氫氧化鈉預處理對甘蔗渣酶解和發酵性能的影響

張憲寶， 張 騰， 謝文化， 朱明軍*

(1. 華南理工大學 生物科學與工程學院， 廣東 廣州 510006； 2. 廣州甘蔗糖業研究所， 廣東 廣州 510316)

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·研究報告——生物質材料·

氫氧化鈉預處理對甘蔗渣酶解和發酵性能的影響

張憲寶1， 張 騰1， 謝文化2， 朱明軍1*

(1. 華南理工大學 生物科學與工程學院， 廣東 廣州 510006； 2. 廣州甘蔗糖業研究所， 廣東 廣州 510316)

采用氫氧化鈉預處理甘蔗渣，通過單因素和正交試驗考察了不同預處理條件對甘蔗渣酶解和發酵性能的影響，并進一步分析了比表面積和木質素含量對酶解性能的影響。結果表明：預處理溫度、氫氧化鈉質量分數及預處理時間對酶解和發酵效率影響較為顯著，最佳的預處理條件為：溫度85 ℃、時間11 h、NaOH質量分數4.5 %，在此優化條件下預處理的甘蔗渣，含纖維素56.46 %，與原料相比提高了46.16 %；半纖維素20.30 %、 Klason木質素5.79 %，與原料相比分別降低了15.77 %和72.87 %，酶解36 h的還原糖得率為0.69 g/g(以甘蔗渣質量計)。經過氫氧化鈉預處理后的甘蔗渣比表面積顯著增加(由原料的0.07 m2/g最大可增加到1.07 m2/g)，木質素顯著降低，有利于提高酶解和發酵效率。當比表面積超過0.30 m2/g時，酶解初始速率和酶解效率達到平衡；當木質素低于11 %時，酶解效率達到平衡。

氫氧化鈉預處理；甘蔗渣；酶解發酵

隨著煤、石油和天然氣等化石燃料的日益枯竭，人們不得不加緊尋找可替代能源以滿足日益增長的能源需求[1-2]。地球上有著大量的生物質資源，全球每年由光合作用產生的木質纖維原料達4 500億噸[3]，可以利用這些生物質資源進行生物轉化生產燃料乙醇。利用玉米秸稈、小麥秸稈、水稻秸稈、甘蔗渣等生物質資源生產燃料乙醇，不僅可以實現工農業廢棄物資源的再利用，而且極大地避免了因直接燃燒帶來的環境污染問題，具有廣闊的發展前景。由于木質纖維原料的組成及結構特點，阻礙了纖維素酶與底物的接觸，降低了酶解效果，木質纖維原料需要經過預處理才能提高其酶解性能。因此，若要提高底物的利用率、糖化效率及可發酵性糖的產量，必須打破原有的結晶結構，降低木質素含量，增大底物的孔隙率，增加酶與底物的結合位點，從而提高糖化速率及利用率[4]。堿處理可以在低溫條件下進行，不僅纖維素和半纖維素損失少，而且無抑制產物形成，受到了廣泛的研究[5-8]。在堿性環境下，半纖維素及木質素分子間的酯鍵發生皂化，酯鍵的斷裂引起木質素溶解，同時纖維素、半纖維素和木質素間的孔隙增大，造成纖維素溶脹和結晶度降低等[9]。由于氫氧化鈉可以有效地去除木質素，使纖維素潤脹[10]，因而被廣泛用于制漿造紙工藝[11]。本研究采用氫氧化鈉為預處理試劑，分析不同預處理條件對甘蔗渣組成、酶解和發酵性能的影響，并且對比表面積和木質素含量與酶解效率之間的關系進行了探究。

1 實 驗

1.1 實驗材料

1.1.1 甘蔗渣 甘蔗渣原料(未經預處理)由廣州甘蔗糖業研究所提供，取粒徑小于0.38 mm的部分，粉碎，取粉徑小于0.15 mm的粉末，烘干至絕干待用，主要成分如下：纖維素38.63 %、半纖維素24.10 %、 Klason木質素21.34 %、酸溶木質素3.09 %。

