白介素6受體基因rs4129267位點多態性與漢族兒童哮喘易患性及血清IgE水平的關聯研究

李增清，楊東新，周 真，趙小琴，趙 慧，謝丹宇，郭素華，胡兢晶，王 波

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·論著·

白介素6受體基因rs4129267位點多態性與漢族兒童哮喘易患性及血清IgE水平的關聯研究

李增清，楊東新，周 真，趙小琴，趙 慧，謝丹宇，郭素華，胡兢晶，王 波

背景 有研究證實，白介素6受體(IL-6R)基因中的rs4129267位點多態性與哮喘易患性顯著相關，但尚無評估rs4129267位點多態性在漢族兒童中分布情況及其與血清IgE水平相關性的研究。目的 研究IL-6R基因rs4129267位點多態性與漢族兒童哮喘易患性及血清IgE水平的關系。方法 選取2013—2014年于廣東省婦幼保健院兒科就診的哮喘患兒410例為哮喘組，同期選取廣東省婦幼保健院住院的非哮喘患兒513例為對照組。提取兩組患兒基因組DNA，采用SNaPshot法對IL-6R基因rs4129267、rs527236128位點進行基因分型，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測兩組患兒血清總IgE水平。結果 兩組患兒rs4129267位點和rs527236128位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=3.264、2.135，P>0.05)。兩組患兒rs4129267位點基因型頻率和等位基因頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組患兒rs527236128位點基因型頻率和等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。Logistic回歸分析結果顯示，TT基因型是兒童哮喘的影響因素(P<0.05)。對照組患兒血清總IgE水平低于哮喘組(P<0.05)。對照組、哮喘組組內不同基因型患兒血清總IgE水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；對照組各基因型患兒血清總IgE水平均低于哮喘組(P<0.05)。結論 IL-6R基因rs4129267位點多態性與漢族兒童哮喘易患性有關，而與哮喘患兒血清IgE水平無關。

哮喘；疾病易感性；兒童；漢族；免疫球蛋白E；受體,白細胞介素6；多態性,單核苷酸

李增清，楊東新，周真，等.白介素6受體基因rs4129267位點多態性與漢族兒童哮喘易患性及血清IgE水平的關聯研究[J].中國全科醫學，2016，19(36)：4474-4477.[www.chinagp.net]

LI Z Q,YANG D X,ZHOU Z,et al.Correlation between rs4129267 polymorphism on IL-6R gene and pediatric asthma susceptibility and serum IgE level of Han Chinese children[J].Chinese General Practice，2016，19(36)：4474-4477.

支氣管哮喘(bronchial asthma)是兒科常見的呼吸道疾病之一，其主要病理生理過程包括慢性可逆性氣道阻塞、氣道炎癥和氣道高反應性。近年來，哮喘在兒童中的發病率及病死率均呈上升趨勢，此外，兒童哮喘也給患兒家庭帶來沉重的經濟負擔，其帶來的直接、間接醫療費用超過了艾滋病和結核病的總和[1]。因此，加強兒童哮喘的防治工作是當前臨床工作的重點。目前，隨著人類基因組研究的深入，研究者已經發現白介素6受體(IL-6R)、白介素13(IL-13)等基因多態性與兒童哮喘易患性相關[2]。IL-6R是一種在哮喘發病過程中扮演重要角色的細胞因子，可以通過促進輔助性T細胞(Th)17分化與增殖，參與炎性損傷過程，并產生多方面的生物學作用。有報道顯示，IL-6R基因中的rs4129267位點多態性與哮喘易患性有關[3]，但迄今未見針對IL-6R基因多態性在漢族兒童中分布的臨床報道，也未見其與哮喘相關血清IgE水平的相關性研究。本研究擬納入漢族哮喘患兒和非哮喘患兒作為研究對象，探討IL-6R基因rs4129267位點多態性在漢族兒童分布及其與漢族兒童哮喘發病及血清總IgE水平之間的可能關系，從遺傳學方面揭示兒童哮喘的發病機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2013—2014年于廣東省婦幼保健院兒科門診和住院的哮喘患兒410例為哮喘組，其中男287例，女123例；年齡3～12歲，平均年齡(6.5±1.8)歲。納入標準：(1)符合2008年兒童哮喘診治指南的診斷標準[4]；(2)漢族；(3)存在哮喘家族史；(4)變應原皮試點刺實驗至少1項陽性。排除標準：(1)年齡>14歲；(2)臨床資料不齊全。同期選取廣東省婦幼保健院住院的非哮喘患兒513例為對照組，其中男362例，女151例；年齡3～12歲，平均年齡(6.7±1.7)歲。納入標準：(1)臨床診斷排除兒童支氣管哮喘；(2)無個人及家族哮喘史；(3)無濕疹、過敏性鼻炎、過敏性皮炎等反復發作的過敏性疾病。排除標準：(1)罹患反復發作的過敏性疾病；(2)罹患慢性阻塞性肺疾病、肺間質病、支氣管擴張等肺部疾病；(3)臨床資料不齊全。兩組患兒性別、年齡比較，差異無統計學意義(χ2=2.256，P=0.106；t=1.203，P=0.094)。患兒均為漢族，相互間無血緣關系，患兒和/或其監護人均對本研究知情，并自愿簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會審批通過。

