一株阿里地區產纖維素酶菌株的篩選與鑒定

何佳佳，關琳燕，劉小舟，周亞婷，文習東，林凌*

（安徽師范大學生命科學學院，安徽蕪湖241000）

一株阿里地區產纖維素酶菌株的篩選與鑒定

何佳佳，關琳燕，劉小舟，周亞婷，文習東，林凌*

（安徽師范大學生命科學學院，安徽蕪湖241000）

從西藏阿里地區岡仁波齊山脈附近篩選得到了一株產纖維素酶的細菌G1，經形態觀察與16S rDNA的序列分析鑒定其為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。該菌株在30℃、pH 7的初始條件下培養76 h后產酶量達到最高，酶活力為0.3 U/mL。酶學性質研究表明，B.licheniformisG1所產纖維素酶的分子質量約為65 ku，其最適反應溫度為55℃，在30～60℃范圍內保持50%以上的活力；其最適反應pH為6.0，在pH 5.0～6.0范圍內保持95%左右的酶活力；此外，Mn2+對其纖維素酶活力有明顯的促進作用，而Cu2+、Mg2+、乙二胺四乙酸（EDTA）對該酶活有較強的抑制作用。

阿里地區；纖維素酶；地衣芽孢桿菌；酶學性質

西藏是我國傳統的五大牧區之一，被譽為“世界屋脊”，而阿里地區是世界屋脊的屋脊，以高原寒帶草原為主，生態系統以其自身的臨界性和生物獨特的適應機理為基本特征，分布著特有、珍稀的生物資源[1]。因此，開發阿里地區土壤微生物資源能為我國生物資源的保護和利用做出實質性的貢獻。而纖維素材料是目前解決人類面臨的糧食問題、能源問題和環境問題的最有前景的資源，研究開發纖維素資源有著深遠的意義。纖維素酶是多組分酶系，能通過協同作用水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵，使纖維素水解成為纖維二糖和葡萄糖[2]。目前，纖維素酶的應用已進入了食品、釀造、飼料、紡織、能源等工業領域，有關纖維素酶的應用途徑仍在不斷開拓，潛力很大[3]。在釀酒行業中，纖維素酶能提高酒類產品的出品率[4]，而且地衣芽孢桿菌具有促進釀酒酵母產2-甲基丁酸和4-乙烯基愈創木酚等風味物質的功能，從而進一步提高酒的口感和品質[5]。因而產纖維素酶的地衣芽孢桿菌在釀酒行業中具有良好的應用前景。

從西藏阿里地區的岡仁波齊山脈附近土壤樣品中篩選到了一株產中性纖維素酶的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）菌株，并對其酶學性質進行初步研究，期望能為該酶在釀造工業和能源方面的開發和應用奠定一定的基礎，并為豐富阿里地區生物資源庫的工作提供實驗方法和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

土壤樣品采集自西藏阿里地區岡仁波齊山附近，取樣坐標為東經81.3°，北緯31°，海拔4 675 m。

1.1.2 試劑

剛果紅染色液：稱取剛果紅粉末溶解于蒸餾水中，使其終質量濃度為1 g/L。

剛果紅脫色液：終濃度為1 mol/L的NaCl溶液。

3,5-二硝基水楊酸顯色劑（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：稱取分析純的NaOH 104 g，分析純3,5-二硝基水楊酸30 g，分析純酒石酸鉀鈉910 g，重蒸苯酚25 g和無水亞硫酸鈉25 g溶于2 500 mL水，貯存于棕色瓶中，避光保存，放置一星期后過濾使用。

羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose-Na，CMC-Na）溶液：準確稱取1 g羧甲基纖維素鈉并用pH 6.0磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液溶解定容至100 mL，配制成終質量濃度為10 g/L的CMC-Na緩沖溶液。

1.1.3 培養基

纖維素富集培養基（1 L）：MgSO40.1 g，CaCl20.1 g，（NH4）2SO42.0 g，K2HPO42.0 g，KH2PO40.5 g，NaCl 6 g，瓊脂15 g，CMC-Na 10 g，pH調節至7.0。

