液態發酵生產水溶性紅曲黃色素的條件優化

李瑞杰，謝玉梅，何思琴，王磊，陳莎，高夢祥，李利*

（長江大學生命科學學院，湖北荊州430025）

液態發酵生產水溶性紅曲黃色素的條件優化

李瑞杰，謝玉梅，何思琴，王磊，陳莎，高夢祥，李利*

（長江大學生命科學學院，湖北荊州430025）

以紅色紅曲菌（Monascus ruber）M-7為實驗菌株，以色價和色調為評價指標，對液態發酵生產水溶性紅色紅曲黃色素的條件進行了研究。結果表明，培養基pH值為3～4時，紅色紅曲菌M-7能合成大量的水溶性紅曲黃色素，發酵液呈鮮艷的黃色色調；培養基最優碳源為2%蔗糖，最優氮源為0.2%硫酸銨；水溶性紅色紅曲黃色素的色價和色調值隨著培養時間的延長先升后降，在第8天時達到最高，色價為5.56 U/mL，OD400nm/OD510nm為10.29，OD400nm/OD470nm為3.93。

紅色紅曲菌；水溶性紅曲黃色素；液態發酵

隨著人們健康意識的提高，天然食用色素越來越受到國內外消費者的青睞。紅曲色素（Monascuspigments）是我國近年來增長速度最快的天然食用色素，是紅色紅曲菌（Monascus ruber）發酵產生的次生代謝產物，包括黃色、橙色和紅色三類色素組分，在我國及東南亞地區已有超過1000年的應用歷史，目前在歐美等國家的肉制品（如火腿腸）中也得到了很好的應用[1-2]。

黃色素是重要的食用色素，約占市場需求量的60%以上[3]。目前，市售的食用黃色素產品以植物提取為主（如姜黃素、梔子黃等[4]），因而易受季節、氣候、產地等因素的影響。相比之下，采用微生物發酵法進行天然食用色素的生產，不受季節限制、原料轉化率高、成本低，是目前世界食品色素添加劑的發展趨勢。目前，市場上應用廣泛的紅曲色素以紅色素為主，而紅曲黃色素的生產起步較晚，目前生產廠家也很少，產品并未大規模上市，而且存在色價和色調都不高等問題[3]，因此，紅曲黃色素的開發研究具有廣闊的前景，可產生顯著的經濟效益。

有研究表明，紅曲菌所產生的紅曲色素包括醇溶性組分和水溶性組分[1]。目前的紅曲色素產品一般以醇溶性組分為主，水溶性較差，應用范圍主要限制于油性食品（如火腿腸、香腸等）中。近年來，通過菌種的選育和發酵培養基的優化來獲得高色價和色調值的紅曲黃色素已取得一定成果[5-12]，但也均以生產醇溶性紅曲黃色素為主。為豐富紅曲黃色素產品的種類，促進其在飲料等非油性食品中的應用，本研究以紅曲色素高產菌株—紅色紅曲菌M-7為實驗材料，通過液體發酵法研究了水溶性紅曲黃色素的生產條件，以探索一種安全、高效、低成本的水溶性紅曲黃色素的生產方法，為其工業規模化生產提供基礎和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

紅色紅曲菌（Monascus ruber）M-7：由華中農業大學陳福生教授惠贈，該菌株為紅曲色素高產菌株。

1.1.2 培養基

紅曲菌孢子培養基（查氏酵母瓊脂（Czapek yeast exatract agar，CYA））：NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖30 g，酵母膏5 g，蒸餾水1 L，瓊脂20 g，pH 5.5。

液態發酵種子制備培養基：在1 L蒸餾水中加入去皮馬鈴薯200 g，煮沸30 min，用4層紗布過濾，濾液中加葡萄糖20 g，定容至1 L。

水溶性紅曲黃色素液態發酵培養基[13]：谷氨酸鈉5.04 g，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 1 g，ZnSO4·7H2O 0.01 g，MnSO4·H2O 0.003 g，葡萄糖20 g，0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 3、4、5、6、7或8）0.5 L，蒸餾水0.5 L。

以上培養基滅菌條件為：121℃，20 min。其中水溶性紅曲黃色素液態發酵培養基中的葡萄糖單獨滅菌，滅菌條件為115℃，15 min。

1.2 儀器與設備

TE124S電子分析天平、PB-10 pH計：德國賽多利斯公司；Mini Spin Plus離心機：德國Eppendorf公司；HVE-50高溫滅菌鍋：日本Hirayama公司；U-1900雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；SPX-100B-Z生化培養箱：上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；疊加式IS-RDS3搖床：美國Crystal公司；GZX-6000電熱恒溫鼓風干燥箱：上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 水溶性紅曲黃色素的發酵

（1）孢子懸浮液的制備：將保存在4℃的菌種接種到CYA斜面上，28℃培養10 d，加入5 mL無菌水洗下孢子，用雙層擦鏡紙過濾除去菌絲，玻璃珠將孢子振蕩打散，血球計數板計數。

（2）種子的培養：250 mL三角瓶中裝液態發酵種子制備培養基50 mL，接種孢子懸浮液，使孢子的終濃度為103個/mL，28℃、220 r/min振蕩培養40～44 h，作為種子液。

