結直腸癌中AQP3的表達及其與臨床預后的關系

雷 星， 陳 碩， 單 濤*

(1延安大學附屬醫院普外科，延安 716000； 2西安交通大學第二附屬醫院普通外科； *通訊作者，E-mail:shantao820304@163.com)

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結直腸癌中AQP3的表達及其與臨床預后的關系

雷 星1， 陳 碩2， 單 濤2*

(1延安大學附屬醫院普外科，延安 716000；2西安交通大學第二附屬醫院普通外科；*通訊作者，E-mail:shantao820304@163.com)

目的 探討水通道蛋白-3(AQP3)的表達與結直腸癌臨床病理及預后關系。 方法 收集術前未予化療治療的臨床病例資料齊全的原發性結直腸癌病例，取癌組織、癌旁組織、正常組織各40例，采用免疫組化法檢測AQP3的表達。比較AQP3表達與年齡、腫瘤大小、臨床分期、腫瘤部位、淋巴結轉移、病理類型之間的關系，并結合隨訪資料分析AQP3表達與否和預后的關系。 結果 40個腫瘤標本中，11例(27.5%)AQP3高表達，28例(70.0%)中度表達，1例(2.5%)無AQP3染色。癌旁和正常組織中AQP3陽性表達分別為4例(10.0%)和2例(5.0%)。AQP3的表達還與TNM分期(P=0.007)、淋巴結轉移(P=0.009)、遠處轉移(P=0.000)成正相關。在不同年齡、性別、組織學分級和腫瘤大小中AQP3表達沒有顯著性差異(P>0.05)。除此之外，AQP3陰性組比陽性組明顯具有生存優勢。 結論 AQP3可能是預測結直腸癌預后的良好指標。

結直腸癌； 水通道蛋白3(AQP3)； 預后； 免疫組化

結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來由于診治技術的提高，使得結腸癌的早期診斷治療有了顯著的提高，盡管在診斷和治療中取得一定進展，但結直腸癌仍嚴重影響生命健康[2]。因此，尋找干預治療的新靶向非常重要。

近年來，越來越多的研究表明，腫瘤的生長、進展、侵襲和轉移依賴于腫瘤微環境和腫瘤代謝[3]。水分子在腫瘤的進展中發揮顯著的作用，這一認識對于制定抗腫瘤治療方案非常重要[4]。水通道蛋白是具有分泌和吸收功能的上皮細胞運輸水的一類水膜通道，某些亞型也參與其他分子的運輸，如甘油和尿素。目前，在哺乳動物中有13種AQP成員，其中，AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP6、AQP8主要是水選擇性，而AQP3、AQP7、AQP9、AQP10、AQP11、AQP12也可以輸送甘油和其他小分子溶質[5]。AQPs基于其特定的組織定位在幾種類型腫瘤中表達有所不同，AQP1的表達通常與腦腫瘤相關[6]。王璐等[7]研究發現AQP3表達與皮膚鱗狀細胞癌的分化程度相關，在AQP3敲除小鼠的研究中，AQP3基因缺失延緩致癌物誘導皮膚腫瘤形成。通過AQP3進行的甘油轉運有助于細胞增殖和腫瘤發生中ATP(adenosine triphosphate)的生成[8]。AQP5可能參與細胞增殖而廣泛過表達于胰腺癌中[9]。

AQP3在結腸癌組織中的表達與腫瘤轉移有關，這表明，AQP3過表達在腫瘤進展中發揮一定作用。然而，AQP3在結直腸癌中的表達和臨床意義尚未完全闡明。為了評估AQP3作為結直腸癌的一種新型預后標志物的潛力，我們使用免疫組織化學檢測結直腸癌臨床樣本中AQP3的表達，進一步分析AQP3的表達與結直腸癌臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

選取延安大學附屬醫院普外科2014-08～2016-05的40例結直腸癌患者(結腸20例，直腸20例)的腫瘤組織，40 ml/L的福爾馬林固定。其中，男性20例，女性20例，手術時的年齡范圍35-74歲(中位年齡為56.4歲)。樣本的組織學類型均為結直腸腺癌，腫瘤分期和組織學分級均根據國際抗癌協會的分類記錄。40例標本中，Ⅰ期3例、Ⅱ期11例、Ⅲ期22例、Ⅳ期4例。病理分級如下：5例Ⅰ級、20例Ⅱ級、15例Ⅲ級。對所有的患者進行隨訪，隨訪中位時間為14個月(3-36個月)。所有的研究均由延安大學人體試驗委員會批準，受試人員均簽署由中國延安大學人體試驗委員會倫理審查委員會批準的知情同意書。