發酵液體培養基（1 L）：酵母粉5 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，CMC-Na 1 g，pH調節至7.4。

纖維素篩選培養基（1 L）：在纖維素富集培養基中加入酵母粉1 g。

快速檢驗培養基：瓊脂1.5%，CMC-Na 1%。

1.2 儀器與設備

iCycler型PCR儀：美國伯樂公司；SKY2102C型恒溫搖床：上海蘇坤實業有限公司；UV-1700型紫外分光光度儀：日本島津公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；5415D型臺式高速離心機：德國Eppendorf公司；DHP-360型恒溫培養箱：常州中捷實驗儀器制造有限公司；超濾管（孔徑為10 ku）：MILLIPORE（中國）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 產纖維素酶菌株初篩

量取100 mL的無菌水倒入帶有玻璃珠的三角瓶中，稱取土壤樣品1g并充分混勻于無菌水中，形成10-2稀釋液，然后再按10倍稀釋法依次添加無菌水稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液。取10-3、10-4、10-5三個稀釋度的稀釋液各0.1 mL涂布于纖維素富集培養基平板上，置入28℃恒溫培養箱中倒置培養2d，初步篩選出能利用該纖維素的若干菌株。

1.3.2 產纖維素酶菌株復篩

待上述菌落長出后，用滅菌的牙簽挑取生長良好的單一菌落依次點種于纖維素篩選培養基上，置入28℃恒溫培養箱中倒置培養3 d，待長出菌落后，用剛果紅染色液染色10 min，倒去染液后用適量1 mol/L的NaCl溶液脫色20 min，依據透明圈直徑和菌落直徑比值的大小來判斷和選擇高產纖維素酶菌株[6]。

1.3.3 細菌的分子鑒定

細菌基因組DNA的提取：將菌株接種到5mL培養基中，180 r/min，28℃培養過夜。取細菌培養液5 mL，10 000 r/min離心1 min后棄去上清液。用TIANGEN基因組純化試劑盒提取篩選所得菌株的基因組DNA。

細菌16S rDNA基因擴增及分子鑒定：以菌株基因組DNA為模板，以16S rDNA通用引物進行PCR擴增，并將產物送至南京金斯瑞生物技術公司進行DNA序列測定，用美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中的BLAST軟件將所得序列與GenBank數據庫中的16S rDNA序列進行分析比較，并用MEGA7.0軟件構建系統發育樹。其中，引物序列為：27F：5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGY TACCTTGTTACG ACT T-3′。

1.3.4 搖瓶發酵實驗

將分離得到菌種接種于5 mL發酵液體培養基中活化24 h后，按1%的接種量接種于100 mL發酵液體培養基中，于28℃、180 r/min搖床中進行搖瓶發酵90 h，同時測定菌液各階段波長600 nm處的OD600nm值。將所得發酵液進行4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液作為粗酶液用于各階段的酶活測定。

1.3.5 纖維素酶活測定

葡萄糖標準曲線的繪制：分別吸取1 mg/mL的葡萄糖標準溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于比色管中，加入蒸餾水至2 mL，配制成一系列不同濃度梯度的葡萄糖溶液。充分搖勻后，向各管中加入2 mL DNS溶液搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻至室溫后，用蒸餾水定容至20 mL，充分混勻。利用分光光度計在波長540 nm處測定各管溶液的光密度值并記錄結果。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，對應的吸光度值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

酶活測定方法：取6個EP管，分別加入50 μL用0.2 mol/L pH 6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制的1%CMC-Na溶液，在實驗組中加入50 μL適當稀釋的酶液，分別于55℃反應1 h后，在對照組中加入100 μL DNS和50 μL適當稀釋的酶液，實驗組中加入100 μL DNS試劑終止反應，樣品置于沸水浴中煮沸5 min，冷卻后加入800 μL蒸餾水稀釋定容至1 mL，以蒸餾水的吸光值為空白對照，于波長540 nm處測定該酶液的吸光度值，并根據標準曲線（y=0.975 5x+ 0.064 05）計算還原糖含量。以每分鐘生成1 μmol葡萄糖所需的酶量作為一個酶活單位，計算出纖維素酶的酶活力，以U/mL表示[7]。