1.1.2 酶 纖維素酶 Celluclast 1.5L(諾維信，丹麥)：纖維素酶酶活為23.87 FPU/mL，β-葡萄糖苷酶酶活為21.89 U/mL。

1.1.3 菌種 融合酵母 SHY 07-1(Saccharomycescerevisiae與Pichiastipitis的融合子)，由華南理工大學生物科學與工程學院發酵工程研究室保藏。

1.1.4 培養基 培養基按照參考文獻[12]進行配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 氫氧化鈉預處理的單因素試驗 稱取甘蔗渣原料各10.00 g于500 mL的三角瓶中，加入質量分數分別為0.1 %～5 %的NaOH溶液，分別在不同液固比(10∶1～30∶1，mL∶g)和不同溫度(30～80 ℃)下反應不同時間(1～12 h),處理結束后，先3 000 r/min 離心10 min棄去處理液，再用蒸餾水水洗，直至pH值近中性。對樣品進行抽濾，然后置于60 ℃烘箱中烘干，并用密封袋在室溫下保存。用于測定成分含量及糖化發酵。

1.2.2 氫氧化鈉預處理的正交試驗設計 考慮到預處理條件對酶解及發酵效率的影響，本研究對處理溫度、時間及NaOH質量分數3個因素進行優化，以獲得最佳的預處理條件。以液固比為20∶1，使用正交助手Ⅱ(v3.1)軟件設計3因素3水平的正交試驗。

1.2.3 預處理后甘蔗渣的酶解 酶解反應在15 mL的西林瓶中進行，酶解體系為10 mL，底物質量分數為4 %。稱取原料甘蔗渣和處理過的樣品0.4 g，加入9.4 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH值4.8)和0.2 mL 25 g/L的MgCl2溶液(MgCl2終質量濃度為0.5 g/L)，加膠塞及鋁蓋，121 ℃滅菌20 min，待冷卻后，在超凈臺中按20 FPU/g(以甘蔗渣質量計，下同)加入無菌過濾的纖維素酶液，于40 ℃、 200 r/min下反應72 h。分別在0、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24、 36、 48和72 h取樣0.2 mL，樣品立即放于沸水中煮沸3 min終止酶解反應，然后于12 000 r/min離心5 min，取上清液0.15 mL稀釋10倍后測定還原糖。酶解效率的計算公式如下：

Y=C1/[C2×(W1×1.11+W2×1.14)]×100%

式中：Y—酶解效率，%；C1—酶解液中還原糖的質量濃度，g/L；C2—酶解初始甘蔗渣質量濃度，g/L；W1—甘蔗渣中葡聚糖質量分數，%；W2—甘蔗渣中木聚糖質量分數，%； 1.11—葡聚糖和葡萄糖之間的轉換系數； 1.14—木聚糖和木糖之間的轉換系數。

1.2.4 同步糖化共發酵(SSCF) 發酵在25 mL西林瓶中進行，工作體積為15 mL。稱取氫氧化鈉處理過的甘蔗渣0.6 g (4 %底物質量分數)，加入13.25 mL的自來水、 0.3 mL的25 g/L MgCl2(終質量濃度為0.5 g/L)溶液和45 μL的0.1 g/L玉米漿溶液(終質量濃度為0.3 g/L)，并調節初始pH值至4.8～5.1，加膠塞及鋁蓋，121 ℃滅菌20 min，冷卻后，在無菌條件下按20 FPU/g加入無菌過濾的纖維素酶液，0.9 mL的酵母菌種子液(200 mg/L 濕菌體，6 %的接種量)，于30 ℃、 200 r/min下發酵120 h。在發酵過程中，每隔24 h 取樣0.2 mL，并立即12 000 r/min離心8 min，取0.1 mL上清液稀釋至1 mL并加入50 μL的10 %硫酸酸化，經0.22 μm膜過濾后于-20 ℃冰箱保存。發酵液中乙醇通過HPLC測定，發酵效率計算公式如下：

y=C3/[C4×(W1×1.11×0.51+W2×1.14×0.46)]×100%

式中：y—發酵效率，%；C3—發酵液中乙醇的質量濃度，g/L；C4—發酵初始甘蔗渣質量濃度，g/L； 0.51—葡萄糖和乙醇之間發酵轉換系數； 0.46—木糖與乙醇之間的發酵轉換系數。

