利巴韋林單克隆抗體制備以及酶聯免疫試劑盒的研究

陳敏，崔海峰，馮才偉*，賈芳芳，楊春艷

（1.武漢中糧肉食品有限公司，湖北武漢430200；2.北京勤邦生物技術有限公司，北京102206；3.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心，北京102206）

利巴韋林單克隆抗體制備以及酶聯免疫試劑盒的研究

陳敏1，崔海峰2，3，馮才偉2，3*，賈芳芳2，3，楊春艷2，3

（1.武漢中糧肉食品有限公司，湖北武漢430200；2.北京勤邦生物技術有限公司，北京102206；3.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心，北京102206）

首先合成出利巴韋林半抗原，通過免疫動物得到抗利巴韋林單克隆抗體，制備利巴韋林殘留酶聯免疫檢測試劑盒，用于檢測雞肉、豬肉中利巴韋林殘留量。結果表明：該試劑盒對雞肉、豬肉的檢測限分別為4.88 μg/kg、4.42 μg/kg，半抑制濃度（IC50）為7.9 μg/L，回收率為80%～105%，試劑盒的標準曲線線性范圍為0～81 μg/L，批內、批間的相對標準標準偏差（RSD）均＜10%。4℃下能夠保存12個月，穩定性較好。

利巴韋林；半抗原制備；酶聯免疫法

利巴韋林（ribavirin，RBV）是一種廣譜抗病毒藥物，該種藥物具有高效性，被用于多種病毒治療，然而不法分子將其用于畜牧養殖，在動物飼養過程中違規濫用，使得該類藥物通過食物鏈進入人體內產生不良影響[1-4]。由于利巴韋林藥物容易出現上述情況，因此農業部發布了2005年第560號公告《獸藥地方標準廢止目錄》和農醫發[2005]33號文件《關于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，明確規定了禁止利巴韋林等藥物的生產、經營和使用，違者按生產、經營假獸藥和使用禁用獸藥處理。

目前，常用于檢測利巴韋林的方法有液相色譜法、液相色譜串聯質譜法、氣相色譜串聯質譜法、放射免疫法等[5-9]，而國內外尚無關于檢測動物源性食品中利巴韋林殘留的標準方法。原因可能是由于動物源性食品的基質復雜，前處理方法不完善造成的，另外，利巴韋林屬于核苷類化合物，與動物組織中的某些自身物質結構相似，因此不易準確地進行檢測。又由于利巴韋林檢測的實際需求，本研究利用酶聯免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測動物組織中利巴韋林藥物的殘留量，自主研發制備出檢測成本低、操作方法簡單、靈敏度較高的檢測試劑盒，極易應用于實際檢測中，而儀器方法不僅使用的儀器昂貴，需要專業的技術人員，而且大型儀器不適于現場檢驗，該試劑盒更適于基層實驗室的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

利巴韋林標準品：北京標準物質研究中心；洗滌液（向0.02 mol/L PBS中加入1%吐溫）、封閉液（在0.02 mol/L PBS中加入0.05%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA））、底物顯色液（由A液和B液組成，A液為過氧化氫，B液為四甲基聯苯胺）、終止液（2 mol/L H2SO4）：北京百欣試劑公司；雞肉、豬肉：市售；Balb/c小鼠、無病原體羊：北京市海淀區興隆實驗動物養殖廠。

1.2 儀器與設備

MK3酶標儀：上海雷勃分析儀器有限公司；HFJ-10振蕩器、MX-F渦旋儀：湖南湘立科學儀器有限公司；2L/R201C旋轉蒸發儀：上海一科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原的制備