1.3.6 酶學性質研究

酶的最適溫度測定是按照酶活測定方法，取適當稀釋的酶液分別在30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃條件下測定酶活，以最高的酶活計為100%計算相對酶活力（%）。酶的熱穩定性測定是將酶在上述不同溫度條件下保溫1 h，迅速冷卻后，參照1.3.5酶活測定方法測定殘余酶活力（%）。

酶的最適pH值測定是按照酶活測定方法，以不同緩沖液（pH值3.0～8.0為磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液，pH值9.0～11.0為甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液）校準濃縮酶液的pH值，在酶反應的最適溫度條件下測定酶活力，最高酶活計為100%，參照1.3.5酶活測定方法計算各反應體系相對酶活。

酶促進劑和抑制劑研究是在相同條件下，向反應液中分別加入不同的離子或有機試劑，包括K+、Na+、Li+、NH4+、Cu2+、Co2+、Rb2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、二甲亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Triton X-100、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），使其終濃度為1 mmol/L，同時以不添加離子或有機試劑的反應液作為100%對照，在酶反應的最適條件下測定各離子對酶活力的影響，以殘余酶活（%）表示。

1.3.7 蛋白質分子質量大小測定

纖維素酶蛋白的分離純化（超濾法）：取一定量菌液于離心管中，于高速冷凍離心機中8 000 r/min離心10 min后取上清作為粗酶液。取20 mL粗酶液分批加入濾膜孔徑為10 ku的超濾管中依次離心（每次離心后棄去下層廢液），最后得超濾后的濃縮酶1 mL，再稀釋至7 mL備用（濃縮比為1∶20）。

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：將十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳體系[8]中的SDS均換成去離子水后，將超濾后的濃縮酶和非變性上樣緩沖液1∶1混合后上樣進行非變性凝膠電泳。待電泳完成后，取出凝膠，并將其放置在快速檢驗平板上孵育2 h后取出平板上的凝膠，用考馬斯亮藍染色30 min后用相應脫色液對其進行脫色處理。同時對快速檢驗平板進行剛果紅染色10 min，再進行脫色處理。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：將非變性膠上與快速檢驗平板上檢驗出活性的相匹配條帶切割下來，并切成顆粒狀收集于EP管中，加入200 μL磷酸緩沖液于4℃靜置24 h。取上清液和上樣緩沖液1∶1混合后作為上樣液進行電泳。待電泳完成后，取出凝膠用考馬斯亮藍染色30 min，用脫色液進行脫色處理。根據蛋白質分子質量標準，確定B.lincheniformisG1菌株所產纖維素酶的分子質量大小。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

圖1 菌株的菌落形態Fig.1 Colony morphology of strains

從西藏岡仁波齊附近的土壤中篩選得到的菌株菌落形態如圖1所示，水解圈結果見圖2。菌落呈乳白色，半干燥，邊緣絲狀分枝，其革蘭氏染色呈陽性。如圖2所示，菌株在纖維素篩選培養基上生長良好（圖2a），經剛果紅染色后形成了明顯的透明水解圈（圖2b），且水解圈直徑與菌落直徑的比值為1.7，表明菌株具有良好的產纖維素酶活性。

圖2 篩選菌株的水解圈Fig.2 Hydrolyzation circle of the screened strains

2.2 菌株16SrDNA系統進化樹的構建

圖3 菌株的16S rDNA的電泳結果Fig.3 16S rDNA electrophoresis results of the strain

圖4 B.lincheniformisG1的16S rDNA系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree ofB.lincheniformisG1 based on 16S rDNA analysis