1.2 免疫組化

檢測AQP3蛋白的免疫組化采用標準化的鏈霉親和過氧化物酶的方法，組織切片(4 μm)在適當濃度的一抗中孵育過夜，次日，切片在生物素標記的羊抗兔IgG中孵育30 min，隨后在過氧化酶標記的鏈霉親和素室溫孵育20 min。用0.02%的3,3′-二氨基聯苯胺在50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.6)中染色5-7 min，經蘇木精復染、水沖洗、脫水、清除，封片。免疫染色的陰性對照用非免疫山羊或兔血清替代一抗，顯微鏡觀察，抗AQP3和β-actin抗體購自美國Santa Cruz生物公司。

1.3 結果判斷標準

使用DA KO Hercept Test 評分方法:(-),無細胞染色或少于30%的腫瘤細胞細胞膜(漿)較弱染色；(+),大于30%的腫瘤細胞細胞膜(漿)部分較弱染色；(++),大于30%的腫瘤細胞細胞膜(漿)完全較弱到中等染色；(+++)大于30%的腫瘤細胞細胞膜完全強染色。(-)和(+)的判為AQP3表達陰性，而評分為(++)和(+++)的判為AQP3表達陽性。

1.4 統計學分析

采用χ2檢驗或雙側Fisher精確檢驗分析方法。采用Kaplan-Meier計算生存率、Log-rank檢驗進行差異性檢驗。選擇有顯著性差異的因素逐步建立Cox多元比例風險模型，以確定其預后價值。P<0.05認為差異有統計學意義，所有的統計學分析采用SPSS13(SPSS,Chicago)軟件。

2 結果

2.1 結直腸癌中AQP3蛋白的表達

為確定AQP3在結直腸癌中的表達狀態，首先用免疫組化評估結直腸癌患者的腫瘤標本、癌旁組織和正常組織。研究結果顯示AQP3在病例組中11例(27.5%)強表達，28例(70.0%)中度表達，僅偶爾在癌旁組織[4(10.0%)]和正常組織[1(5.0%)]中檢測到(見圖1)。

A.正常結直腸組織 B.癌旁組織 C.結直腸癌組織圖1 結直腸癌、癌旁和正常組織間質中AQP3的表達水平 (×400) Figure 1 AQP3 expression in colorectal cancer by immunohistochemistry staining (×400)

2.2 AQP3表達與臨床病理特征之間的關系

AQP3在Ⅰ-Ⅱ期病例中的表達水平顯著低于在Ⅲ期和Ⅳ期中的表達水平(P=0.007)；在有無淋巴結轉移(P=0.009)和有無遠處轉移(P=0.000)間AQP3表達差異有統計學意義；AQP3表達在不同年齡(P=0.900)、不同性別(P=0.830)、不同組織學分級(P=0.954)和不同腫瘤大小(P=0.161)間差異無統計學意義(見表1)。

表1 結直腸癌組織中AQP3表達與臨床病理因素關系 例(%)

Table 1 Association between AQP3 protein expression and clinicopathological factors in pancreatic cancers cases(%)

臨床特征nAQP3評分2分1分0分P例數4011(27.5)28(70.0)1(2.5)年齡(歲)0.900 >60267(26.9)18(69.2)1(3.8) ≤60144(28.6)10(71.4)0(0.0)性別0.830 女205(25.0)14(70.0)1(4.8) 男206(30.0)14(70.0)0(0.0)組織分級0.954 Ⅰ52(40.0)3(60.0)0(0.0) Ⅱ205(25.0)14(70.0)1(5.0) Ⅲ154(26.7)11(73.3)0(0.0)腫瘤大小0.161 ≤2cm123(25.0)9(75.0)0(0.0) 2-5cm246(25.0)17(70.8) 1(4.1) >5cm42(50.0)2(50.0)0(0.0)淋巴結轉移0.009 陰性122(16.7)9(75.0)1(100.0) 陽性289(32.1)19(67.8) 0(0.0)遠處轉移0.000 陰性368(22.2)27(75.0)1(2.7) 陽性44(100.0)0(0.0)0(0.0)TNM分期0.007 Ⅰ/Ⅱ141(7.1) 12(85.7)1(7.1) Ⅲ226(27.3)16(72.7)0(0.0) Ⅳ44(100.0)0(0.0)0(0.0)