1.2 研究方法

1.2.1 提取基因組DNA 抽取兩組患兒空腹靜脈血3 ml，并用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2K)抗凝。采用Qiagen Blood試劑盒(購自德國QIAGEN公司)提取基因組DNA；檢測DNA純度和濃度，若OD260/OD280>1.8，OD260/OD230>2.0，則DNA純度合格，可以進行后續研究，否則需重新提取基因組DNA。提取DNA樣本后將其置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 檢測目的基因分型 采用SNaPshot法對IL-6R基因rs4129267位點(位置1:154453788)進行基因分型，同時選擇同一條染色體上rs527236128位點(位置1:94001851)進行對照。采用在線技術多重引物設計軟件MALDI-TOF MS和MassARRAY Assay Designer 3.1軟件包設計PCR引物序列，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，rs4129267位點上游引物為5′-CCAGTCTATCGAAGAAATC-3′，下游引物為5′-GATTTCGCTATCTAGACGGA-3′；rs527236128位點上游引物為5′-TCGGCCCACTAAACGGTTAT-3′，下游引物為5′-GCCACGCTACTGCGTGTTTGA-3′。反應體系為40 μl，其中10×PCR Buffer 4 μl、MgCl2(50 mmol/L)1.5 μl、dNTP(10 mmol/L)1.0 μl、上下游引物各1.0 μl、模板DNA 2 μl、Taq酶(5 U)0.4 μl、雙蒸水(ddH2O)29.0 μl；PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環后72 ℃延伸10 min。采用SNaPshot法處理擴增產物，再利用ABI公司的ABI3730測序儀和GeneMapper 4.0軟件對上述2個SNP位點進行基因分型。主要/次要等位基因為C/T，風險等位基因為T，基因分型檢出率為99.5%。

1.2.3 檢測血清總IgE水平 采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法檢測兩組患兒血清總IgE水平，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 基因型頻率和等位基因頻率比較 兩組患兒rs4129267位點和rs527236128位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=3.264、2.135，P>0.05)。兩組患兒rs4129267位點基因型頻率和等位基因頻率比較，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。兩組患兒rs527236128位點基因型頻率和等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

表1 兩組患兒rs4129267位點基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table1Comparisonofgenotypefrequencyandallelefrequencyofrs4129267betweenthetwogroups

組別例數基因型TT CT CC等位基因C T對照組51357(111)210(409)246(480)702(684)324(316)哮喘組41059(144)170(415)181(441)532(649)288(351)χ2值834510241P值00430010

表2 兩組患兒rs527236128位點基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table 2 Comparison of genotype frequency and allele frequency of rs4129267 between the two groups

組別例數基因型TT CT CC等位基因C T對照組513110(214)205(400)198(386)601(586)425(414)哮喘組41087(212)163(398)160(390)483(589)337(411)χ2值28742556P值02680376

2.2 兒童哮喘危險因素的Logistic回歸分析 以組別為因變量(賦值：對照組=0，哮喘組=1)，rs4129267位點基因型(賦值：CC=0，CT=1，TT=2)、等位基因(賦值：C=0，T=1)為自變量，進行Logistic回歸分析，結果顯示，TT基因型是兒童哮喘的影響因素(P<0.05，見表3)。