（3）液態發酵：250 mL三角瓶裝水溶性紅曲黃色素液態發酵培養基100 mL，接入上述種子液10 mL，28℃、220 r/min振蕩培養2～9 d。

1.3.2 生物量的測定

采取干質量法，即發酵完成后，發酵液用布氏漏斗抽濾得到菌絲體，用3倍體積的蒸餾水洗滌菌絲體，于60℃中干燥至質量恒定，稱質量。

1.3.3 色價的測定

發酵液用布氏漏斗抽濾得到濾液，12 000 r/min離心3 min，稀釋一定倍數，于200～600 nm進行全波段掃描，分別取波長400 nm、470 nm和510 nm處吸光度值計算黃色素、橙色素和紅色素的色價。色價計算公式：

1.3.4 色調的測定

本實驗色調定義為黃色素/紅色素=OD400nm/OD510nm；黃色素/橙色素=OD400nm/OD470nm。

2 結果與分析

2.1 pH對紅色紅曲菌產水溶性黃色素的影響

據報道，pH對紅曲色素的產生有一定影響[13-15]。一般認為，酸性條件下主要產物為紅曲黃色素和紅曲橙色素；中性或堿性條件下主要產物為紅曲紅色素。為了實現紅曲黃色素的生產，首先利用檸檬酸-磷酸鹽緩沖液制備不同pH的發酵培養基，研究pH對紅曲菌液態發酵產色素的影響，結果見圖1。

圖1 pH對水溶性紅曲黃色素色調的影響Fig.1 Effect of pH on color tone of water soluble yellow Monascuspigment

由圖1可知，發酵培養基的pH對色素的種類影響很大，在pH3和pH4時，紅曲菌M-7產生較多的水溶性黃色素，發酵液呈鮮艷的黃色色調，OD400nm/OD510nm分別為4.50和3.76，OD400nm/OD470nm分別為2.48和2.40，黃色素的色價分別為1.04U/mL和0.95U/mL；而當pH為5、6、7和8時，紅曲菌M-7產生較多的水溶性紅色素，發酵液呈明顯的紅色色調，OD400nm/OD510nm依次為1.66、1.07、0.69和0.68，OD400nm/OD470nm依次為1.44、1.00、0.74和0.73。該結果中pH對紅曲色素影響的規律與文獻報道基本一致[13-15]。因此，將發酵培養基的pH值控制在3～4，可實現水溶性紅曲黃色素的發酵生產。在后續實驗中，均將發酵培養基的pH值控制在3～4。

2.2 碳源種類對紅色紅曲菌產水溶性黃色素的影響

分別以2%的可溶性淀粉、玉米粉、大米粉、蔗糖、馬鈴薯淀粉、葡萄糖為碳源，0.5%谷氨酸鈉為氮源，初始pH值為3.0，發酵2 d后，考察碳源種類對發酵液中水溶性紅曲黃色素色價和色調的影響，結果見圖2。

由圖2A可知，以可溶性淀粉、蔗糖和馬鈴薯淀粉為碳源時水溶性紅曲黃色素的產量較高，色價均＞80U/g菌體干質量；由圖2B可知，蔗糖為碳源時的色調值最高，OD400nm/OD510nm、OD400nm/OD470nm分別是4.75、2.35，表明此時產生的水溶性紅曲黃色素所占比例最大，純度較高。因此，確定蔗糖為發酵培養基的最佳碳源。

圖2 碳源種類對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(B)的影響Fig.2 Effect of carbon sources on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

2.3 碳源含量對紅色紅曲菌產水溶性黃色素的影響

圖3 葡萄糖含量對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(B)的影響Fig.3 Effect of glucose concentration on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

分別以1%、2%、3%、4%、5%的蔗糖為碳源，0.5%的谷氨酸鈉為氮源，初始pH值為3.0，發酵2 d后，考察碳源濃度對發酵液的水溶性紅曲黃色素色價和色調的影響，結果見圖3。

由圖3可知，當蔗糖含量＞3%時，對水溶性紅曲黃色素的產生有一定抑制作用，類似結果在醇溶性紅曲黃色素發酵過程中也有報道[7]，可能是過高的滲透壓對水溶性紅曲黃色素的產生有不利影響。綜合色價和色調值來看，產水溶性紅曲黃色素最佳的葡萄糖含量為2%，此時色價為90.03U/g菌體干質量，OD400nm/OD470nm為2.35，OD400nm/ OD510nm為4.59。

2.4 氮源種類對紅曲菌產水溶性黃色素的影響

分別以0.5%的酵母膏、蛋白胨、谷氨酸鈉、硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨為氮源，2%的蔗糖為碳源，初始pH值為3.0，發酵時間2 d后，考察氮源種類對發酵液中水溶性黃色素色價和色調的影響，結果見圖4。

圖4 氮源種類對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(B)的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

