應用PCR-DGGE方法研究甜酒曲中真菌多樣性

姚淑敏，陳璐，閆華文

（曲阜師范大學生命科學學院，山東曲阜273165）

應用PCR-DGGE方法研究甜酒曲中真菌多樣性

姚淑敏，陳璐，閆華文

（曲阜師范大學生命科學學院，山東曲阜273165）

提取6種甜酒酒曲的總DNA，利用真菌18S rRNA基因片段的通用引物NS1、Fung-GC，采用變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）方法，進行不同甜酒酒曲中真菌多樣性的分析。結果表明，6種甜酒酒曲中共分離出3屬真菌和不可培養真菌，湖南韶山的甜酒曲中主要是扣囊復膜酵母屬和根霉屬的菌株；湖南湘潭甜酒曲中的真菌為釀酒酵母屬、扣囊復膜酵母屬和根霉屬；湖南祁東、福建福州和浙江麗水甜酒曲中的真菌均為釀酒酵母屬、扣囊復膜酵母屬、根霉屬和不可培養真菌；浙江蘭溪甜酒曲中的真菌為根霉屬和不可培養真菌。在傳統的酒曲中的真菌主要是釀酒酵母屬和扣囊復膜酵母屬，此外不可培養真菌在甜酒酒曲中也起到非常重要的作用。

變性梯度凝膠電泳；甜酒曲；真菌多樣性

甜酒曲（甜酒藥）是發酵甜酒釀的發酵劑。大量研究表明，酒曲中主要有三大類微生物，即酵母菌、霉菌和細菌[1-4]。霉菌主要產生淀粉酶和蛋白酶，用于糖化作用；酵母菌主要是利用糖進行酒精發酵，種類主要有扣囊復膜酵母（Saccharomycopsia fibuligera）、畢赤酵母（Pichia pastoris）、異常漢遜酵母（Hansenulaanomala）以及其他的產酯酵母[5-6]；細菌主要是乳酸菌，此外還有一些不可培養的細菌，這些細菌在酒曲中起著極其重要的作用。細菌發酵產酸在賦予甜酒釀酸甜口感的同時，還可以與酵母菌產生的乙醇作用生成酯類物質，賦予甜酒釀獨有的香氣，使其口味獨特，香氣濃郁。此外，有研究表明，乳酸菌可以產生乳酸菌素，具有抑制細菌的作用，在米酒發酵過程中可以抑制雜菌的生長[4]。

對甜酒曲中微生物多樣性的研究由來已久。蔡俊澤等[7]從云南和黑龍江地區的傳統米酒中分離得到41株乳酸菌，并從中篩選出產酸能力較強以及產乙醛和雙乙酰能力較強的菌株各一株。蔡麗等[8]從孝感地區的甜酒曲中分離得到13株根霉菌，其中6株為米根霉（Rhizopus oryzae），7株為華根霉（Rhizopus chinesis）。信陽民間傳統米酒中的優勢菌為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和少根根霉（Rhizopus arrhizus），同時還分離得到少量細菌，通過血球計數法測得發酵成熟的米酒中酵母菌數量（約3.0×107個/mL米酒）最多，其次為霉菌（2～3×103個/mL米酒），細菌數量（0～102個/mL米酒）最少且差異最大[9-10]。此外，LV X C等[11]對紅曲中的微生物多樣性進行了研究，發現在這些傳統的酒曲中微生物種子資源極其豐富。

國外學者JEYARM K等[12]研究學者從當地不同村莊共收集54種酒曲，從中分離得到163株酵母菌菌株，最終鑒定得到9株酵母菌，其中釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae），異常漢遜酵母（Hansenula anomala）和絲孢酵母（Trichosporon pullulans）為其中的優勢菌。DUNG N T P等[13]從米酒中分離鑒定出5株酵母菌和魯氏毛霉（Amylomycesrouxii）、少孢根霉（Rhizopus oligosporus）、米根霉（Rhizopus oryzae）等霉菌，這些根霉在淀粉糖化過程中還可以產生淀粉葡萄糖苷酶。YANG S Y等[14]對韓國的39種Nuruk樣品進行研究，從中分離得到174株絲狀真菌。從日本清酒中分離得到耐酒精的酵母，同時還對該菌株在分子生物學上進行研究，同時發現了泛素以及乳酸菌在酒曲優化中的作用[15]。

