白酒黃水中纖維素降解菌的分離鑒定及產酶活性研究

白酒黃水中纖維素降解菌的分離鑒定及產酶活性研究

曾林1，2，譚霄1，袁春紅1，3，張慶1，2*，楊穎4，趙婷婷1，2，唐潔1

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川省食品生物技術重點實驗室，四川成都610039；2.西華大學古法發酵（釀造）生物技術研究所，四川成都610039；3.樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川樂山614000；4.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250101）

為拓展纖維素降解菌資源，以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為唯一碳源作初篩培養基，從濃香型白酒發酵副產物黃水中分離得到18株具有產纖維素酶能力的菌株進行純培養。形態學、生理生化和系統發育鑒定結果顯示，菌株XH01、XH04、XH05、XH18為Bacillus cereus，菌株XH34為Bacillus circulans，菌株SW01、SW05為Bacillus megaterium，菌株SW02為Bacillus endophyticus，菌株SW03、SW04為Bacillus simplex，菌株SW09、SW13為Bacillus bataviensis。菌株ZL08為Penicillium camemberti，菌株ZL13為Aspergillus fumigatus，菌株ZL04和ZL25為Penicillium chrysogenum，菌株ZL15和ZL17為Alternaria tenuissima。利用二硝基水楊酸法對菌株發酵液纖維素酶活進行研究，結果表明，菌株SW02的產酶活性較高，其羧甲基纖維素酶活為153.36 U/mL，β-葡萄糖苷酶活為126.00 U/mL，微晶纖維素酶活為17.64 U/mL，濾紙酶活為30.48 U/mL。

黃水；纖維素酶；微生物；系統發育；酶活

纖維素是地球上分布最廣的碳水化合物，同時又是世界上含量最豐富的可再生資源[1]。目前，許多研究者致力于不同來源的產纖維素酶微生物的篩選，因為對自然界進行生物多樣性探索，是獲得適合、適用工業生產的新型生物催化劑最有效的手段[2]。

纖維素酶是一類誘導型多酶復合體，通常由內切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶3種具有不同催化反應功能的酶組成，幾種酶協同作用催化纖維素水解為葡萄糖，利用微生物及其產生的纖維素酶類來分解纖維素是一種經濟、有效且無污染的方法[3-4]。纖維素酶是微生物在纖維素類誘導物的誘導作用下產生的[5-6]，產纖維素酶的微生物在自然界中廣泛存在，但由于酶的生成量、酶穩定性及催化效率等因素的制約，使得纖維素酶的生產遠遠不能滿足工業的需要[7-8]。因此，對產纖維素酶微生物的篩選一直是研究的熱點。

黃水是白酒釀造的副產物，具有黏度大、溶氧低等特點，構成了極為復雜的微生物生長環境[9]。迄今為止，產纖維素酶微生物的篩選來源大多限于土壤、糞便、水體等，楊柳等[10]從土壤中分離的一株產濾紙酶和羧甲基纖維素酶活性較高的解淀粉芽孢桿菌；YOUNG C C等[11]從森林土壤中分離出2株能降解堿性木質素的芽孢桿菌。但從濃香型白酒黃水中篩選產纖維素酶微生物的報道不多。

本研究從濃香型白酒發酵副產物黃水中篩選產纖維素酶菌株，并對其進行鑒定及產酶活性評估，以期對窖池中黃水微生物系統的研究提供一定的理論指導，拓寬了產纖維素酶的種質資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型白酒黃水樣品：四川水井坊股份有限公司。

羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMCNa）（分析純）：天津市瑞金特化學品有限公司；微晶纖維素（化學純）、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（化學純）：成都市科龍化工試劑廠；TaKaRa聚合酶、DH5α感受態細胞：TaKaRa Biotechnology（大連）；pGM-T試劑盒、MarkerⅦ：天根生化科技有限公司。

培養基：CMC-剛果紅平板篩選培養基、CMC液體發酵培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YPD）培養基、LB培養基菌均按參考文獻[12]配制。

1.2 儀器與設備

720BR/01492電泳凝膠成像分析系統、BiometraT1PCR儀：BIO-RAD公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；Heraues Multifuge X1R冷凍高速離心機：Thermo Fisher Scientific公司；BHC-1300ⅡA2生物安全柜：蘇州安泰空氣技術有限公司；BiometraPCR儀：德國耶拿分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物的分離純化