以菌株G1的總DNA為模板，以16S rDNA通用引物進行PCR擴增，并送至南京金斯瑞生物公司測序，擴增結果見圖3。測序所獲得的序列用BLAST在NCBI數據庫中進行序列比對，最后使用MEGA 7.0中的Neighbor-joining法[9]構建系統發育樹，結果見圖4。由圖4可知，該菌株與芽孢桿菌屬（Bacillus）表現良好的同源性，且與地衣芽孢桿菌屬（Bacillus licheniformis）同源關系最近，高達99%。同時結合圖1中菌落的形態特征和測序結果，初步鑒定其為地衣芽孢桿菌（Bacillus lincheniformis），命名為B.lincheniformisG1。

2.3 搖瓶發酵與產酶曲線

圖5 菌株的發酵產酶曲線Fig.5 Enzyme production curve of strain fermentation

對搖瓶發酵的各個階段菌液吸光度值和纖維素酶活力進行測定，繪制菌株生長曲線與產酶曲線見圖5。由圖5可知，該菌的生長延滯期為8 h，從第12小時開始逐步進入對數生長期。培養48 h后該菌進入穩定期，并于第76小時逐漸進入衰退期。該菌的產酶曲線顯示，在其處于延滯期時就開始產微量的纖維素酶，并在菌體的對數生長期逐漸積累纖維素酶，之后在菌體的穩定期仍然保持較高的產酶速率，且在第76小時纖維素酶積累量最多，酶活達到0.3 U/mL，為最高酶活的94%。隨后，其產酶速率隨著菌體生長的衰退而逐步下降。由此可以看出，該菌的產酶曲線與生長曲線保持一致，二者表現出耦聯的特性。

2.4 蛋白質分子質量測定

圖6 G1菌株的所產纖維素酶的凝膠電泳分析及酶譜Fig.6 SDS-PAGE and zymogram analyses of the cellulase from strainB.lincheniformisG1

通過蛋白質非變性凝膠電泳鑒定B.licheniformisG1菌株所產纖維素酶的酶譜，結果如圖6所示。由圖6可知，濃縮膠板上脫色后只有1條清晰的水解帶，說明發酵粗酶液中只含有一種纖維素酶活性成分，對應的分子質量大小為65 ku左右，與已經克隆出來的地衣芽孢桿菌GXN 151的纖維素基因cel 5A編碼的蛋白的分子質量（約59.6 ku）大小一致[10]。

2.5 酶學性質研究

2.5.1 酶的最適溫度與熱穩定性

圖7 反應溫度對酶活力的影響Fig.7 Effect of reaction temperature on enzyme activity

不同反應溫度對酶活的影響結果如圖7所示，該酶在55℃時的酶活力最高，達0.3 U/mL。此外，該酶在30～70℃時保持較高的酶活力，達最高酶活的40%左右。

將該酶在不同溫度下保溫1 h后，置于最適條件下反應測定纖維素酶活力，結果如圖8所示。該酶在低溫區（30～60℃）酶活力穩定性較好，有較高的耐受性，能保持50%以上的活力，當溫度高于70℃時，酶活力迅速下降，表明該纖維素酶對此溫度較為敏感，容易變性喪失活性。

圖8 酶的熱穩定性Fig.8 Thermal stability of cellulase

2.5.2 酶的最適pH

測定酶在不同pH緩沖液中的酶活力，結果如圖9所示。由圖9可知，該酶在pH值6.0的條件下酶活力最高，說明這是一類中性纖維素酶。此外，該酶在pH值為5.0～6.0之間表現高達95%左右的纖維素酶活力，這一點對反應中酶活性的控制具有重要意義。

圖9 pH對酶活力的影響Fig.9 Effect of pH on enzyme activity

2.5.3 金屬離子對酶活力的影響

在pH值6.0、最適溫度55℃的條件下測定各離子和有機試劑對纖維素酶活力的影響，以不加金屬離子的酶活設為100%，結果如圖10所示。由圖10可知，NH4+、Ca2+、Mn2+、SDS均對該酶有促進作用，其中Mn2+促進作用最明顯，達到了120%。而Cu2+、Mg2+、EDTA對酶活有較強的抑制作用，其他離子對酶的作用不明顯。