在深靜脈血栓發生率和知識掌握度方面,觀察組均要明顯優于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),如表1。

1.3 分析方法

1.3.1 比表面積測定 采用Brunauer-Emmett-Teller (BET)法(氮吸附法)測定預處理后甘蔗渣的比表面積[13]。

1.3.2 甘蔗渣成分分析 甘蔗渣中葡聚糖、木聚糖和酸溶木質素的測定參考國際生物能源中心提供的方法《Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass》(2007-6-1)[14]，Klason木質素的測定參考國標GB/T 747—2003[15]。

1.3.3 酶活測定 纖維素酶酶活以FPU/mL表示，定義為：在50 ℃條件下60 min內分解濾紙產生1 μmol葡萄糖為1個活力單位。酶活測定依照美國可再生能源實驗室出版的方法《Measurement of Cellulase Activities》。β-葡萄糖苷酶酶活單位(U/mL)定義為：在測定條件(pH值 5.0， 50 ± 2 ℃)下，每分鐘水解底物產生1 μmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活單位。酶活測定方法參考韋斌如建立的pNPG比色法[16]。

1.3.4 還原糖濃度測定 測定采用DNS法(3,5-二硝基水楊酸法)。

1.3.5 乙醇濃度測定 發酵液中乙醇通過HPLC(Waters 2695)測定。檢測條件：柱子 Bio-Rad Amnex HPX-87H；進樣量 10 μL；流動相 5 mmol/L H2SO4，流速 0.6 mL/min；柱溫 60 ℃；檢測器 Waters 2414型示差折光檢測器，檢測器溫度 40 ℃，運行時間 15 min。

2 結果與討論

2.1 不同條件對預處理效果的影響

表 1 NaOH質量分數對預處理甘蔗渣成分的影響

對所處理的樣品進行酶解及同步糖化共發酵(SSCF)，圖1(a)及1(b)分別顯示了酶解效率和發酵效率隨NaOH質量分數變化的關系。由圖可以看出，隨著NaOH質量分數的增加，酶解效率和發酵效率不斷提高，且兩者的變化趨勢相同，即質量分數1 %以下處理的樣品效果較差，可能是由于NaOH的添加量低的原因。 Cullis等[17]指出，在用NaOH處理木質纖維原料時，NaOH的添加量要高于10 %(以原料質量計)。而質量分數高于1 %處理的樣品，不同時間的酶解效率和發酵效率與未處理原料相比平均提高了3～7倍。當質量分數由0.1 %增加到5 %時，酶解效率(72 h)和發酵效率(120 h)分別從10.08 %和12.85 %增加至65.49 %和57.83 %。NaOH質量分數越高，木質素的去除率也越高，同時，樣品的比表面積也越大，從而提高了樣品的酶解和發酵效率[13,17]。

圖 1 氫氧化鈉質量分數對預處理后甘蔗渣酶解(a)及發酵(b)性能影響

2.1.2 預處理溫度 如表2所示，預處理溫度對葡聚糖和木質素的含量有較大的影響，而對木聚糖影響不明顯。當溫度超過60 ℃時，木質素下降較快，當溫度為80 ℃時，Klason木質素由原料的21.34 %降為6.29 %，70.52 %的Klason木質素被去除。從酶解(圖2(a))及發酵(圖2(b))效果來看，溫度對其有著顯著的影響。特別是對于甘蔗渣的發酵效率來說，隨著預處理溫度的升高，發酵效率顯著上升。

表 2 溫度對預處理甘蔗渣成分的影響

圖 2 溫度對預處理后甘蔗渣酶解(a)及發酵(b)性能影響

2.1.3 預處理時間 從表3可知，隨著處理時間的延長，葡聚糖含量逐漸增大，9 h達到最大，為52.76 %；而木聚糖和木質素的含量則是逐漸降低，木聚糖的降低可能是由于浸泡時間延長，引起木聚糖的溶解。其中，預處理12 h后，木質素降至10.22 %，相比原料降低了52.10 %。

