人參皂苷Rb1注射對兔耳增生性瘢痕中PCNA表達的影響

羅 亮，趙炫仲，李昕珊，岳毅剛

（1.桂林醫學院 廣西 桂林 541000；2.桂林醫學院附屬醫院 廣西 桂林 541000）

人參皂苷Rb1注射對兔耳增生性瘢痕中PCNA表達的影響

羅 亮1，趙炫仲2，李昕珊2，岳毅剛2

（1.桂林醫學院 廣西 桂林 541000；2.桂林醫學院附屬醫院 廣西 桂林 541000）

目的：建立兔耳增生性瘢痕模型，通過局部注射人參皂苷Rb1，觀察增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen PCNA）的表達變化。方法：取8只新西蘭白兔，每只兔耳6處創面，建立增生性瘢痕模型，設空白組，地塞米松組，生理鹽水組，人參皂苷Rb1組。待傷口上皮化后，局部注射藥物，每3d 1次，共三次，空白組不予處理。給藥后第1、2、4、8周切除標本行MASSON染色觀察瘢痕情況及瘢痕增生高度,免疫組化法檢測PCNA表達。結果：注射后4、8周，與生理鹽水組比較，地塞米松及人參皂苷Rb1組瘢痕均改善明顯，瘢痕增生高度降低（P＜0.05），PCNA表達降低（P＜0.05）。結論：人參皂苷Rb1可有效抑制細胞增殖，改善兔耳增生性瘢痕增生。

增生性瘢痕；人參皂苷Rb1；增殖細胞核抗原；兔耳增生性瘢痕模型；成纖維細胞；瘢痕增生指數

當各種創傷愈合過程中出現成/肌成纖維細胞活性增強并異常增殖，細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）大量合成并沉積且無法吸收，則出現病理性瘢痕，可出現局部癥狀、影響容貌美觀、造成功能障礙。防治策略多為抑制活性細胞增殖、促其凋亡、調節膠原代謝，治療方法多樣[1]然而效果各異，與其發生機制不十分明確有關。近年來，中國傳統中藥治療增生性瘢痕研究顯示效果良好。本實驗以兔耳增生性瘢痕模型[2]為研究對象，局部注射人參皂苷Rb1，觀察其治療效果及細胞增殖情況變化。

1　材料和方法

1.1材料：新西蘭白兔，8只，公兔，體重1.9～2.7kg。Rb1由上海源葉生物科技有限公司提供。Masson染色試劑盒購自Solarbio LIFE，SCIENCES. Anti-PCNA antibody購自abcam。兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒購自中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1建立模型：兔耳腹側面造圓形創面，每耳6處，直徑1cm，間隔1cm，深達軟骨。1周后同方法再次原位造創，待其上皮化，模型建立。

1.2.2實驗方法：分生理鹽水組、Rb1組、地塞米松組及空白組，每組24個樣本。空白組不予處理； Rb1組及地塞米松組藥物濃度均為1mg/ml，局部注射給藥量每次0.3ml，3天1次，共3次。給藥后1、2、4、8周隨機處死2只兔子，切取樣本（含軟骨及周邊正常皮膚組織0.5cm）。經瘢痕最高處一分為二，置入10%甲醛固定行Masson染色及免疫組化。

1.2.3Masson染色：標本包埋固定切片后行Masson染色（按說明書進行），計算瘢痕增生最高處及周圍正常皮膚到軟骨的垂直距離比值。

1.2.4PCNA免疫組化：組織切片常規脫蠟、水化，98℃水浴法PH=6.0枸櫞酸鈉抗原修復20min，3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，5%BSA封閉，一抗孵育37℃孵育1h，Polymer Helper室溫孵育20min，poly-HRP anti-Rabbit IgG室溫孵育30min，DAB顯色，鏡下確定顯色時間，蘇木素復染。鏡下觀察PCNA表達，隨機選擇3處高倍視野測定細胞陽性率及染色強度，采用H-score法評分，取均值。

1.2.5統計：各組瘢痕增生指數除以空白組增生指數進行數據標準化。軟件采用SPSS19.0，計量資料以“xˉ±s”表示，采用方差分析，若數據不符合正態性及方差齊性，改用非參數檢驗。選α=0.05，當P≤0.05，數據有統計學意義。

2　結果

2.1肉眼觀察：傷口21d上皮化，局部隆起，呈“山丘樣”改變，色紅，質硬。給藥后隨治療時間延長，瘢痕隆起高度逐步降低，色澤變淡，質地變軟，地塞米松及Rb1組較生理鹽水及空白組瘢痕改善明顯。

2.2Masson染色：早期，表皮增厚，真皮細胞、血管成分增多，膠原纖維排列紊亂，多見膠原結節、“渦旋狀結構”，隨時間延長，細胞、血管成分逐步減少，膠原纖維呈束狀，排列相互平行、較有規律。地塞米松組、Rb1組較鹽水組改善明顯（見圖1）。