圖10 金屬離子對酶活力的影響Fig.10 Effect of metallic ions on enzyme activity

2.6 討論

現如今，利用纖維素生產乙醇已經掀起了全世界研究的熱潮[11]，通過統合生物加工技術，在天然產醇菌株如釀酒酵母中重組表達纖維素酶使之能利用纖維素產醇[12-13]，能夠有效地降低成本。有研究表明，在混合培養發酵體系中添加地衣芽孢桿菌，能夠影響釀酒酵母的乙醇及有機酸代謝，這對于白酒品質調控及微生物間相互作用都具有重要意義[14]。本實驗中的B.lincheniformisG1菌株其搖瓶培養時纖維素酶積累量最高為0.3 U/mL單位的酶活力，與已報道的地衣芽孢桿菌LY02菌株按1.5%接種量時所產纖維素酶的活力（誘變前為0.535 1 U/mL，誘變后0.718 7 U/mL）較為接近，而且所產的纖維素酶表現出更好的耐熱性（30～70℃）和更大范圍的pH適應性（pH 5.0～8.0）[15]。

3 結論

本實驗從西藏阿里地區的岡仁波齊山脈附近土壤中篩選得到一株產纖維素酶菌株，通過形態學與分子生物學鑒定，確定該菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），命名為B.lincheniformisG1。對B.lincheniformisG1所產纖維素酶的酶學性質研究后發現，其所產纖維素酶的分子質量約為65 ku，該酶最適溫度為55℃，最適pH值為6.0，屬于中性纖維素酶。同時，該酶的溫度耐受范圍較廣，能在30～60℃范圍內保持50%以上的活力；在pH 5.0～6.0范圍內保持95%左右的酶活力，因而對于偏酸性的環境較為適應。此外，大多數的離子與有機試劑對該酶的活力影響不大，其中Mn2+對酶活力有明顯的促進作用，而Cu2+、Mg2+、EDTA對該酶活力表現出抑制作用。

本實驗所采集的B.lincheniformisG1菌株的棲息地——西藏阿里地區，位于我國西部，區內高寒缺氧，自然條件惡劣，生物資源開發利用較少，因此在能源和資源的利用上存在較大的空白，可為阿里地區生物資源的綜合開發和利用做出重要的貢獻，并且有望在釀酒和能源行業中發揮實質性的作用。

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Screening and identification of a cellulase-producing strain from Ngari prefecture

HE Jiajia,GUAN Linyan,LIU Xiaozhou,ZHOU Yating,WEN Xidong,LIN Ling*
(College of Life Sciences,Anhui Normal University,Wuhu 241000,China)

A cellulase-producing bacterium,named as G1,was isolated from the soil of the Kangrinboqe Mountains in Ngari prefecture of Tibet.The strain was identified asBacillus licheniformisaccording to the morphological identification and 16S rDNA sequence analysis.The optimized enzyme production could be obtained when the strain was cultivated for 76 h at 30℃with initial pH 7,and the maximum cellulase activity was 0.3 U/ml.The property analysis demonstrated that the molecular weight of the cellulase produced byB.licheniformisG1 was 65 ku,and its optimum reaction condition was temperature 55℃,pH 6.0.Moreover,the enzyme maintained more than 50%of its activity in the range of 30-60℃,and 95%of CMCase activity was obtained at the pH range of 5.0-6.0.Furthermore,Mn2+had obvious promoting effect on cellulase activity,while Cu2+,Mg2+,EDTA had strong inhibitory effect on the enzyme activity.

Ngari prefecture;cellulase;Bacillus licheniformis;enzymatic property

Q816

0254-5071（2016）11-0064-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.013

2016-06-02

安徽省自然科學基金資助項目（1208085QC56）；《分子生物學》國家級質量工程雙語教學示范課程資助項目（高教函[2009]19號）

何佳佳（1995-），女，本科生，研究方向為微生物學。

*通訊作者：林凌（1980-），男，副教授，博士，研究方向為酶學。