變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）是一種建立在聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增技術基礎之上的分子生物學技術，通過聚丙烯酰胺變性梯度凝膠將分子質量相同而堿基組成不同的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子分離開來。現在已廣泛應用于自然界不可培養微生物的多樣性研究[16]。

本研究旨在通過利用PCR-DGGE方法對不同地區甜酒曲中真菌的多樣性進行研究，了解不同地區甜酒釀風味迥異的原因，為甜酒釀品質的進一步提高以及甜酒釀的深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

本實驗總共研究6種中國不同地區的甜酒曲樣品，分別為湖南韶山、湖南湘潭、湖南祁東、福建福州、浙江麗水和浙江蘭溪6個地區，并分別用1#、2#、3#、4#、5#、6#來標記。6種甜酒曲形態見圖1。

圖1 6種甜酒曲樣品Fig.1 Six kinds of sweet alcoholic drink's starters samples

1.1.2 培養基

Luria-Bertani（LB）液體培養基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，pH 7.4，蒸餾水1 000 mL。

Luria-Bertani（LB）固體培養基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，pH 7.4，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑

50×TAE電泳緩沖液：上海信裕生物技術有限公司；CaCl2（0.1 mol/L，含有15%甘油）：上海信裕生物技術有限公司；氨芐青霉素（10 mg/mL）、聚丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、瓊脂糖：美國Sigma-Aldrich生物科技有限責任公司。

1.2 儀器和設備

2720 Thermal cycler PCR反應擴增儀、JY-TD331型變性梯度凝膠電泳儀：美國BIO-RAD公司；DYY-8型穩壓穩流電泳儀：北京六一儀器廠；YXJ-2離心機：上海玉博生物科技有限公司；H6-1微型電泳槽：上海精益有機玻璃制品儀器廠；805凝膠成像系統：上海山富科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA的提取

利用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒（產品編號SK8233/SK8234）提取6種甜酒曲樣品的總DNA。

1.3.2 真菌18S rDNA片段的擴增

利用真菌18S rDNA通用引物NS1、Fung-GC（見表1）以提取樣品的總DNA為模板進行擴增。反應體系及擴增條件見表2。

表1 帶有GC夾子的真菌引物Table 1 Primers of GC-fungi

表2 真菌18S rDNA PCR擴增體系Table 2 PCR amplification system of fungus 18S rDNA

PCR擴增條件為：預變性：94℃4min；變性：94℃，30s；退火：54℃，45s；延伸：72℃，1min；最后延伸：72℃，10min；體系共運行35個循環，4℃保存。

1.3.3 電泳檢測

吸取2 μL PCR產物進行電泳檢測。配制1.5%的瓊脂糖凝膠，放入1×TAE緩沖液中，120 V穩壓電泳15 min，電泳結束后用凝膠成像系統拍攝電泳圖譜，檢測PCR擴增效果。

1.3.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

取PCR產物各400 ng，利用D-Code突變檢測系統對樣品進行DGGE分析。凝膠質量分數：8%（丙稀酰胺∶雙丙稀酰胺=37.5∶1），變性劑濃度范圍：15%～40%（100%的變性劑：7 mol/L尿素，40%甲酰胺）。梯度凝膠放入1×TAE電泳緩沖液中，70 V電壓，60℃恒溫電泳13 h。電泳結束，首先用超純水沖洗凝膠，然后將膠放進染液（含TE緩沖液）中，搖床上均勻染色30 min，最后用凝膠成像系統對DGGE圖譜進行拍照。