從圖3(a)及3(b)可以看出，處理時間對酶解及發酵均有顯著影響，酶解及發酵效率都隨著處理時間的延長而增大。而該結果與文獻[18-19]報道的不同，可能是由于本研究中NaOH的添加量較低的原因。隨時間延長，處理時間對效率的影響逐漸變小，當處理時間由9 h延長至12 h時，發酵效率僅從55.29 %提高到57.62 %，說明當處理時間達到9 h后，發酵效率可能達到了一個臨界值。

表 3 時間對預處理甘蔗渣成分的影響

圖 3 時間對預處理后甘蔗渣酶解(a)及發酵(b)性能影響

2.1.4 液固比 表4和圖4分別給出了液固比對預處理甘蔗渣成分和酶解及發酵效率的影響。如表4所示，隨著液固比的增大，葡聚糖含量逐漸增大，而木聚糖含量變化不明顯，Klason木質素的含量逐漸降低，去除率均在30%以上，最低為10.62%，比原料降低了50.23%。

表 4 液固比對預處理甘蔗渣成分的影響

圖 4 液固比對預處理后甘蔗渣酶解(a)及發酵性能(b)影響

從圖4(a)及4(b)可知，液固比雖然對葡聚糖的含量有較大的影響，但對酶解及發酵效率沒有顯著的影響，最高的發酵效率為58.26 %(液固比25∶1)，相應的酶解效率為63.08 %，比未處理的原料分別提高了6.27和8.05倍。

2.2 正交試驗結果分析

在研究單因素對預處理效果影響的基礎上，為了考察各因素間的交互作用，得出最優預處理條件，進行了L9(34)正交試驗。正交試驗設計及結果分析見表5。

表 5 正交試驗設計及結果

1)酶解后還原糖質量與初始甘蔗渣質量的比值the mass ratio of reducing sugars after enzymolysis and initial SCB

由極差分析可知，3個因素對預處理效果影響大小依次為NaOH質量分數>溫度>時間，正交試驗的優化結果為：A3B2C3，即處理時間為11 h，溫度為85 ℃，NaOH質量分數為4.5 %。在此條件下進行了3次實驗，測得預處理后的甘蔗渣纖維素平均為56.46 %，較原料提高了46.16 %；半纖維素平均為20.30 %，較原料降低了15.77 %；Klason木質素平均為5.79 %，較原料降低了72.87 %。36 h 還原糖得率分別為0.66、 0.70和0.71 g/g，平均為0.69 g/g。

2.3 比表面積對酶解的影響

木質纖維原料的酶解速率和降解度與比表面積直接相關，比表面積越大，底物的可及性越高，所提供的酶接觸位點越多[20]。比表面積由兩部分組成，一是外部表觀的表面積，二是由物料內部孔隙組成的表面積。Grethlein等[21]發現酶解初始速率與底物孔徑分布呈線性正相關關系，并發現纖維素酶分子的直徑為5.1 nm。Thompson等[22]在處理混合硬木時發現，在酶解反應最初2 h內葡萄糖的產量取決于底物的比表面積，而與預處理方式無關。劉淑瑞等[13]指出，比表面積能夠直觀地反映纖維之間的結合面積，比表面積越大，羥基越多，纖維素的親水性越強，有利于纖維素酶的吸附。通過測定單因素試驗中部分樣品的比表面積的變化情況(數據未給出)，發現預處理甘蔗渣的比表面積均有顯著增加，其中，由0.07 m2/g(未處理)最大增加到1.07 m2/g，增加了14.29倍。本研究對酶解初始速率與比表面積的關系進行了初步分析，并且進行了擬合，結果如圖5所示。由圖5可知，酶解初始速率及酶解效率(酶解72 h)都隨著比表面的增大而增加，分別由0.31 g/(L·h)和7.84 %增加到3.72 g/(L·h)和63.4 %。而當比表面積超過0.30 m2/g時兩者均達到平衡，可能是由于酶的添加量較少造成的。