2.3 血清總IgE水平比較

2.3.1 兩組患兒血清總IgE水平比較 對照組患兒血清總IgE水平為(12.1±7.7)mg/L，低于哮喘組〔(17.4±7.2)mg/L〕，差異有統計學意義(t=3.892，P=0.012)。

2.3.2 兩組不同基因型患兒血清總IgE水平比較 對照組、哮喘組組內不同基因型患兒血清總IgE水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；對照組各基因型患兒血清總IgE水平均低于哮喘組，差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。

表3 兒童哮喘危險因素的Logistic回歸分析結果

Table 3 Results of Logistic regression analysis of risk factors of pediatric asthma

變量BSEWaldχ2值P值OR值95%CI常數項-00022674123710865--基因型 TT10640356903600212898(1967，3589) CT02370814700400661268(0897，1625)等位基因 T02780641857100641321(0921，1754)

注：-為無此項

Table4ComparisonoftotalserumIgElevelinpatientswithdifferentgenotypesbetweenthetwogroups

組別例數基因型TT CT CCF值P值對照組513131±83125±52101±3200500245哮喘組410183±74174±53176±4807500156t值317822342412P值000300340046

3 討論

近年來，兒童哮喘的發病率逐漸增高[2,4]，統計顯示，美國兒童哮喘的患病率每10年上升50%[1,5]，因此，進一步探索發病機制是兒童哮喘研究的熱點和難點。遺傳和環境因素共同導致哮喘的發生，而變應性呼吸道慢性炎癥是哮喘發生時最基本的病理特征[4]。當炎癥發生時，Th1/Th2平衡被打破，具體表現為Th2亞群數目增加或功能亢進，伴或不伴Th1亞群數目減少或功能低下，而在這一過程中，包括IL-6在內的多種細胞因子在哮喘發生發展過程中起重要作用[6]。研究證實，IL-6能夠活化B淋巴細胞及T淋巴細胞，在哮喘急性期時調控前列腺素等炎性遞質的合成和分泌，并誘導血清中抗體水平升高，激活IL-4對IgE的誘導作用，而IL-6的生物學作用的發揮主要依靠IL-6R[6-7]。近年來臨床研究證實，IL-6R基因多態性與哮喘的發生密切相關，尤其是位于IL-6R基因2號內含子的rs4129267位點多態性與哮喘相關性更強[7]。但是目前臨床研究仍集中在IL-4R、IL-18等基因位點的單核苷酸多態性(SNP)與哮喘發病的相關性[6]，而IL-6R基因rs4129267位點多態性與漢族兒童哮喘發病及易患性之間的關聯性未見報道，因此本研究對此進行探討。

鑒于已有一些研究指出，SNP與不同地域兒童哮喘易患性的關聯性并不一致，如IL-13上rs1295686位點與東北、武漢、包頭等地區漢族兒童哮喘發作有關，但與上海地區漢族兒童哮喘發作無關[8-9]。筆者推測，造成這種結果差異的原因可能與研究人群的遺傳結構、研究人群樣本體積、疾病臨床診斷異質性、研究地點人群分層等混雜因素有關。因此本研究選擇染色體定位與IL-6R基因距離較遠且與哮喘無關的rs527236128位點作為對照位點進行分析。本研究結果顯示，兩組患兒rs4129267位點和rs527236128位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，表明此兩個位點上的基因型頻率和基因頻率處于遺傳平衡穩定狀態，提示研究結果較為可靠；兩組患兒rs4129267位點基因型頻率和等位基因頻率有明顯差異，兩組患兒rs527236128位點基因型頻率和等位基因頻率無明顯差異，表明IL-6R基因rs4129267位點多態性與漢族兒童哮喘易患性有關，其T等位基因能夠增加哮喘發病的風險，且可以初步排除研究樣本人群分層對本研究結果的影響。FERREIRA等[3]對2 669例哮喘患者及4 528例對照者進行的一項全基因組關聯研究(GWAS)結果顯示，IL-6R基因rs4129267位點是誘發哮喘的危險位點，認為其是哮喘發作的危險因素之一，本研究結果與其一致。Logistic回歸分析結果顯示，TT基因型是兒童哮喘的影響因素，提示攜帶 rs4129267位點T等位基因純合子的兒童出現哮喘的風險明顯增加。此外，本研究結果顯示，對照組患兒血清總IgE水平低于哮喘組，對照組、哮喘組不同基因型患兒組內血清總IgE水平無差異，對照組各基因型患兒血清總IgE水平均低于哮喘組，提示突變T等位基因可能與哮喘患者高血清總IgE水平無關。這一結果也與IL-4基因SNP等其他基因多態性研究的結論是極為相似的[10]。

