山西老陳醋大曲中優良乳酸菌高密度培養條件優化的研究

李江涌，王如福*，張懷敏，邢曉瑩，于迪，喬羽

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西晉中030800）

山西老陳醋大曲中優良乳酸菌高密度培養條件優化的研究

李江涌，王如福*，張懷敏，邢曉瑩，于迪，喬羽

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西晉中030800）

該研究以山西老陳醋大曲中分離篩選得到的1株優良乳酸菌戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）為研究對象，以乳酸菌活菌數為評價指標，通過單因素試驗設計研究培養條件（溫度、起始pH、接種量）對該菌株生長繁殖的影響；并利用響應面法對該菌株進行高密度培養條件的優化。結果表明，優化后的最佳培養條件為：培養溫度25℃，初始pH值6.67，接種量5.0%。在此條件下，乳酸菌活菌數為2.89×109CFU/mL。驗證試驗表明，實際值與理論值基本相符。

大曲；戊糖片球菌；培養條件；響應面法

山西老陳醋大曲以大麥和豌豆為原料經過多道工序加工而成，大曲是一種天然的培養基，其中的微生物包括霉菌、酵母菌、乳酸菌、醋酸菌、芽孢細菌等[1]。大曲是一個相對穩定的微生物生態系統，是山西老陳醋的物質基礎、酶基礎和微生物基礎[2-4]。在山西老陳醋釀造過程中，乳酸菌能夠利用葡萄糖等碳源進行同型或者異型乳酸發酵，并產生大量的乳酸及少量的甲酸、乙酸、丙酸等酸性末端產物，這些產物對其風味的形成發揮著重要作用[5]。近年來，有關乳酸菌應用于食醋釀造的研究大多數是在液體發酵過程中的應用。趙春燕等[6]利用醋酸菌、乳酸菌和酵母菌的協同發酵，有效減少了醋的刺激性酸味，且其酯香有所增加；蔣忠等[7]在液態深層法釀醋中加入乳酸菌和酵母菌，最終使得所釀醋不揮發酸和酯類含量分別提高了10.25倍和1.62倍，并且達到改善食醋感官品質的目的。

乳酸菌代謝產物對于山西老陳醋的重要作用表現在以下幾方面：乳酸菌發酵葡萄糖形成的乳酸減輕了醋酸刺激性氣味，使食醋的口感變得醇香柔和；乳酸菌產生的乳酸和部分醇類形成酯類物質，增加食醋的酯香；乳酸菌除了可以通過自身的初級代謝和次級代謝合成一些風味物質，其代謝中間產物丙酮酸還可作為其他眾多風味物質的前體物質，賦予山西老陳醋濃郁的香味[8-9]；乳酸菌的活動產生大量乳酸還可以降低釀造過程中酒醅及醋醅的pH值，抑制雜菌的生長，保證食醋釀造的順利進行。

響應面分析（response surface analysis，RSA）方法是基于數學和統計學的緊密結合，它把回歸方法作為函數的估算工具，在多個因素試驗中，用多項式將因素與響應值的關系函數化，并且對影響因素的各因子水平和其交互作用進行優化與評價[10-13]。該法可快速有效地確定多因子系統的最佳條件，并且已經廣泛地應用于培養基的優化以及各類發酵條件的優化中[14-19]。

本試驗對分離自山西老陳醋大曲中的一株優良乳酸菌進行人工培養，測定其生物學特性，采用單因素及正交試驗探索其在人工環境下的最佳生長條件，為規模化生產乳酸菌制劑提供理論基礎，并為乳酸菌強化應用于山西老陳醋發酵過程中，從而為提高山西老陳醋乳酸含量提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），編號為L20，該菌株是本實驗室從山西老陳醋大曲中分離、篩選，由本實驗室保藏。

1.1.2 培養基

MRS肉湯培養基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉4.0 g、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.2 g、檸檬酸三胺2.0 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1.0 L，121℃、20 min滅菌。

MRS瓊脂培養基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉4.0 g、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.2 g、檸檬酸三胺2.0 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1 mL、瓊脂粉15.0 g、蒸餾水1.0 L，121℃、20 min滅菌。