取黃水樣液25 mL，加入225 mL無菌生理鹽水的均質袋中，均質5 min。取適量均質液用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋后涂布于LB培養基菌和YPD培養基進行分離，LB培養基于37℃培養48 h，YPD培養基于28℃、120 r/min培養48 h。分別挑取單菌落劃線純化3次。

1.3.2 纖維素酶產生菌的篩選

將純化后的菌株接種于篩選培養基，培養2 d后向培養加入適量碘液染色2 min。觀察并測量菌株及其周圍透明水解圈直徑大小，計算透明水解圈直徑與菌落直徑的比值，初步確定菌株的纖維素酶活性高低。

1.3.3 菌株的形態及生理生化特征

按照《伯杰氏系統細菌學手冊》[13]和《真菌鑒定手冊》[14]中的鑒定方法進行。

1.3.4 系統發育樹的構建

根據XIANG W L等[15]方法提取細菌DNA。16S rRNA擴增引物為Eu27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。擴增條件：95℃預變性5 min，95℃變性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸2 min，30循環后72℃保持10 min。

根據李可[16]的方法提取真菌DNA。18S rRNA擴增引物：18S-F（5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′）和18S-R（5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′）。擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸55 s，36個循環后72℃保持10 min。

擴增產物連接到pGM-T載體后克隆入感受態細胞E.coliDH5α中，提取重組質粒對16S rRNA和18S rRNA測序。所得序列提交至NCBI進行Blast比對，利用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹。

1.3.5 纖維素酶系活力測定

將產酶菌株接于種子培養基，細菌于37℃、180 r/min搖床培養6 h，真菌于28℃、180 r/min培養12 h。以2%的接種量（約1×107CFU/mL）將種子液接種于液體產酶發酵培養基中，分別于37℃和28℃恒溫空氣搖床上180 r/min振蕩培養3 d。發酵液8 000×g離心5 min，上清液即為粗酶液。采用3,5-二硝基水楊酸測定還原糖的方法檢測內切型葡聚糖苷酶（CMC酶活）、外切型葡萄糖苷酶（微晶纖維素酶）、β-葡萄糖苷酶的酶及濾紙酶活。分別以CMC-Na、微晶纖維素、D-水楊苷、濾紙為唯一作用底物，取1 mL適當稀釋的待測酶液和1 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 7.0），于50℃水浴1 h后，加入2 mL DNS試劑終止反應，沸水浴中煮沸10 min，冷水浴冷卻后，于波長540 nm處比色[17]。

纖維素酶系活力定義為每1mL樣液每分鐘水解纖維素底物生成1μg葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位，U/mL。

2 結果與分析

2.1 微生物的分離純化及形態特征分析

以CMC-Na為唯一碳源對濃香型白酒發酵黃水中微生物進行篩選培養，共篩選到18株纖維素降解菌，將18株纖維素降解菌纖維素降解菌接種于平板培養基中，30℃、120 r/min培養24 d后，菌體形態見圖1，其菌落直徑和透明圈直徑見表1。

圖1 產纖維素酶菌株的菌體形態Fig.1 Mycelial morphology of cellulase-producing strains

由圖1可知，細菌菌落多數為圓形，均具有光澤，顯微觀察菌體均為桿狀，革蘭氏染色均為陽性。真菌菌落擴散生長，呈棉絮狀，結構疏松，孢子黑色，邊緣較整齊。

表1 篩選平板上18株微生物的菌落直徑和透明圈直徑Table 1 Diameters of colony and clear haloes on the screening plate formed by cellulose-decomposing strains

由表1可知，菌株XH34和SW02在篩選培養基上表現出具有較大的水解纖維素能力，比酶活力分別是6.52±0.54和9.04±0.67。

2.2 菌株的生理生化及系統發育樹的構建

對篩選出的18株產纖維素酶系菌株進行生理生化試驗，結果見表2。將產纖維素酶的18株菌株全部進行測序，測得序列經Mallard 1.02檢測后，通過軟件BioEdit 7.0檢測，無異常序列發現。再利用MEGA5.0軟件以Neighbor-Joining法構建系統發育樹，結果見圖2和圖3。18株菌株中4株被鑒定為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）；1株鑒定為內生芽孢桿菌（Bacillus endophyticus）；1株被鑒定為環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）；2株被鑒定為簡單芽孢桿菌（Bacillus simplex）；2株被鑒定為巴達維亞芽孢桿菌（Bacillus bataviensis）；2株被鑒定為巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium）；2株被鑒定為細極鏈格孢菌（Alternariatenuissima）；1株被鑒定為沙門柏干酪青霉菌（Penicillium camemberti）；1株鑒定為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）；2株被鑒定為黃青霉（Penicillium chrysogenum）。這與生理生化特征試驗結果相符。