2.4 木質素對酶解效率的影響

已有大量文獻探討木質素的去除與酶解的關系[19, 23-24]，Masarin等[19]指出當木質素去除率達到37%時，80 %的纖維素可以被降解。Lee等[23]研究了木粉中木質素的去除率和木粉酶解性能之間的關系，結果顯示當40 %的木質素被萃取出時，90 %以上的纖維素即可被降解。Ko等[24]的研究表明去除20 %～65 %的木質素可以顯著提高纖維素的降解性能。

圖6顯示了木質素含量對酶解效率(72 h)的影響。當木質素由18 %降至11 %時，酶解效率有顯著的提高，從11 %提高至62 %。然而，當木質素低于11 %時，酶解效率達到平衡，基本不再變化。Nlewem等[25]在研究柳枝稷中殘余木質素含量對酶解效果的影響時指出：可能存在最優的木質素含量使得酶解底物產生最大量的可發酵糖。

圖 5 比表面積對酶解的影響

圖 6 木質素對酶解效率的影響

3 結 論

3.1 氫氧化鈉預處理可以顯著提高甘蔗渣的酶解和發酵性能，氫氧化鈉質量分數、預處理時間和預處理溫度對預處理效果有較大影響，最佳預處理條件為：處理時間為11 h、溫度為85 ℃、 NaOH質量分數為4.5 %。在此優化條件下處理的甘蔗渣，纖維素提高了46.16 %，木聚糖和Klason木質素分別降低了15.77 %和72.87 %，酶解36 h的還原糖得率為0.69 g/g。

3.2 氫氧化鈉預處理后甘蔗渣比表面積顯著增加(由原料的0.07 m2/g最大可增加到1.07 m2/g)，有利于酶解初始速率和酶解效率的提高，而當比表面積超過0.30 m2/g時，酶解效率達到平衡。

3.3 木質素含量的降低有助于酶解效率的提高，當木質素低于11 %時，酶解效率達到平衡。

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Impacts of NaOH Pretreatment on Enzymolysis and Fermentation Performance of Sugarcane Bagasse

ZHANG Xian-bao1， ZHANG Teng1， XIE Wen-hua2， ZHU Ming-jun1

(1. School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology, Guangzhou 510006, China;2. Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute, Guangzhou 510316, China)

The impacts of different pretreatment conditions on enzymolysis and fermentation performance of sugarcane bagasse(SCB) pretreated by NaOH were investigated by single factor analysis and orthogonal experimental design.The effects of specific surface area and lignin content on enzymolysis of SCB were further studied.The results showed that the pretreatment temperature,time and mass fraction of NaOH significantly affected the enzymolysis and fermentation efficiency of the pretreated SCB.The optimal conditions for NaOH pretreatment were mass fraction of NaOH 4.5 %,11 h and 85 ℃.Under these conditions,the cellulose content of the pretreated SCB reached 56.46 % and increased by 46.16 % compared with the raw SCB. And the xylan and Klason lignin contents reached 20.30 % and 5.79 %,which decreased by 15.77 % and 72.87 %,respectively.The reducing sugar yield reached 0.69 g/g substrate after 36 h enzymolysis.The specific surface area of pretreated SCB significantly increased (the maximum value of 1.07 m2/g from 0.07 m2/g of the raw was obtained),while the lignin content decreased significantly.Both of them were beneficial for the enhancement of the enzymolysis and fermentation efficiency.It was found that when the specific surface area surpassed 0.30 m2/g,the initial enzymolysis rate and final efficiency could reach a balance.Besides,when the the lignin content was lower than 11 %,the enzymolysis efficiency reached a balance.

NaOH pretreatment;sugarcane bagasse;enzymolysis and fermentation

2016-03-08

國家自然科學基金資助項目(51278200， 51478190)；廣東省自然科學基金重點項目(2014A030311014)

張憲寶(1988— )，男，山東泰安人，碩士，主要從事生物質能源研究工作

*通訊作者：朱明軍(1969— )，男，教授，博士生導師，研究方向為纖維素酒精及工業廢棄物綜合利用；E-mail:mjzhu@scut.edu.cn。

10.3969/j.issn.1673-5854.2016.06.002

TQ35

A

1673-5854(2016)06-0009-08