1.2 儀器與設備

DL-CJ-1ND型無菌超凈工作臺：北京東聯哈爾濱儀器設備有限公司；SPX-100B-Z生化培養箱：北京瑞科中儀科技有限公司；ZQPL-200立式全溫振蕩培養箱：天津市萊博特瑞儀器設備有限公司；MCS-3020全自動高壓滅菌器：日本三洋集團；722E可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；AR1140電子天平：上海皖衡電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗設計

采用單因素試驗設計方法，篩選最適培養方式、起始pH值、培養溫度及接種量，然后使用3因素3水平的響應面分析法對培養條件進行優化。

1.3.2 菌株L20的活化與培養

將冷凍保藏的戊糖片球菌L20在室溫下解凍后，無菌條件下接種到MRS液體培養基中富集，再按1%（V/V）比例轉接到MRS液體培養基中，30℃恒溫條件下培養，重復3次以恢復菌株活力[20]。戊糖片球菌L20充分活化后，以接種量1%（V/V）接入MRS液體培養基，于30℃恒溫培養12 h得到種子液。

1.3.3 菌株L20生長曲線的測定

采用比濁法原理測定戊糖片球菌L20的生長曲線。取處于對數生長期的菌懸液，按1%接種量接種至滅菌的MRS液體培養基上，在30℃條件下培養，每間隔3 h取樣測定OD600nm值，并記錄數據，測定周期48 h，以發酵時間為橫坐標，以OD600nm值為縱坐標，繪制菌株L20生長曲線。

1.3.4 乳酸菌數的測定

按照單因素試驗要求，在不同培養方式、接種量、培養溫度、起始pH值下，將戊糖片球菌L20接種至滅菌的MRS液體培養基上培養21 h后，取1 mL戊糖片球菌L20發酵液加入至9 mL無菌生理鹽水中，依次做10倍梯度稀釋液，選取2個適宜的連續稀釋倍數培養液進行平板計數，每個稀釋度做3個平行試驗。

1.3.5 單因素試驗

（1）培養方式對乳酸菌生長的影響

選用MRS培養基，按1.0%的接種量以厭氧、有氧和靜置的培養方式分別在厭氧培養箱、恒溫振蕩水浴鍋和恒溫培養箱中培養21 h，培養溫度為30℃，每種培養方式3個重復，測定L20乳酸菌活菌數取平均值。

（2）培養溫度對乳酸菌生長的影響

將培養溫度分別設定為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，將1.0%接種量接入培養液，不同溫度下進行乳酸菌的培養21 h，培養后測定其活菌數，確定菌株生長的最適培養溫度。

（3）培養基起始pH值對乳酸菌生長的影響

用1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉將MRS肉湯培養基的起始pH分別調至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，培養過程中不再調pH值，其他各條件與培養方式測定相同，培養21 h后，測定不同起始pH值條件下該菌株活菌數，確定最佳起始pH。

（4）接種量對乳酸菌生長的影響

將該乳酸菌株的接種量分別設定為1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%、11.0%，調節培養基起始pH值為6.0，在培養溫度為30℃條件下培養21 h，培養后測定活菌數，確定最適接種量。

1.3.6 響應面法優化乳酸菌的培養條件

在單因素試驗基礎上，以培養溫度（A）、起始pH值（B）及接種量（C）為影響因素，以菌株L20活菌數（Y）為響應值，再采用3因素3水平的響應面分析優化菌株L20的培養條件。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.7 數據統計

采用Sigma plot 10.0軟件對單因素試驗結果的數據進行分析；用Design Expert軟件中Box-Behnken試驗設計方法及進程對響應面設計進行二次響應面的分析。

2 結果與分析

2.1 菌株L20在MRS培養基中生長曲線的測定

以菌株L20培養時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，繪制菌株L20的生長曲線，結果見圖1。