由圖4可知，6種氮源中，酵母膏實驗組2 d后未觀察到明顯的水溶性紅曲黃色素的產生，而其他氮源實驗組均有大量水溶性紅曲黃色素產生。與有機氮源酵母膏、蛋白胨、谷氨酸鈉相比，無機氮源硝酸鉀、硫酸銨、硝酸鉀更有利于水溶性黃色素的產生，其中以硫酸銨為氮源時，黃色素的色價（110.69 U/g）和色調（OD400nm/OD470nm為2.69，OD400nm/OD510nm為4.54）均較高，故選擇硫酸銨為較優氮源。

2.5 氮源含量對紅曲菌產水溶性黃色素的影響

分別以0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%的硫酸銨為氮源，2%的蔗糖為碳源，初始pH值為3.0，發酵時間2 d后，考察氮源濃度對發酵液中水溶性紅曲黃色素色價和色調的影響，結果見圖5。

圖5 硫酸銨含量對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(B)的影響Fig.5 Effect of ammonium sulphate concentration on color value(A)and tone(B)of water soluble yellow Monascuspigment

由圖5可知，在所考察的濃度范圍內，硫酸銨對水溶性紅曲黃色素的色價和色調影響不明顯，從經濟節約的角度考慮，較優硫酸銨含量為0.2%。

2.6 發酵時間對紅曲菌產水溶性黃色素的影響

由于黃色素是紅曲菌的次級代謝產物，主要在生長后期大量產生，因此，在上述最佳碳、氮源種類和濃度的條件下，以培養時間為單因素，從發酵培養的第2天開始，每隔24 h測定發酵液的pH、色價和色調值，實驗結果見圖6。

由圖6可知，發酵過程中，培養基的pH是動態變化的，第2天到第5天緩慢下降，之后又呈上升趨勢，pH變化范圍在2.85～3.10范圍內，滿足紅色紅曲菌M-7產水溶性黃色素的基本要求。在水溶性紅曲黃色素的產量方面，前4天色價較低，從第5天開始，色價開始大幅提升，第8天達到最高值，為5.56 U/mL，第9天開始下降，可能是黃色素開始向紅色素轉化。

圖6 發酵時間對水溶性紅曲黃色素色價(A)及色調(B)的影響Fig.6 Effect of fermentation time on color value(A)and tone(B)of water soluble yellowMonascuspigment

在水溶性紅曲黃色素的純度方面，其變化趨勢基本與黃色素產量相似，從OD400nm/OD470nm和OD400nm/OD510nm的大小來看，5 d后黃色素的比例顯著提高，其中OD400nm/OD510nm在第8天達最大，為10.29，之后呈下降趨勢，第9天為9.74；而OD400nm/OD470nm一直保持緩慢上升趨勢，第8天為3.93，第9天為4.08。綜合考慮紅曲黃素的產量和純度，最佳發酵時間為8 d。

3 結論

本實驗以紅色紅曲菌M-7為實驗菌株，以色價和色調為評價指標，對液態發酵生產水溶性紅曲黃色素的條件進行了研究。

結果表明，將發酵培養基的pH控制在3～4，可實現高純度的水溶性紅曲黃色素的發酵生產，發酵產物呈鮮艷的黃色色調。

碳源對水溶性紅曲黃色素的發酵有顯著影響，以2%的蔗糖最佳，此時水溶性紅曲黃色素的色價和色調值在所考察的碳源中均最高。氮源對水溶性紅曲黃色素的發酵有顯著影響，以0.2%的硫酸銨最佳，此時水溶性紅曲黃色素的色價和色調值在所考察的氮源中均最高。

水溶性紅曲黃色素的色價和色調值隨著培養時間的延長先升后降，在第8天時達到最高，色價為5.56 U/mL，OD400nm/OD510nm為10.29，OD400nm/OD470nm為3.93。

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Optimization of liquid-state fermentation conditions for the production of water soluble yellowMonascuspigment

LI Ruijie,XIE Yumei,HE Siqin,WANG Lei,CHEN Suo,GAO Mengxiang,LI Li*
(College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou 430025,China)

UsingMonascus ruberM-7 as experimental strain,color value and color tone as evaluation index,the production of water soluble yellow Monascuspigment by liquid state fermentation was investigated.The results showed that when the fermentation medium pH was 3-4,a large portion of water soluble yellowMonascuspigment was synthesized byM.ruberM-7,and the fermentation broths was bright yellow.The optimal carbon source of the medium was sucrose 2%,and the optimal nitrogen source was ammonium sulfate 0.2%,respectively.The color value and the color tone of water soluble yellowMonascuspigment increased in the early stage,decreased in the late stage,and the maximum points were on the 8thday.After 8 d cultivation,the production of water soluble yellowMonascuspigment was 5.56 U/ml,OD400nm/OD510nmwas 10.29 and OD400nm/OD470nmwas 3.93.

Monascus ruber;water soluble yellowMonascuspigment;liquid-state fermentation

TS264.4

0254-5071（2016）11-0073-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.015

2016-04-19

國家自然科學基金資助項目（31501453；31371829）；長江大學大學生創新創業訓練計劃項目（20150089）

李瑞杰（1994-），女，本科生，研究方向為食品質量與安全。

*通訊作者：李利（1983-），女，講師，博士，研究方向為食品微生物學。