 mg/L, pH = 5), 使得溶液中磁修飾細胞濃度為 3 mg 干重/mL; 置于搖床中振蕩吸附, 220 r/min,= 30℃; 取樣時間點設定為= 5, 8, 18, 30, 40, 55, 80和120分鐘。

2 結果與分析

2.1 磁修飾細胞的磁響應

如圖 1 所示, 經磁修飾后, 細胞在磁場的作用下達到良好的固液分離狀態, 表明已成功地負載上磁性。從圖 1(a)可以看出, 經磁性Fe3O4修飾后, 原本呈乳白色的酵母菌懸液變為棕褐色。這是因為PAH包裹的磁性Fe3O4為黑色, 表面帶正電荷, 而細胞表面帶負電荷[11], 二者混合后, 由于表面電荷相異, 相互吸引, 粒徑較小的磁性納米顆粒包裹在細胞外面, 與細胞相結合, 從而使細胞外觀顏色發生改變, 同時成功地負載上磁性。故在磁場的作用下, 磁修飾酵母可以迅速被磁鐵吸引, 1分鐘內可達到圖 1(b)右側的固液分離狀態, 而未經修飾的酵母細胞則保持原樣。當撤去外界磁鐵后, 經手動振蕩即可快速恢復到圖 1(a)右側的狀態, 再次均勻地分散在液體中。從工業應用的角度而言, 磁修飾細胞在廢水中快速分離能力可以大大縮短菌體沉降時間, 提高工作效率, 而快速重新分散能力有助于吸附劑的再生利用。

2.2 傅里葉變換紅外光譜

傅里葉變換紅外光譜可對材料的官能團進行表征。通過對比磁性修飾前后酵母細胞官能團的變化, 可初步判斷磁性材料Fe3O4在細胞表面的沉積是否會覆蓋或改變細胞表面原有的官能團, 從而影響細胞的吸附性能。

圖 2 為磁修飾前工程酵母細胞、磁修飾后酵母細胞和磁性Fe3O4的紅外吸收波譜。對比發現, 經過磁性修飾后酵母細胞的紅外吸收峰與修飾前酵母細胞保持一致。查詢吸收譜[21]以及文獻[22]可知, 其對應的基團: 2925±5 cm-1為烷烴CH2反對稱伸縮振動頻率, 仲酰胺羰基 C=O 伸縮振動頻率在1650 cm-1左右, 1541~1543 cm-1為仲酰胺NH面內彎曲振動頻率, 1043~1047 cm-1為酯類 C—O—C對稱伸縮和P—O—C的反對稱伸縮振動頻率。

不同化合物中的羥基OH伸縮振動頻率有所不同, 比如, 糖類 C—OH 的 OH 伸縮振動頻率為3570~3050 cm–1, 羧酸二聚體的OH伸縮振動頻率為3400~2200 cm–1等。3304~3447 cm–1均位于羥基OH伸縮振動頻率內, 從圖 2 可以看出, 與修飾前的細胞和磁性材料相比, 磁修飾后細胞的OH伸縮振動頻率帶較寬, 表明磁修飾細胞綜合了磁性材料和細胞的化合物基團。磁性材料在584 cm–1附近的吸收峰為 Fe—O 化學鍵振動吸收的結果, 表明磁性材料的成功合成。磁修飾細胞在頻率為581 cm–1處也有吸收峰, 驗證了它的磁響應能力。532 cm–1位于指紋區附近, 成分復雜, 這里不做分析。

此外, 酵母細胞在 1236 cm–1處有吸收峰, 為仲酰胺的 C—N 伸縮振動峰, 可能有 P=O 伸縮振動或 C—O—C 反對稱伸縮貢獻。磁修飾細胞在該振動峰的吸收帶發生了位移, 從 1236 cm–1變化為1225 cm–1, 表明細胞的磁修飾過程可能不僅是靜電作用的結果, 還存在部分基團參與的絡合反應。

綜上所述, 磁性材料在細胞表面的負載沒有破壞細胞原有基團, 磁修飾細胞較好地保留了工程酵母細胞和磁性材料的官能團。

2.3 初始濃度對吸附效率的影響

初始濃度對吸附效率的影響見圖 3。隨著溶液初始濃度的增加, 吸附量也逐漸增加, 溶液中Ag+的去除率則逐漸減少。這是由于溶液中吸附劑的量是一定的, 為 Ag+提供的吸附位點也是一定的, 當重金屬濃度初始濃度較低時, 幾乎所有的 Ag+均可與吸附位點結合, 達到較高的去除率。例如, 當初始濃度為10 mg/L時, 去除率高達98%, 但吸附量只有3.267 mg/g。隨著重金屬離子濃度增大, 傳質推動力也增大, 吸附平衡時吸附劑單位吸附量會隨之增加[13,23]。此外, 由于溶液中流動的Ag+增加, 增加了金屬離子與吸附位點的接觸機會, 因而提高吸附量[13]。當初始濃度從 40 mg/L變化為 50 mg/L時, 去除率從 86%降至 75%, 吸附量從 11.49 mg/g增至 12.47 mg/g, 開始趨向飽和。繼續增大溶液初始濃度對吸附量的影響不大, 卻大大降低去除率。因此, 綜合考慮吸附劑的利用效率和廢水的處理效果, 初始濃度為50 mg/L時可以得到最優化結果, 選取該初始濃度進行后面的吸附研究。