圖1　第4周Masson染色×200組織結構

2.3瘢痕增生指數：結果見表1，顯示第1、2周三組間比較（P＞0.05），第4、8周地塞米松組及Rb1組比較（P＞0.05），但與生理鹽水組比較（P＜0.05）。

表1　各組給藥后不同時間的瘢痕增生指數比較 (xˉ±s n=18）

2.4PCNA表達：PCNA定位于細胞核內，顆粒狀，染色強度不一，早期密度高，隨治療時間延長染色強度逐漸降低，表達多聚集于表皮基底部、血管內皮、血管周邊、膠原結節周邊，此外，散在分布的成纖維細胞亦呈陽性表達，隨治療時間延長，PCNA表達量及染色強度均明顯減少（見圖2）。

圖2　第2周PCNA染色×400組織結構

結果統計情況見圖3，分析顯示第1、2周三組間PCNA表達（P＞0.05），第4、8周地塞米松組及Rb1組PCNA表達（P＞0.05），但與生理鹽水組比較（P＜0.05）。

圖3　PCNA表達：#P＜0.05 地色米松組VS生理鹽水組；#P＜0.05 Rb1組VS生理鹽水組

3　結論

增殖細胞核抗原由Miyachi等[3]于1978年首次發現并命名。僅出現在增殖旺盛的細胞及腫瘤細胞內，是DNA聚合酶的輔助因子。其參與DNA的復制及修復[4]，細胞周期G1晚期開始增加，S期達到高峰，G2、M期明顯降低，到G0期最低，其濃度呈周期性波動，與DNA合成變化一致，可用于評價細胞增殖狀態，為診斷及預后提供幫助。因此，其可能成為治療癌癥的潛在靶點[5]。

病理性瘢痕[6-7]是創面愈合失控的結果，是各種原因引起的組織病理上表現為活性細胞大量增殖，細胞外基質大量合成并沉積且無法吸收所致。其形成與許多細胞的數量及功能狀態有關，其中，成纖維細胞[8-10]是主要的修復細胞，其數量及功能狀態是瘢痕形成過程的關鍵因素。

人參皂苷Rb1研究主要集中于心血管等方面。瘢痕治療方面已有研究[11-14]顯示人參皂甙Rbl可促血管生成、可抑制活性氧物質產生及減少ECM分泌、減少促纖維化相關因子的表達、誘導凋亡產生。本實驗結果顯示與生理鹽水組比較，隨給藥時間的延長Rb1組及地塞米松組活性細胞及血管成分逐漸減少，PCNA表達的量及強度逐漸減少，改善了瘢痕的增生，可能與藥物抑制了成纖維細胞、血管內皮細胞等活性細胞的增殖有關。但亦有研究[15]顯示瘢痕增生是由于凋亡太少所致，結果不一致可能因其檢測凋亡對象為肌成纖維細胞。在防治策略上，抑制活性細胞增殖和/或調控細胞凋亡均可能成為新的治途徑。

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編輯/張惠娟

Effect of Ginsenoside Rb1 on the expression of PCNA in rabbit ear hypertrophic scar

LUO liang1,ZHAO Xuan-zhong2,LI Xin-shan2,YUE Yi-gang2
(1 Guilin Medical University,Guilin 541000,Guangxi,China; 2.Affilicated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541000,Guangxi,China)

Objective To observe the effect of ginsenoside Rb1 on hypertrophic scars of rabbit`s ear and test the expression of Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Methods 8 rabbits were chosen randomly and 6 wounds were made in each rabbit ear to establish hypertrophic scars(HS).After the wounds epithelialization,the HS were separated into 4 groups: Blank group,Dexamethasone group,saline group,Ginsenoside Rb1 group. The administration was done once every 3 days for 3 times. On 1st,2nd,4th,8th weeks after the treatment,2 rabbits`s samples were resected randomly to test Masson staining and detect PCNA expression by immunohistochemistry. Results On 4th and 8th weeks after administration,compared with saline group,the scars of dexamethasone and ginsenoside Rb1 group were improved significantly,Scar elevation index reduced (P ＜0.05),the expression of PCNA decreased (P ＜0.05). Conclusion Ginsenoside Rb1 could effectively inhibit cell proliferation and improve scar hyperplasia.

hypertrophic scars;Ginsenoside Rb1;proliferating cell nuclear antigen;scar model of rabbit ear;fibroblast;scar elevation index

R619+.6

A

1008-6455（2016）11-0065-03

桂林市科學技術局科技攻關項目（20140120-1-4）

岳毅剛，男，1959.5，科室主任，教授，瘢痕的病因及治療；桂林市樂群路20號桂林附屬醫院整形外科，郵編：541001；E-mail：y.y.g@263.net

2016-07-22

2016-10-25