1.3.5 DGGE條帶回收

選取6種樣品中有代表性的條帶，參照SK8131膠回收試劑盒的方法進行回收處理，回收產物放于-20℃備用。

1.3.6 PCR擴增回收驗證

反應體系及擴增條件同1.3.2，引物序列如下（見表3）。

表3 真菌引物Table 3 Primers of fungi

PCR產物回收參考SK8131膠回收試劑盒的方法。

1.3.7 目的片斷的克隆測序

根據TakarapMDR18-TVector連接試劑盒說明將目的片段和質粒進行連接，轉化到宿主菌大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α中，菌液均勻涂布于含有100 μL 20 mg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）和20 μL 100 mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）的氨芐青霉素LB平板上，37℃培養過夜，挑取白斑。提取質粒，片段送至上海生工生物工程公司進行測序。將測序所得序列提交至美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上，進行BLAST序列比對進行同源性分析，然后下載相關菌株序列信息，使用MEGA5.0軟件中的鄰接法構建系統樹圖，并以Bootstrap對進化樹進行1 000次可信度分析。

2 結果與分析

2.1 真菌18S rDNA片段PCR擴增結果

以NS1和Fung-GC為擴增引物，以提取的6種甜酒曲樣品的總DNA為模板進行18S rDNA片段擴增，取1.5 μLPCR擴增產物進行電泳分析，電泳結果如圖2所示。從圖2可以看出，6種酒曲中分別克隆到相應的片段，片段大小在350 bp左右。

2.2 變性梯度凝膠（DGGE）結果

取上述6種酒曲的PCR擴增產物，分別進行DGGE分析，電泳圖譜如圖3所示，選取有代表性的電泳條帶進行編號，共13條條帶，6種酒曲中的電泳條帶編號見表4。從圖3和表4可以看出，不同地區的酒曲中所得的電泳條帶不同，說明不同地區的酒曲中的真菌的種類有所不同，這也進一步推斷其發酵產物甜酒釀的營養成分及口感也會有所不同。

圖2 真菌18S rDNA片段PCR擴增產物電泳圖Fig.2 PCR amplification product electrophoregram of fungi 18S rDNA fragment

圖3 PCR擴增產物DGGE電泳圖譜Fig.3 PCR amplification product electrophoregram by DGGE

表4 甜酒曲樣品中的條帶編號Table 4 Bands number of sweet alcoholic drink's startersamples

2.3 PCR擴增

將編碼的13條DGGE片段利用膠回收試劑盒進行回收作為模板，以NS1和Fungi（不含GC夾子）為序列擴增引物進行PCR擴增，取1.5 μL PCR產物進行電泳檢測，如圖4所示。從圖4可以看出，編碼的13條條帶分別擴增出相應的片段，且擴增片段的長度為350 bp左右。

圖4 18S rDNA PCR擴增結果Fig.4 Amplification electrophoresis figure of 18S rDNA

2.4 測序結果分析

對上述PCR擴增產物進行膠回收，對回收片段進行克隆，藍白斑篩選，挑取白色菌落進行質粒提取，并寄往上海生工生物技術公司進行測序分析，將測序結果在NCBI上進行BLAST序列比對，比對結果見表5。從表5看出，條帶編號為1、2的片段屬于釀酒酵母屬，條帶編號為4、5、6、7、13的片段屬于扣囊復膜酵母屬，條帶編號為8、9、10、11的片段為根霉屬，而條帶編號為12的片段屬于不可培養真菌。

表5 13條條帶菌種鑒定結果Table 5 Results of the molecular identification of the 13 bands

將這13條帶比對結果，利用MEGA5.0鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統進化樹，結果見圖5。如圖5所示，所得序列與GenBank數據庫中16S rDNA序列的相似性在95%～100%之間。條帶編號5、7與扣囊覆膜酵母（Sac chatomycopsis fibuligera）15（KP119822.1）同源性高，其相似性達到100%，4、6與扣囊覆膜酵母（Sacchatomycopsis fibuligera）15（KP119822.1）相似性達到98%；13與扣囊覆膜酵母（Sacchatomycopsis fibuligera）（AB094142.1）同源性高，相似性達到97%；條帶編號1、2與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288cRDN37-2（NR132216.1）同源性高，相似性達到99%；條帶編號12與不可培養真菌（Uncultured fungus clone）nco40a10c（KC670800.1）同源性高，相似性達到99%；條帶編號8、11與米根霉（Rhizopusoryzae）TY.GF1（JN003654.1）同源性高，相似性達100%，條帶編號9、10與米根霉（Rhizopus oryzae）TY.GF1（JN003654.1）相似性達到99%。這說明在不同的酒曲中真菌的種屬主要是釀酒酵母屬（Saccharomyces）、扣囊覆膜酵母屬（Sacchatomycopsis）和根霉屬（Rhizopus）的真菌，這些菌在酒的釀造過程中起著及其重要的作用。