表2 纖維素降解細菌理化特征比較Table 2 Comparison of physicochemical properties of cellulose-decomposing strains

圖2 基于16S rRNA序列同源性的纖維素降解細菌系統發育樹Fig.2 Bacteria phylogenetic tree of cellulose-decomposing bacteria based on homology of 16S rRNA gene sequences

圖3 基于18S rRNA序列同源性的纖維素降解真菌系統發育樹Fig.3 Fungus phylogenetic tree of cellulose-decomposing fungi based on homology of 18S rRNA gene sequences

2.3 纖維素酶系活力測定

采用3,5-二硝基水楊酸試劑測定還原糖的方法檢測菌株纖維素酶系活力。分別以CMC-Na、D-水楊苷、濾紙、微晶纖維素為唯一作用底物，測定濃香型白酒黃水中纖維素降解菌發酵液中內切型葡聚糖苷酶（CMC酶活）、β-葡萄糖苷酶的酶、外切型葡萄糖苷酶（微晶纖維素酶和濾紙酶活）。結果如圖4所示，總體來說，從濃香型白酒黃水中篩選的18株纖維素降解菌產生的纖維素酶對各底物的降解各不相同，表現出不同的活力，在白酒釀造過程中，各纖維素降解菌的協同作用和其產生的纖維素酶系的相互作用共對原料中的纖維素進行降解，破壞間質細胞壁的結構，使其包含的淀粉釋放出來，以利于糖化酶的作用，從而起到提高原料利用率、提高發酵率和縮短發酵時間的效果。個體來說，菌株ZL25和SW02產生的纖維素酶系活力較高。其中菌株SW02對羧甲基纖維素鈉和D-水楊苷表現出較高的降解活性，分別為153.36 U/mL和120.00 U/mL，也就是說，菌株SW02產生的纖維素酶系中內切型葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性較高。

圖4 產纖維素酶菌株酶活力比較Fig.4 Comparison of the cellulase activities of the cellulase-producing strains

2.4 討論

纖維素酶由于其廣泛的應用性及良好的應用前景一直受到人們的關注，產纖維素酶菌株篩選、高產菌株的誘變選育、酶系基因克隆、酶系組成及作用機制等各個方向的研究一直都在進行[18]。菌種篩選是纖維素酶生產的基礎性工作，也是關鍵步驟，國內外許多學者已做了大量的研究工作，建立了較為完善的分離篩選方法，現如今已有很多關于纖維素酶產生菌選育的報道[19]。

本研究采用CMC-Na為唯一碳源的初篩方法從低氧、高酸度、營養匱乏的黃水環境中分離出12株產纖維素酶細菌和6株產纖維素酶的真菌，通過透明圈大小及比酶活力大小分析，菌株XH34和SW02在篩選培養基上表現出具有較大的水解纖維素能力。雖然透明圈大小及比酶活力大小可以直觀地反映酶濃度的高低及酶活力大小，但不能完全代表菌株產酶能力。其原因是多方面的，固態和液態培養條件下水活度、氧含量、菌的代謝情況等的不同；不同菌株具有不同的生長、產酶速度及纖維素酶系組成；菌苔大小及在平板上堆積情況的差異等因素都會造成透明圈大小與液態發酵酶活力結果的不完全一致[20]。此外，初篩培養基所用的篩選底物為人工合成的可溶性纖維素，與天然不可溶纖維素相比更易被微生物分解利用，因此羧甲基纖維素鈉平板篩選法還忽略了天然纖維素和人工纖維素之間的差異，其結果并不能準確反映出菌株對天然纖維素底物的利用能力[21]。所以，進一步對菌株進行液態發酵對產纖維素酶菌株的表達能力評估必不可少。