（1）半抗原的制備

a）取5-硝基-1H-1,2,4-噻唑-3-羧酰胺5 g，加β-D-呋喃核糖-1,2,3,5-四乙酸酯3.26 g，加二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，加雙（對硝基苯基）磷酸酯1.2 g，油浴加熱，170℃條件下反應2 h。停止反應，加水，乙酸乙酯萃取，蒸干，上硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯2∶1（V/V）洗脫分離，得到中間體a（4.15 g）。

b）取中間體a加氫氧化鈉水溶液溶解，60℃條件下反應2 h，停止反應，中和滴加6 mol/L的濃鹽酸，中和至pH=7（采用1-14試紙監測），旋蒸蒸干，加80 mL無水乙醇。乙醇重結晶，得到硝基利巴韋林（2.11 g）。

c）取硝基利巴韋林（分子量415.31）2.1 g，加甲醇溶解，加催化劑（即摩爾分數5%的鈀）鈀碳，加氫氣，三口圓底燒瓶中，換氣，加氫氣球。室溫攪拌6 h，檢測，薄層層析（thin layer chromatography，TLC）檢測，展開劑二氯甲烷∶甲醇∶乙酸=500 μL∶500 μL∶20 μL，待原料反應完全，抽濾，除去鈀碳，旋蒸蒸干，得到油狀物，1,2-二氯乙烷重結晶，得到氨基利巴韋林半抗原產物（1.21 g）。利巴韋林半抗原合成途徑見圖1。

圖1 利巴韋林半抗原合成途徑Fig.1 Synthesis path of ribavirin hapten

（2）免疫原的制備

取15 mg氨基利巴韋林半抗原，溶解于1 mL二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）中，用pH 9.1的碳酸鹽緩沖液（carbonate buffer solution，CB）稀釋，加戊二醛0.2 mL，攪拌反應2 h，得到A液。稱取牛血清蛋白（BSA）50 mg，使之充分溶解在4 mL CB（pH 9.5）中，將A液逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫條件下攪拌24 h，用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）于4℃條件透析（透析袋截留分子質量8 000～14 000 u）3 d，每天換3次透析液。分裝，于-20℃保存備用。

（3）包被原的制備

取10 mg氨基利巴韋林半抗原，溶解于1 mL稀鹽酸（0.12 mol/L）中，冷卻到0℃攪拌，亞硝酸鈉水溶液（含亞硝酸鈉3 mg）0.5 mL，攪拌1 h，得到A液。稱取卵清蛋白（ovalbumin，OVA）50mg，使之充分溶解在4mLCB（pH9.0）中，將A液逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于低溫（0～5℃）條件下攪拌4 h；用0.01 mol/L的PBS于4℃透析（透析袋截留分子質量8 000～14 000 u）3 d，每天換3次透析液。分裝，于-20℃保存備用。

1.3.2 制備酶標記抗體：是酶標記抗抗體，即酶標記二抗

按照1.3.1步驟得到免疫原后，將其注入到Balb/c小鼠體內，進行免疫，得到利巴韋林單克隆抗體[10]，用該單克隆抗體免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗體[11]，然后將羊抗鼠抗體與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯[12]，即得到酶標記抗體。

1.3.3 篩選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度，制備酶標板

在測定波長為450 nm，抗原稀釋倍數依次為1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000；單克隆抗體稀釋倍數依次為1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶160 000；酶標記抗體液的稀釋倍數為1∶1 000時；分別測定0、1 μg/L質量濃度的利巴韋林標準品的吸光度值，并按如下公式計算百分吸光率：

百分吸光率（即抑制率）=（標準品或樣本溶液的平均吸光度值/0 μg/L標準溶液的平均吸光度值）×100%

在酶標板每孔包被100 μL抗原包被液，在37℃條件下放置2 h，隨后清洗酶標板，再加入150 μL質量分數為0.05%BSA的0.02 mol/L PBS緩沖液，在37℃條件下放置2 h[13]，即完成酶標板的制備。

1.3.4 樣本的前處理方法

稱取（1.00±0.05）g絞碎的雞肉或豬肉樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入10 mL甲醇，用振蕩器振蕩2 min，混勻，3 000 g室溫（20～25℃）離心5 min；移取1 mL上層有機相至10 mL潔凈干燥玻璃管中，（50～60℃）水浴氮氣流下吹干；加入1mL復溶工作液，渦動3min；取50mL用于分析。