2.3 AQP3與結直腸癌預后的關系

為了確定AQP3與結直腸癌預后關系，對基于AQP3表達狀態的患者累積生存率進行了分析，將AQP3弱染色和無染色定為陰性，強染色定位陽性。AQP3陰性患者(n=29)1年累積生存率為100.0%(中位時間，30.2個月)，而AQP3陽性患者(n=11)的累積生存率為78.6%(中位時間，20.0個月)，二者間有顯著性差異(P=0.011，見圖2)。

圖2 兩組患者結直腸癌組織中AQP3表達陽性組和陰性組生存曲線圖 Figure 2 Kaplan-Meier analysis of the overall postoperative survival curves in colorectal cancer patients with positive or negative AQP3 protein expression

多因素分析顯示，淋巴結轉移(P=0.009)和TNM分期(P=0.007)是結直腸癌患者總生存期的獨立預后因素；腫瘤大小等其他臨床參數不是獨立的預后因素(見表2)。

表2 Cox多元比例風險預后模型

Table 2 Prognostic factors in Cox multivariate analysis

參數 生存率P風險比AQP30.0091.886淋巴結轉移0.0101.561TNM分期0.0201.276腫瘤大小0.0810.900性別0.2551.224年齡0.3001.663

3 討論

水通道蛋白(aquaporin，AQPs)是廣泛存在于原核和真核生物細胞膜、高效選擇性轉運水分子的特異通道[6]。腫瘤是機體在各種致瘤因素的作用下，細胞在基因水平上失去其生長的正常調控，導致新生物生成的過程。細胞所依賴的各種代謝都需要水分子的參與，而水通道蛋白可以快速特異地轉運水分子。

AQP3，最初認為生理條件下表達在皮膚角質細胞中[11]，AQP3敲除小鼠會因為角質細胞中缺少甘油及水分而出現皮膚彈性及屏障功能受損[10]，與光化性角化病、Bowen病和浸潤性皮膚鱗狀細胞癌的發生有密切聯系[12]。AQP3在結直腸癌、宮頸癌、腎癌、皮膚腫瘤、食道癌、肝癌等多種腫瘤中也具有高表達[10]。但AQP3在腫瘤進展具體作用機制還不完全明確。在胃癌細胞系中AQP3可通過Wnt/GSK-3beta/beta-catenin信號通路促進腫瘤細胞遷移[13]，還可以通過PI3K/Akt信號通路減少腫瘤細胞水和能量代謝[14]。在乳腺癌細胞中，AQP3通過調控CXCL12/CXCR4依賴的H2O2轉運影響乳腺癌細胞的遷移能力[15]。在前列腺癌中，AQP3可介導ERK1/2激活、提高MMP3表達，從而促進腫瘤細胞的運動和浸潤能力[16]。

然而，AQP3在結直腸癌中的表達和臨床意義尚未完全闡明。本研究中檢測到的結直腸組織中AQP3表達與以前研究結果[17]相一致。此外，我們分析了AQP3與結直腸癌臨床病理特征的相關性，結果表明，AQP3與患者的年齡、性別無顯著性相關，而與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關。本研究初步證實了AQP3在結直腸癌中可能的作用地位，具體AQP3通過何種機制影響結直腸癌進展，有必要在細胞分子生物學及動物實驗中進一步探討研究，這也是課題組下一步的方向。

總之，本階段研究提示AQP3蛋白在結直腸癌中表達上調，與高TNM分期、淋巴結轉移和不良預后緊密相關。因此，AQP3可作為結直腸癌侵襲和轉移的新的生物標志物。

[1] Torre LA,Bray F,Siegel RL,etal.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015，65(5):87-108.

[2] Chen W,Zheng R,Baade PD,etal.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016，66(2):115-132.

[3] Aronld M,Sierra MS,Laversanne M，etal.Global patterns and trends in colorectal cancer incidence and mortality[J].Gut,2016:Epub ahead of print.

[4] Koontongkaew S.The tumor microenvironment contribution to development,growth,invasion and metastasis of head and neck squamous cell carcinomas[J].J Cancer,2013,4:66-83.

[5] Ribatti D,Ranieri G,Annese T,etal.Aquaporins in cancer[J].Biochim Biophys Acta,2014,1840:1550-1553.

[6] Ishibashi K,Hara S,Kondo S.Aquaporin water channels in mammals[J].Clin Exp Nephrol,2009,13:107-117.