2.4 吸附時間對吸附效率的影響

吸附平衡時間是考察吸附劑在廢水處理中應用經濟性的一個因素[16]。如圖 4 所示, 隨著吸附時間的推移, 磁修飾細胞吸附量迅速增加。前 10 分鐘的吸附速率最大; 在 5 分鐘內, 重金屬去除率約達到 50%; 第 8 分鐘時, 去除率增長至66%, 吸附量約為 11.00 mg/g; 之后吸附速率開始減慢, 在第 18分鐘時, 磁修飾細胞的吸附量開始趨向飽和, 為12.17 mg/g; 后 100 分鐘吸附時間內, 吸附效率變化不大。

初始階段的高吸附速率是因為溶液中金屬離子濃度高, 傳質推動力大, 且吸附劑表面提供的可吸附位點多, 有利于吸附。隨著吸附的進行, 吸附劑剩余的吸附位點減少, 溶液中金屬濃度降低, 已占據吸附位點的 Ag+與將要與空位點結合的 Ag+還存在斥力作用, 增大了結合難度, 故吸附速率減 緩[13]。這個結果與諸多文獻報道的釀酒酵母快速吸附特征[6,24–25]一致。快速高效吸附過程還表明大多數的重金屬吸附發生在吸附劑的表面, 磁修飾細胞的大部分吸附位點也存在于表面[16]。

通常使用準一級、準二級反應動力學方程對吸附實驗數據進行擬合[26–27]。從表 1 的結果可以看出, 磁修飾細胞對Ag+的吸附過程更符合準一級動力學模型, 決定系數為 0.9578, 模型計算所得的平衡吸附量為12.26 mg/g (標準差為 0.1237 mg/g), 更接近實驗平衡吸附量12.30 mg/g。準二級動力學模型的決定系數為 0.8217, 計算平衡吸附量為12.83 mg/g (標準差為0.3387 mg/g), 擬合度沒有準一級方程高。Das 等[28]使用8種不同動力學模型對大型真菌吸附Ag+的過程進行擬合, 發現準一級動力學模型的擬合度最高。

2.5 溫度對吸附效率的影響

從圖 5 可以看出, 在20~50℃內, 溫度對吸附效率的影響不大, 4個溫度下, 吸附量的波動值僅為0.3 mg/g, 去除率波動范圍為 2%。磁修飾酵母對Ag+的吸附量受溫度影響小, 屬非依賴溫度的生物吸附過程, 即吸附 Ag+所需吸附活化能低[6]。Wang等[29]認為, 這在一定程度上表明, 由于離子交換機制受溫度的影響小, 離子交換機制存在于生物吸附過程中。Chen 等[30]通過釀酒酵母吸附Ag+前后的表面特征分析證明了這一推斷。磁修飾細胞的溫度應用范圍廣, 適用性強, 可用于處理不同溫度的重金屬廢水, 具備實用性。相比較而言, 20~30℃為磁修飾細胞最適宜反應溫度, 吸附量在12.65 mg/g左右, 去除率約為76%。

表1 吸附動力學方程及參數

說明:q為(min) 時刻的Ag+吸附量(mg/g),1cal和2cal分別為準一級和準二級動力學模型計算平衡吸附量(mg/g),1(1/min)和2(g/(mg·min))分別為準一級和準二級反應速率常數。

2.6 pH對吸附效率的影響

pH值是影響生物吸附重金屬的一個重要因素。從圖 6 可見, 隨著 pH 值的增大, 磁修飾酵母細胞對 Ag+的吸附效率也逐漸增大, 當 pH=7 時, 吸附效率達到最大, 吸附量為 13.12 mg/g, 去除率約 79%。隨著 pH 值的繼續增大, 當 pH=8 時, 吸附效率有所下降。溶液 pH 值較低時, 磁修飾酵母的吸附性能較差, 當 pH=2 時, 吸附量為 7.130 mg/g, 去除率為 41%, 僅為最優 pH 值下吸附效率的一半。這是因為在強酸性條件下, 溶液中水合氫離子[H3O+]濃度較高, [H3O+]與 Ag+競爭細胞表面結合位點, 從而降低了溶液中 Ag+的吸附效率[29]。此外, pH值還會影響細胞表面蛋白電荷。在酸性條件下, 表面基團(如羥基和羧基等)會被質子化帶正 電[31], 影響表面展示蛋白與 Ag+之間的靜電作用, 削弱吸附位點與 Ag+的結合能力[12]。實驗結果表明, 中性條件更適合磁修飾酵母細胞對 Ag+的吸附, 磁修飾酵母的最佳吸附pH值為7。