由于本研究選擇的研究人群為漢族兒童，因此本研究結果僅適應于中國漢族哮喘患兒。同時本研究僅檢測了IL-6R基因編碼區一個rs4129267位點多態性與兒童哮喘的關聯性，并不能簡單地認為rs4129267位點是真正的兒童哮喘致病位點之一，今后應進一步增加基因位點的研究數量，并擴大樣本量，以進一步深入探討；而且IL-6R基因編碼區是否存在其他多態性位點與漢族兒童哮喘或其他類型變態反應性疾病有關也有待進一步研究。

綜上所述，IL-6R基因rs4129267位點多態性與漢族兒童哮喘易患性具有關，而與哮喘患兒高血清總IgE水平無關。本研究也為進一步分析rs4129267位點多態性與兒童哮喘的具體發病機制提供循證依據。

作者貢獻：李增清進行試驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；楊東新、趙小琴、趙慧、謝丹宇、郭素華、胡兢晶、王波進行試驗實施、評估、資料收集；周真進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Correlation between rs4129267 Polymorphism on IL-6R Gene and Pediatric Asthma Susceptibility and Serum IgE Level of Han Chinese Children

LI Zeng-qing,YANG Dong-xin,ZHOU Zhen,ZHAO Xiao-qin,ZHAO Hui,XIE Dan-yu,GUO Su-hua,HU Jing-jing,WANG Bo.

Department of Pediatrics,Guangdong Women and Children Hospital,Guangzhou 511400,China

ZHOU Zhen,Department of Pediatrics,Guangdong Women and Children Hospital,Guangzhou 511400,China:E-mail:zhouzhen527@163.com

Background Research has confirmed the significant correlation between rs4129267 polymorphism on IL-6R gene and pediatric asthma suseptibility,but currently,the distribution of rs4129267 polymorphism among Han Chinese children and its correlation with serum IgE level have not been studied.Objective To investigate the correlation between rs4129267 polymorphism on IL-6R gene and pediatric asthma susceptibility and serum IgE level of Han Chinese children.Methods 410 asthma children from Department of Pediatrics of Guangdong Women and Children Hospital were selected as asthma group from 2013 to 2014.513 non asthma children in the same hospital were selected as control group during the same period.The DNA samples of two groups were extracted.Then the sites of rs4129267 and rs527236128 at IL-6R gene were genotyped by SNaPshot method.The total serum IgE level of two groups was determined by ELISA.Results The genetic distributions of rs4129267 and rs527236128 were accorded with Hardy-Weinberg equilibrium (χ2=3.264,2.135,P>0.05).The genotype frequency and allele frequency of rs4129267 were significantly different between the two groups (P<0.05).The genotype frequency and allele frequency of SNP rs527236128 were not significantly different between the two groups (P>0.05).The Logistic regression result showed that TT genotype was the risk factor to pediatric asthma (P<0.05).The total serum IgE level of control group was lower than that of asthma group (P<0.05).There was no significant difference in the total serum IgE level among different genotypes in two groups (P>0.05).The total serum IgE levels at all kinds of genotypes of control group were lower than those of asthma group (P<0.05).Conclusion rs4129267 polymorphisms on IL-6R gene is related to pediatric asthma suseptibility in Han Chinese children,but is not related to their serum IgE levels.

Asthma；Disease susceptibility；Child；Han nationality；Immunoglobulin E；Receptors,interleukin-6；Polymorphism,single nucleotide

廣東省自然科學基金資助項目(s2013010012670)

511400 廣東省廣州市，廣東省婦幼保健院 廣東省兒童醫院 廣東省婦產醫院兒科

周真，511400 廣東省廣州市，廣東省婦幼保健院 廣東省兒童醫院 廣東省婦產醫院兒科;E-mail：zhouzhen527@163.com

R 562.25

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.36.014

2016-02-16；

2016-07-08)