圖1 菌株L20在MRS培養基上的生長曲線Fig.1 Growth curve of strain L20 in MRS medium

由圖1可知，菌株L20在0～6 h期間OD600nm值增長緩慢，6～18 h菌株OD600nm值迅速增長，21 h以后菌株的OD600nm值幾乎不變。這是由于菌體剛開始（0～6 h）處于延滯期，是菌體對培養基的適應階段，菌體數量增長緩慢；6～18 h時菌體處于對數生長時期，菌體快速繁殖，菌體數量快速升高；到21 h進入穩定期；因此把菌株L20在MRS培養基中的穩定期，即21 h作為最佳收獲期。

2.2 單因素試驗

2.2.1 培養方式對菌株L20生長的影響

由圖2可知，在MRS培養基中，菌株L20于30℃分別搖床培養（轉速150 r/min）、靜置培養、厭氧培養，21 h后菌株L20的活菌數分別為2.03×108CFU/mL、2.55×109CFU/mL、2.60×109CFU/mL。其中，靜置培養和厭氧培養的活菌數均顯著高于搖床培養，而且菌株靜置培養和厭氧培養的活菌數差異均不顯著（P＞0.05）。結果表明，培養方式對菌株L20的細胞生長量影響很大，靜置培養和厭氧培養優于振蕩好氧培養。本研究結果與蔡毅等[21]研究結果基本相符，因此，確定菌株L20采用靜置培養。

圖2 不同培養方式對菌株L20生長的影響Fig.2 Effects of cultivation methods on the growth of strain L20

2.2.2 培養溫度對L20菌株生長的影響

由圖3可知，培養溫度為25℃、30℃、35℃時，菌株L20的活菌數較多，其中，30℃培養的活菌數略高于25℃和35℃培養的活菌數，但統計分析差異不顯著；當溫度達到40℃、45℃時，菌株L20的存活率顯著下降，說明溫度過高會抑制菌株L20的生長，但是該溫度下不會影響菌株L20的存活，表明該菌株能適應山西老陳醋固態醋酸發酵的高溫環境（45℃左右）。結果表明，在30℃培養時，菌株L20活菌數達到最大值2.73×109CFU/mL，當培養溫度過高時，酶的活性受到抑制，故培養溫度＞35℃時，菌株L20活菌數明顯降低。因此，菌株L20的最適培養溫度為30℃。

圖3 培養溫度對菌株L20生長的影響Fig.3 Effects of culture temperatureon the growth of strain L20

2.2.3 培養基起始pH對菌株L20生長的影響

圖4 MRS培養基起始pH對菌株L20生長的影響Fig.4 Effects of initial pH of MRS medium on the growth of strain L20

由圖4可知，菌株L20分別在起始pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0梯度系列的MRS培養基中30℃靜置培養21 h后，菌株L20的活菌數呈現先增高后下降的趨勢，菌株L20最適生長的起始pH范圍為6.0左右。在起始pH值為6.0時培養菌株L20所得的活菌數顯著高于其他起始pH值組活菌數（P＜0.05），而且起始pH為6.0時，菌株L20活菌數最高為2.80×109CFU/mL。起始pH過低或過高（起始pH值為4或8時）會抑制菌株L20的生長。結果表明，起始pH值對L20乳酸菌活菌數生長量影響很大。因此，最終確定菌株L20的最適起始pH值為6.0。

2.2.4 接種量對菌株L20生長的影響

由圖5可知，不同接種量培養后，菌株L20活菌數存在較大差異。菌株L20活菌數隨著接種量的升高，呈現先增加后減少的總趨勢，在接種量為3.0%時，活菌數達到最大值2.81×109CFU/mL。因此，選擇3.0%接種量為宜。

圖5 接種量對L20生長的影響Fig.5 Effects of inoculum on the growth of strain L20

2.3 響應面法優化培養條件

2.3.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗的基礎上，以培養溫度（A）、起始pH值（B）及接種量（C）為影響因素，以菌株L20活菌數（Y）為響應值，通過Design-Expert.8.0.6的Box-Behnken的設計原理，對菌株L20的培養條件設計了3因素3水平試驗，試驗設計與結果見表2。