1.3.5 利用酶標板檢測樣本

依次往酶標板中加入50 mL的標準品溶液（質量濃度為0、1 μg/L、3 μg/L、9 μg/L、27 μg/L、81 μg/L）及雞肉、豬肉樣本溶液，每孔均為50 mL，然后再加入50 mL抗體工作液，25℃條件下，避光反應30 min；洗滌酶標板，然后每孔加入100 mL酶標二抗，25℃條件下，避光反應30 min；洗滌酶標板，每孔先后加入50 μL過氧化氫和50 μL四甲基聯苯胺，25℃條件下，避光反應15 min；每孔加入50 mL 2 mol/LH2SO4溶液終止顯色反應，于波長450 nm處測定酶標板每孔的OD450nm值，每孔2個重復。

1.3.6 計算樣本中利巴韋林含量

根據1.3.5測定的OD450nm值繪制標準曲線，橫坐標為利巴韋林標準品質量濃度（μg/L）的對數值，縱坐標為lg（B（OD450nm（1 μg/L））/B0（OD450nm（0 μg/L）），然后將樣本的OD450nm值代入標準曲線，即可得到其相應的質量濃度，用該質量濃度乘以稀釋倍數即為動物樣本中利巴韋林殘留量。

1.3.7 檢測性能

（1）計算檢測限

測定雞肉、豬肉空白樣本各20份，計算其標準差，以3倍的標準差作為方法的檢測限（limit of detection，LOD），即可檢測出的最低被測物濃度[14]。

（2）精密度和準確度

分別向雞肉、豬肉樣本中添加利巴韋林，使其藥物質量濃度達到2.5 μg/kg、5.0 μg/kg和10.0 μg/kg，測定添加回收率，以此評價試劑盒的準確度。測定3批酶標板，每個樣本做4個平行），計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），該指標可以評價試劑盒的精密度。

（3）測定穩定性

將試劑盒在4℃條件下保存12個月，每個月測定半抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）、450 nm波長條件下的最大吸光度值、雞肉樣本的添加回收率。

2 結果與分析

2.1 篩選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度

測定不同單克隆抗體稀釋倍數以及抗原稀釋倍數條件下，質量濃度為0和1 μg/L的利巴韋林標準品的OD450nm值，并計算百分吸光率，結果見表1。

表1 抗原、抗體的濃度優選結果Table 1 Optimized detection results of antigen and antibody concentration

通過多年驗證，當百分吸光率在70%～85%時，以抗原、單克隆抗體的最大稀釋倍數作為抗原、單克隆抗體的最佳稀釋倍數[15]。由表1結果可知，此次篩選的抗原稀釋倍數為16 000，最佳單克隆抗體稀釋倍數為160 000。

2.2 利巴韋林標準曲線

以利巴韋林標準品質量濃度對數值（x）為橫坐標，lg（B/B0）（y）為縱坐標，繪制利巴韋林標準曲線，結果見圖2。

圖2 利巴韋林標準曲線回歸方程Fig.2 Regression equation of standard curve of ribavirin

由圖2可知，標準曲線回歸方程為y=-1.735x+1.561，相關系數R2為0.997。結果表明，標準曲線的范圍為0～81 μg/L，IC50為7.9 μg/L。

2.3 計算檢測限

20個雞肉、豬肉空白樣本中利巴韋林的檢測結果分別見表2、表3。檢測限以測定平均值加3倍標準差計算。

表2 雞肉空白樣本檢測限測定結果Table 2 Detection limit results of chicken blank samples

表3 豬肉空白樣本檢測限測定結果Table 3 Detection limit results of pork blank samples

由表2、表3可知，20個雞肉空白樣本中利巴韋林的檢測結果平均值為1.91 μg/kg，最低檢測限為4.88 μg/kg；20個豬肉空白樣本中利巴韋林的檢測結果平均值為1.60 μg/kg，最低檢測限為4.42 μg/kg。