經形態觀察、生理生化分析及分子鑒定得出12株細菌均屬于芽孢桿菌屬，分別為Bacilluscereus、Bacilluscirculans、Bacillusmegaterium、Bacillusendophyticus、Bacillussimplex、Bacillusbataviensis。目前，已有許多種芽孢桿菌被報道其產纖維素酶能力，如Bacillus amyoliquefaciensDL-3、Bacillus subtilisKG10、Bacillus flexus、Bacillus haloduransCAS1、BacilluslicheniformisSVD1等，而有關Bacillus megaterium、Bacillusendophyticus、Bacillussimplex及Bacillusbataviensis的產纖維素酶的報道還未曾見到[22]。在白酒釀造工業，產纖維素酶菌可對粗原料中的纖維素進行降解，破壞間質細胞壁的結構，使其包含的淀粉釋放出來，以利于糖化酶的作用，從而起到提高原料利用率、提高發酵率和縮短發酵時間的效果[23]。農業上，這些產纖維素酶芽孢桿菌還具有微生物催腐劑的潛力，可加速田間農作物廢棄物軟化腐朽，提升土壤肥力，減少環境污染。因此，本研究對黃水中產纖維素酶細菌進行篩選、鑒定，不僅為黃水中微生物系統的研究提供一定的理論指導，擴展了纖維素酶的種質來源，還為潛質工業微生物的研究及開發提供參考。

3 結論

纖維素酶酶系表達能力分析結果表明，18株菌株都能分泌外型內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶，其中內切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶酶的活力較高。與其他17株菌株相比菌株SW02的纖維素酶系活力最高，經初步發酵測得的外型內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶及總酶活力大小分別為153.36 U/mL、12.00 U/mL、17.65 U/mL、30.48 U/mL，其中β-葡萄糖苷酶酶活力最高，與其他研究者篩選到的產纖維素酶菌株相比[7]，菌株SW02的酶系活力較低，但不同來源纖維素酶系的組成成分不同、結構不同，其酶活力和分解能力也不相同，并且微生物的培養條件和酶活力測定條件對所測的酶活力影響較大。因此，后續的發酵條件優化以提高纖維素酶系活力的研究尤為重要，這將為酶發酵工業化開發利用、提高纖維素分解效率等研究探討奠定基礎。

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Isolation and identification of cellulose-degrading strains from yellow water ofBaijiu (Chinese liquor)and its cellulase activity

ZENG Lin1,2,TAN Xiao1,YUAN Chunhong1,3,ZHANG Qing1,2*,YANG Ying4,ZHAO Tingting1,2,TANG Jie1
(1.Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan,College of Food and Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039, China;2.Biotechnology Institute of Ancient Brewing,Xihua University,Chengdu 610039,China;3.Food and Drug Testing Center of Leshan,Leshan 614000,China;4.Food and Drug Institute of Shandong,Jinan 250101,China)

In order to broaden and evaluate the strain resources with cellulose degradation capability,using carboxymethyl cellulose-Na as sole carbon sources,a total of 18 strains with cellulose-producing abilitywere isolated from yellow water of the Luzhou-flavorBaijiu(Chinese liquor)fermentation. The results of morphological,physiological and biochemical characterization and 16S rRNA analysis showed that strain XH01,XH04,XH05 and XH18 were identified asBacillus cereus,strain XH34 was identified asBacillus circulans,strain SW01 and SW05 were identified asBacillus megaterium,strain SW02 was identified asBacillus endophyticus,strain SW03 and SW04 were identified asBacillus simplex,strain SW09 and SW13 were identified asBacillus bataviensis.Strain ZL08 was identified asPenicillium camemberti,strain ZL13 was identified asAspergillus fumigatus, strain ZL04 and ZL25 were identified asPenicillium chrysogenum,strain ZL15 and ZL17 were identified asAlternaria tenuissima.Their cellulase activity were detected by DNS method,and results showed that strain SW02 had higher cellulase activity,the CMCase,β-glucosidase,avicelase and FPase activity were 153.36 U/ml,126.00 U/ml,17.64 U/ml and 30.48 U/ml,respectively.

yellow water;cellulase;microorganism;phylogeny;enzyme activity

TQ920.6

0254-5071（2016）11-0059-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.012

2016-08-02

教育部春暉計劃項目（Z2014060）；四川省應用基礎項目（2016JY0253）；省級大學生創新訓練項目（201510623081）

曾林（1992-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物技術。

*通訊作者：張慶（1979-），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物技術。