利用Design Export 8.0.6軟件對表2數據進行分析，得到二次多元回歸方程：Y=2.208×109-2.612×108A+7.888× 108B+2.750×107C+3.000×107AB-6.250×107AC-1.750× 107BC+1.710×108A2-1.112×109B2+1.385×108C2。對模型進行顯著性檢驗，結果見表2。

表2 響應面分析試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments

由表3可知，模型F值=29.00，P＜0.000 1，說明該回歸方程是極顯著的。另外，失擬項不顯著（P=0.322 4＞0.05），表明回歸方程具有顯著意義。回歸模型的復相關系數R2=0.973 9，說明該模型與實際情況擬合程度較好。能反應97.39%的變化。故可以用該模型對菌株L20不同培養條件下的生長情況進行分析和預測。模型數據顯示，一次項A、B及二次項B2影響極顯著（P＜0.01），交互項AB影響顯著（P＜0.05），但是，其他項對菌株L20的生長不顯著（P＞0.05）。利用DesignExport8.0.6軟件得到各個因素的最佳培養條件為培養溫度25.00℃，起始pH值6.67，接種量5.0%，在該條件下獲得的菌株L20活菌數理論值為2.99×109CFU/mL。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3.2 響應面分析

為綜合考察交互項對菌株L20活菌數的影響，對表2數據進行回歸擬合，得到回歸方程的等高線圖和響應面圖，結果見圖6。由圖6可知，培養溫度（A）和起始pH值（B）之間的交互作用對菌株L20活菌數具有顯著影響，其他因素之間的交互作用對菌株L20活菌數的影響不顯著。這一結果與回歸方程的交互項顯著性分析結果相符。

圖6 培養溫度、起始pH值及接種量對菌株L20活菌數影響的等高線和響應面Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interactions between culture temperature,initial pH and inoculum on viable counts of strain L20

2.4 驗證試驗

為了驗證上述相應面模型的有效性，以響應面分析得到菌株L20最佳的培養條件：培養溫度為25.00℃，起始pH值為6.67，接種量為5.0%，在該條件下獲得的菌株L20活菌數理論值為2.99×109CFU/mL。在該條件下進行3次平行試驗，得到該乳酸菌活菌數實際值為2.89×109CFU/mL稍低于理論值2.99×109CFU/mL，說明采用響應面法優化菌株L20的培養條件是行之有效的。

3 結論

采用二次響應面分析優化后菌株L20的最佳培養條件為培養溫度25.00℃、起始pH值為6.67、接種量5.0%。在該條件下，獲得的活菌數實際值為2.89×109CFU/mL。為今后將該菌株強化于釀醋大曲或應用于山西老陳醋釀造過程中的后續研究提供理論基礎和菌種培養條件信息。

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High density cultural conditions optimization of excellent lactic acid bacteria from Shanxi mature vinegar Daqu

LI Jiangyong,WANG Rufu*,ZHANG Huaimin,XING Xiaoying,YU Di,QIAO Yu
(College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Jinzhong 030800,China)

UsingPediococcus pentosaceus,an excellent lactic acid bacterium isolated fromDaquof Shanxi mature vinegar as research object,and lactic acid bacteria counts as evaluation index,the effects of temperature,initial pH,and inoculum on the viable counts were studied.High density culture condition ofP.pentosaceuswas optimized by response surface method,and the optimal conditions were as follows:culture temperature 25℃, initial pH 6.67 and inoculum 5.0%.Under these conditions,the count of lactic acid bacteria was 2.89×109CFU/ml.The verification tests results showed that the actual value was in accord with the theoretical value.

Daqu;Pediococcus pentosaceus;cultural conditions;response surface method

TS264.2

0254-5071（2016）11-0083-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.017

2016-08-21

山西省重點研發項目山西老陳醋產業關鍵技術開發與示范（2015-TN-10）

李江涌（1990-），男，碩士研究生，研究方向為農產品加工及貯藏工程。

*通訊作者：王如福（1960-），男，教授，博士，研究方向為發酵食品工藝、果蔬采后生理及貯運技術。