2.4 精密度和準確度試驗

測定添加不同質量濃度利巴韋林的雞肉、豬肉樣本，其精密度及準確度試驗結果分別見表4、表5。

表4 雞肉樣本精密度及準確度試驗結果Table 4 Precision and accuracy tests results of chicken samples

表5 豬肉樣本精密度及準確度試驗結果Table 5 Precision and accuracy tests results of pork samples

由表4可知，添加不同質量濃度利巴韋林的雞肉樣本，回收率范圍是85.0%～99.3%，當添加量為2.5 μg/kg、5.0 μg/kg和10.0 μg/kg時，批內相對標準偏差（RSD）是5.7%～9.7%；批間相對標準偏差（RSD）為7.0%～9.6%。

由表5可知，添加不同質量濃度利巴韋林的豬肉樣本，回收率范圍是89.6%～101.4%，當添加量為2.5 μg/kg、5.0 μg/kg和10.0 μg/kg時，批內相對標準偏差（RSD）為3.2%～9.5%；批間相對標準偏差（RSD）是6.0%～7.8%。

2.5 穩定性試驗

將試劑盒保存在4℃條件下，測定的試劑盒的最大吸光度值、IC50及回收率，結果見表6。由表6可知，測定的無添加利巴韋林試劑盒的最大百分吸光度值范圍是1.51～1.92，IC50范圍是6.7～8.3 μg/L，利巴韋林添加回收率范圍是80.9%～103.3%，由此可見，各指標均在正常范圍之內。從測定結果可知，該試劑盒在4℃條件下至少能夠保存12個月。

表6 試劑盒在4℃保存的穩定性試驗結果Table 6 Stability tests results of the kit kept at 4℃

2.6 討論

2014年，陳燕等[16]對豬肉和雞肉中的利巴韋林進行了測定，所用的方法是高效液相色譜-串聯質譜法，檢測限均為10 μg/kg。鄭鋅等[17-19]分別用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測了雞肉中的利巴韋林，檢出限在1～4 μg/kg。目前檢測畜禽肉中利巴韋林藥物含量的方法集中在儀器方法，鮮有快速檢測方法，本研究對雞肉、豬肉的檢測限分別為4.88 μg/kg、4.42 μg/kg，達到了和儀器檢測利巴韋林相同水平的檢測限數量級，而且快速檢測方法在應用方面具有成本低、操作方便、快速等優勢。

3 結論

本文通過制備利巴韋林半抗原、利巴韋林單克隆抗體，篩選出抗原包被濃度和單克隆抗體濃度，運用酶聯免疫法研發出利巴韋林酶聯免疫檢測試劑盒，利巴韋林標準曲線范圍為0～81 μg/L，對雞肉、豬肉的檢測限分別為4.88 μg/kg、4.42 μg/kg，回收率范圍均在80%～105%，批內/批間相對標準偏差（RSD）均＜10%。由于該試劑盒能夠在4℃下保存12個月，表明該試劑盒穩定性較好[20]。

[1]強曉妍，朱監寶，徐敏，等.LC-MS/MS法測定大鼠血漿中利巴韋林及其毒代動力學參數[J].藥學進展，2012，36（9）：413-417.

[2]王維霞.LC-MS/MS對雞肉中利巴韋林殘留的分析[J].山東畜牧獸醫，2013，34（7）：8-9.

[3]魏秀麗，高迎春，楊林，等.超高效液相色譜-串聯質譜法檢測抗菌藥物中非法添加利巴韋林的研究[J].中國家禽，2015，37（8）：31-34.

[4]吳飛，丁黎.LC-MS法應用于利巴韋林顆粒劑的人體生物等效性研究[J].醫學信息·中旬刊，2011（8）：28-29.

[5]朱永林，邵德佳，蔣天梅，等.高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肝中利巴韋林及其代謝物殘留總量[J].中國獸藥雜志，2008，42（7）：22-25.

[6]劉凱，王麗娜，李建忠.飼料和雞肉中利巴韋林的測定：超高效液相色譜-串聯質譜法[J].現代畜牧獸醫，2014（5）：15-19.