[7] 王璐，朱瑩，袁耀東，等,皮膚鱗狀細胞癌組織中埃茲蛋白和水通道蛋白3的表達[J].鄭州大學學報，2012,47(1)：23-26.

[8] 李白翎,金磊,鐘鏗,等.水通道蛋白3在非小細胞肺癌中的表達及與臨床病理相關性的研究[J].中國肺癌雜志,2012，15(7):404-408.

[9] 毛春蓉,仲建新,練云,等.水通道蛋白在卵巢上皮癌中的表達及意義[J].江蘇醫藥,2012,38(4):412-415.

[10] Papadopoulos MC,Saadoun S.Key roles of aquaporins in tumor biology[J].Biochim Biophys Acta,2015，1848:2576-2583.

[11] 郭曉強.水甘油通道3介導的甘油運輸與皮膚功能[J].第二軍醫大學學報,2009，30(12):1416-1419.

[12] 王小勇,陶承軍,任金平,等.水通道蛋白在光化性角化病、Bowen病和浸潤性鱗狀細胞癌中的表達及其意義[J].溫州醫科大學學報,2015，875-878.

[13] Zhou Y,Wang Y,Wen J,etal.Aquaporin 3 promotes the stem-like properties of gastric cancer cells via Wnt/GSK-3beta/beta-catenin pathway[J].Oncotarget,2016,7:16529-16541.

[14] Li Z,Li B,Zhang L,etal.The proliferation impairment induced by AQP3 deficiency is the result of glycerol uptake and metabolism inhibition in gastric cancer cells[J].Tumour Biol,2016,37:9169-9179.

[15] Satooka H,Hara-Chikuma M.Aquaporin-3 controls breast cancer cell migration by regulating hydrogen peroxide transport and its downstream cell signaling[J].Mol Cell Biol,2016,36:1206-1218.

[16] Chen J,Wang Z,Xu D,etal.Aquaporin 3 promotes prostate cancer cell motility and invasion via extracellular signal-regulated kinase 1/2-mediated matrix metalloproteinase-3 secretion[J].Mol Med Rep,2015,11:2882-2888.

[17] Li A,Lu D,Zhang Y,etal.Critical role of aquaporin-3 in epidermal growth factor-induced migration of colorectal carcinoma cells and its clinical significance[J].Oncol Rep,2013,29:535-540.

AQP3 expression in colorectal carcinoma and its relationship with clinical prognosis

LEI Xing1，CHEN Shuo2，SHAN Tao2*

(1DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofMedicalCollege,Yan’anUniversity,Yan’an716000,China;2DepartmentofGeneralSurgery,SecondAffiliatedHospitalofMedicalCollege,Xi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:shantao820304@163.com)

ObjectiveTo investigate AQP3 expression in colorectal carcinoma and its relationship with clinical prognosis.MethodsClinical data and followed-up data from 40 colorectal cancer patients without chemotherapy before surgery were collected. The expression of AQP3 was measured in 40 cases of colorectal cancer tissues, 40 cases of para-neoplastic tissues and 40 cases of normal tissues by immunohistochemistry(IHC). Then the correlation between AQP3 expression and clinicopathological parameters and prognosis was analyzed.ResultsOf 40 tumor specimens, 11(27.5%) had high expression of AQP3, 28(64.4%) exhibited moderate(intermediate) staining, and 1(2.5%) showed no AQP3 expression. AQP3 was only occasionally detected in para-neoplastic tissues[4(10.0%)] and normal tissues[2(5.0%)]. AQP3 overexpression was associated with TNM stage(P=0.007), lymph node metastasis(P=0.009), and distant metastasis(P=0.000). The relationships between age, gender, histological grade and tumor size and expression of AQP3 were not significant(P>0.05). In addition, patients with negative AQP3 expression had a superior cumulative survival rate compared to patients with positive AQP3 expression.ConclusionAQP3 may be used as a novel biomarker for predicting colorectal cancer prognosis.

colorectal cancer; aquaporin 3; prognosis; immunohistochemistry

國家自然科學基金資助項目(81402583);陜西省自然科學基金資助項目(2014JQ4165)；西安交通大學?；鹳Y助項目(xjj2014077)

雷星，男，1979-03生，碩士，副主任醫師，E-mail：leisaner@163.com

2016-08-27

R735.35

A

1007-6611(2016)11-1008-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.11.012