圖5 基于18S rDNA序列構建的系統進化樹Fig.5 Phylogentic tree based on the 18S rDNA sequences

3 結論

本實驗利用DGGE技術對甜酒曲樣品中的真菌多樣性進行了初步的分析，經過DGGE電泳分析，挑取13條清晰條帶進行PCR擴增、連接轉化、TA克隆進行序列鑒定，結果表明甜酒曲中的真菌主要為釀酒酵母、扣囊復膜酵母、米根霉和不可培養真菌，且6種甜酒曲樣品中的真菌種類存在差異。鑒定結果為：1#甜酒曲中的真菌種類為扣囊復膜酵母和米根霉，2#甜酒曲中的真菌為釀酒酵母、扣囊復膜酵母和米根霉，3#甜酒曲中的真菌為釀酒酵母、扣囊復膜酵母、米根霉和不可培養真菌，4#甜酒曲中的真菌為釀酒酵母、扣囊復膜酵母、米根霉和不可培養真菌，5#甜酒曲中真菌為釀酒酵母、扣囊復膜酵母、米根霉和不可培養真菌，6#甜酒曲中的真菌為米根霉和不可培養真菌。由此可見，在傳統的甜酒曲中，米根霉是重要的糖化菌株，其次為釀酒酵母，主要用于乙醇的發酵，另外扣囊復膜酵母在酒曲中起著重要的作用。實驗結果表明，微生物的非培養鑒定技術結合PCR-DGGE分子生物學手段，非常有利于酒曲微生物資源和不可培養真菌的研究，這比前期利用可培養方法進行的微生物多樣性分析結果更加豐富[5]。本實驗結果極大的豐富了湖南、福建、浙江三地的酒曲中微生物種子資源，為進一步研究我國南方地區酒釀風味物質特征、改進傳統的配料和釀造工藝奠定了理論基礎。

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Diversity of fungi in sweet alcoholic drink's starters by PCR-DGGE method

YAO Shumin,CHEN Lu,YAN Huawen
(College of Life Science,Qufu Normal University,Qufu 273165,China)

The total DNA in the six kinds of sweet alcoholic drink's starters was extracted,using the universal primer NS1 and Fung-GC of fungus 18S rRNA gene segment,the diversity of fungi in the different starters was analyzed by PCR-DGGE.The results showed that three genera of fungi and unculturable fungi were isolated from six kinds of the starters.The main fungi wereSaccharomycopsisandRhizopusin the Hunan Shaoshan sweet alcoholic drink's starters.Saccharomyces,SaccharomycopsisandRhizopuswere the main fungi in Hunan Xiangtan sweet alcoholic drink's starters.Saccharomyces,Saccharomycopsis,Rhizopusand unculturable fungi were the main fungi in Hunan Qidong,Fujian Fuzhou and Zhejiang Lishui sweet alcoholic drink's starters.Rhizopusand unculturable fungi were main fungi in Zhejiang Lanxi sweet alcoholic drink's starters. SaccharomycesandSaccharomycopsiswere the main fungi in the traditional starters.In addition,the unculturable fungi also played a very important role in sweet alcoholic drink's starters.

PCR-DGGE;sweet alcoholic drink's starter;fungal diversity

TS261.1

0254-5071（2016）11-0044-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.009

2016-07-08

國家自然科學基金資助項目（31200400）；曲阜師范大學實驗室開放基金項目（sk201407）

姚淑敏（1967-），女，副教授，博士，研究方向為微生物資源和利用。