[7]崔成富，陳創華，林海丹，等.中獸藥散劑中非法添加利巴韋林的檢測方法研究[J].中國獸藥雜志，2011，45（9）：32-35.

[8]邵琳智，姚仰勛，謝敏玲，等.親水相互作用色譜-串聯質譜法同時測定動物組織中金剛烷胺與利巴韋林[J].分析測試學報，2013，32（12）：1448-1452.

[9]曲斌，朱志謙，陸桂萍，等.測定雞肉中利巴韋林殘留的固相萃取-UPLC-MS/MS法的研究[J].中國家禽，2013，35（15）：37-40.

[10]劉小軍，馮才偉，馮靜，等.一種葉酸的酶聯免疫快速檢測試劑盒的研制[J].食品工業科技，2013，34（23）：303-310.

[11]楊利國，胡少昶，魏平華，等.酶聯免疫技術[M].江蘇：南京大學出版社，1998：139-186.

[12]張欣，江鴻，賴增發.對藥典中軟膠囊崩解實驗方法的討論[J].海峽藥學，2011，23（7）：87-88.

[13]鄭百芹，羅曉琴，馮才偉，等.一種喹諾酮類藥物的酶聯免疫快速檢測試劑盒的研制[J].中國釀造，2014，33（2）：130-133.

[14]馮仁豐.分析靈敏度（檢測限）[J].上海醫學檢驗雜志，2002，17（3）：133-136.

[15]董李學，馮才偉，馮靜，等.抗氧氟沙星單克隆抗體的制備及ELISA快速試劑盒的初步研制[J].中國畜牧獸醫，2014，41（8）：90-94.

[16]陳燕，李曉雯，劉暢，等.禽畜肉中利巴韋林殘留量檢測方法的研究[J].食品安全質量檢測學報，2014，5（3）：905-911.

[17]鄭鋅，湯曉艷，曹興元，等.超高效液相色譜-串聯質譜法檢測蛋雞體內抗病毒藥物利巴韋林[J].食品科學，2016，37（4）：197-201.

[18]白亞敏，楊小珊，毛慶，等.超高效液相色譜質譜法測定雞肉中抗病毒類藥物殘留[J].食品工業科技，2014，35（24）：76-78.

[19]云環，崔鳳云，嚴華，等.超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中的利巴韋林和金剛烷胺[J].色譜，2013，31（8）：724-728.

[20]唐偉國.醫學檢驗診斷試劑的制備與應用[M].上海：上海科技文獻出版社，1996：99.

Production of ribavirin monoclonal antibodies and its ELISA kit for rapid detection

CHEN Min1,CUI Haifeng2,3,FENG Caiwei2,3*,JIA Fangfang2,3,YANG Chunyan2,3
(1.COFCO Wuhan Meat Product Limited,Wuhan 430200,China; 2.Beijing Kwinbon Biotechnology Company,Beijing 102206,China; 3.Beijing Engineering Research Centre of Food Safety Immunodetection,Beijing 102206,China)

Synthesized ribavirin hapten was prepared from a sequence of reactions,and ribavirin monoclonal antibodies were prepared by animal immune.Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)kit was prepared which was used to test ribavirin in chicken and pork.Then the limit of detection and relative standard deviation(RSD)of ribavirin ELISA kit was studied.Results showed that the limit of detection was 4.88 μg/kg in chicken and 4.42 μg/kg in pork with half maximal inhibitory concentration(IC50)values of 7.9 μg/L.The recovery rates were between 80%-105%.The linear range of the standard curve was 0-81 μg/L,and the intra and inter-assay RSD were both less than 10%.The stability tests results revealed that the kit can be kept at 4℃for 12 months.

ribavirin;hapten preparation;ELISA

TS207.3

0254-5071（2016）11-0167-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.035

2016-07-29

河北省科技計劃項目（16275507D）

陳敏（1986-），女，助理工程師，本科，研究方向為食品檢測。

*通訊作者：馮才偉（1978-），男，高級獸醫師，碩士，研究方向為食品安全檢測技術。