2.7 吸附等溫線

采用 Langmuir 和 Freundlich 等溫吸附模型擬合磁修飾細胞對 Ag+的吸附過程, 結果見圖 7 和表 2。可看出, Langmuir 模型的擬合效果更佳, 決定系數2=0.9825, 理論最大吸附量13.09 mg/g, 試驗最大吸附量為12.81 mg/g, 兩者接近。Freundlich模型是一個經驗方程, 決定系數2= 0.8359, 經驗常數為 5.265。一般認為, 1/越小, 吸附性能越好。當 1/在 0.1~0.5 之間時, 易于吸附; 當 1/大于 2 時, 則難以吸附[31]。本實驗的 1/值約為0.2, 說明磁修飾細胞容易吸附銀離子。

表2 吸附等溫線模型方程及參數

說明:為 Ag+的平衡吸附量(mg/g),eq為 Ag+的平衡濃度(mg/L),max為理論最大吸附量(mg/g),為 Langmuir 平衡常數(L/mg),和為Freundlich經驗常數。

2.8 多金屬競爭吸附實驗

實際廢水中含多種金屬, 吸附劑在其他金屬離子共存的情況下, 對銀離子的吸附能力值得探究。本研究中使用的酵母菌為經基因工程改造后的釀酒酵母, 表面展示 CueR 蛋白對銀離子具有選擇吸附性。如圖 8 所示, 在多金屬條件下, 工程酵母對銀離子的吸附量最大, 達0.1323 mmol/g, 顯著高于其余 4 種金屬的吸附量, 優先順序依次為 Ag+> Cu2+> Zn2+> Co2+> Ni2+。經過磁性材料修飾后, 酵母的選擇吸附性并沒有改變, 雖然對 Ag+的吸附量稍有下降, 但仍是最高。可能是因為磁性材料覆蓋了工程酵母表面展示蛋白的某些特異性吸附位點, 導致對銀離子的吸附特異性下降。這也從側面驗證了工程酵母細胞對銀離子的吸附特異性, 且經磁修飾后的細胞仍保留這一特性。此外, 細胞表面修飾的磁性材料 Fe3O4納米顆粒比表面積大, 孔隙多, 也是一種優良的吸附劑。磁性材料提供的非特異性結合位點, 增加了其余金屬與吸附劑的結合機會, 故經磁修飾后, Zn2+, Co2+和 Ni2+的吸附量增大。

總體而言, 磁修飾細胞對 Ag+仍具選擇吸附性, 吸附量為 Ni2+的 10.6 倍, Zn2+的 9.0 倍, Co2+的 7.5倍, Cu2+的 3.0 倍。磁修飾酵母的這一特性使其可在多金屬條件下對銀離子進行選擇性的富集回收, 有利于下一步的資源再生利用, 具備實用價值。

3 結論

1) 磁修飾酵母的磁響應性能優良, 在磁場中固液分離迅速。傅里葉變換紅外光譜圖表明磁修飾后細胞很好地保留了磁性材料和工程酵母的官能團。

2) 在 Ag+初始濃度為 50 mg/L,磁修飾細胞濃度為3 mg 干重/mL條件下, 磁修飾細胞對Ag+的吸附速率很快, 18 分鐘內達到吸附平衡; 溫度對吸附效率影響不大, 最適宜反應溫度為20~30℃; 吸附效率隨pH值增大而增加, 最佳吸附pH值為7。

3) Langmuir等溫吸附模型和準一級動力學模型對磁修飾細胞吸附Ag+實驗結果擬合良好。

4) 多金屬競爭吸附實驗表明, 磁修飾后的工程酵母仍保留對 Ag+的選擇吸附性。磁修飾細胞對Ag+的吸附量為 Ni2+的 10.6 倍, Zn2+的 9.0 倍, Co2+的7.5倍, Cu2+的3.0倍。

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Biosorption of Silver by Magnetically Modified Surface-EngineeredCells

TAO Huchun?, CUI Xiaobing, LI Jinbo, SHI Gang

Shenzhen Key Laboratory for Heavy Metal Pollution Control and Reutilization, School of Environment and Energy, Peking University Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055; ? E-mail: taohc@pkusz.edu.cn

Surface-engineered yeast () cells were magnetically modified using water based magnetic nanoparticles to prepare a new type of magnetically responsive adsorbent. Infrared spectroscopy analysis revealed that magnetically modified cells remained the functional groups of engineered yeast and magnetic materials. The kinetic and adsorption isotherm law and factors influencing adsorption (such as time, temperature and pH) were analyzed. The results showed that adsorption equilibrium was achieved within 18 min. The optimal condition for the Ag+adsorption was 20~30℃, pH 7.0. The pseudo-first-order kinetic model and Langmuir model fitted the adsorption data well. The results of multi-metal competitive adsorption indicated that magnetically modified cells still showed adsorption selectivity for Ag+than other heavy metal ions. The adsorption amount of Ag+was 10.6 times that of Ni2+, 9.0 times that of Zn2+, 7.5 times that of Co2+, 3.0 times that of Cu2+.

magnetic modification; surface-engineered yeast; silver; selective adsorption; magnetic separation

10.13209/j.0479-8023.2016.105

X703

2015-05-12;

2015-07-06;

網絡出版日期: 2016-11-05

深圳市基礎研究項目(JCYJ20130329174424934)和深圳市重點實驗室項目(CXB201111240110A)資助