豆瓣醬制曲工藝條件優化

劉云珍，許喜林，劉永琪，劉冬梅*

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州510640）

豆瓣醬制曲工藝條件優化

劉云珍，許喜林，劉永琪，劉冬梅*

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州510640）

以蠶豆瓣為主要原料，以蛋白酶活為評價指標，研究了米曲霉（Aspergillus oryzae）和醬油曲霉（Aspergillus sojae）孢子粉對豆瓣制曲工藝的影響。通過單因素試驗分別研究了面粉添加量、制曲溫度、制曲時間、接種量對蠶豆曲蛋白酶活力的影響。在單因素試驗基礎上進行正交試驗，對制曲工藝條件進行優化。結果表明，最佳制曲工藝參數為制曲溫度28℃，制曲時間56 h，接種量2%，面粉添加量為10%，在此工藝條件下，蛋白酶活力為762 U/g。

蠶豆瓣；制曲；米曲霉；醬油曲霉；蛋白酶活力

蠶豆曲的制備是豆瓣醬制作的一個關鍵過程，好的蠶豆曲其菌株生長旺盛，為后發酵過程提供所需的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、果膠酶、轉氨酶等酶類。這些酶將大分子物質降解成多肽和游離氨基酸，其中蛋白酶活性的高低直接影響了豆瓣醬產品的質量，因此蛋白酶活力是評價成曲質量的重要指標。近年來，有關蠶豆曲制備的研究報道也越來越多。如楊進等[1]在傳統工藝的基礎上，研究了米曲霉（Aspergillus oryzae）和黑曲霉（Aspergillus niger）單獨制曲的溫度、接種孢子量、制曲時間等條件，確定了米曲霉和黑曲霉的最佳制曲工藝。李志江等[3]采用單因素試驗，確定了米曲霉和黑曲霉（質量比為1∶1）混合制曲的最佳工藝條件。貢漢坤[4]利用4因素3水平的正交試驗得到了米曲霉和醬油曲霉混合制曲時的最佳工藝條件：菌比例1∶1，制曲時間64 h，制曲溫度28℃，接種量1%。蠶豆曲質量的優劣會對原料的利用率和產品的色澤、風味、理化指標等產生直接的影響，為后期得到色澤好、口感佳的蠶豆醬，該階段應保持菌種良好的生長狀況，并且盡可能產生更豐富的蛋白酶等生物酶系。

本研究從制曲時間、制曲溫度、面粉添加比例和接種量出發，在制曲過程中加入米曲霉（Aspergillus oryzae）和醬油曲霉（Aspergillus sojae），以蠶豆曲的蛋白酶活力為指標，采用單因素和正交試驗探討了不同的制曲條件對成曲中蛋白酶活力的影響，旨在為提高蠶豆醬的品質提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶豆瓣：蜀香茗四川特產商城，存儲于-4℃冰箱備用；面粉：山東魯王集團有限公司；米曲霉（Aspergillus oryzae）和醬油曲霉（Aspergillus sojae）：篩選于蠶豆曲；曲精：米曲霉和醬油曲霉分別制得的孢子粉；氫氧化鈉、三氯乙酸、干酪素、酪氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：天津市福晨化學試劑廠；福林-酚試劑（分析純）：上海源聚生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MP502B型電子天平、JA2003型電子天平：上海精科儀器有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺：蘇州華科凈化技術有限公司；303型電熱恒溫培養箱：上海樹立儀器儀表有限公司；GI36TW型高壓滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋：廣東環凱微生物科技有限公司；DHG90型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海索譜儀器有限公司；DragonMed型手動單道可調式移液器：大龍醫療設備（上海）有限公司；XW-80A型微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制曲工藝流程[4-5]

曲精制備：將米曲霉（Aspergillus oryzae）和醬油曲霉（Aspergillus sojae）接種到麥麩培養基上，置于30℃培養箱中進行培養，間隔24 h搖瓶翻曲，以防曲料結塊。48～72 h后得到大量孢子的培養物，分離孢子得到曲精，放于4℃冰箱中保存備用。

面粉處理：將面粉置于121℃高壓滅菌鍋內滅菌15 min，之后無菌下過60目篩備用。

混合接種：蠶豆瓣出鍋后，無菌下攤在紗布上晾干表面水分并冷卻至室溫后，與一定質量比例的面粉和曲精混合均勻（面粉和曲精先混合均勻），在28℃的恒溫培養箱中培養2～3 d，待蠶豆表面長滿黃綠色孢子后即得到所需的蠶豆曲。

1.3.2 樣品粗酶液的制備

稱取兩份10 g的蠶豆曲，一份在研缽內加入少量蒸餾水充分研細并定容至100 mL，在40℃水浴內間斷攪拌1 h，用四層紗布過濾得到粗酶液；另一份測量水分含量。

1.3.3 蛋白酶活力的測定方法

蛋白酶活力的測定參考丁祖志等[5-7]方法，采用福林-酚試劑比色法測定。蛋白酶活力定義：在40℃中性pH條件下，1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需要的酶量為一個蛋白酶活力單位，以U/g來表示，重復3次取平均值。

1.3.4 制曲工藝的單因素影響試驗

蒸蠶豆瓣出鍋后，在無菌條件下與面粉、米曲霉和醬油曲霉孢子粉（質量比1∶1）混合均勻（面粉和孢子粉先混合均勻），恒溫培養一定時間后，每隔12 h取樣，檢測其蛋白酶活力，每個樣品做2個平行。考察面粉添加量（5%、10%、30%、50%、70%）、米曲霉和醬油曲霉孢子粉接種量（0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、制曲溫度（25℃、28℃、30℃、32℃、35℃）、制曲時間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）對蠶豆曲蛋白酶活力的影響。

1.3.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對制曲溫度（A）、制曲時間（B）、米曲霉和醬油曲霉孢子粉（1∶1）接種量（C）、面粉添加量（D）進行4因素3水平的正交試驗。以蠶豆曲蛋白酶活力為評價指標，選用L9（34）正交設計試驗來確定蠶豆曲制備的最優培養條件。正交試驗設計因素與水平見表1。

表1 制曲工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for koji-making process optimization

2 結果與分析

2.1 制曲時間對蠶豆曲蛋白酶活力的影響

制曲時間對蠶豆曲蛋白酶活力的影響，結果如圖1所示。

圖1 制曲時間對蠶豆曲蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of koji-making time on protease activity of broad bean koji

由圖1可知，隨著制曲時間的延長，蠶豆曲蛋白酶活力逐漸增加，當制曲時間為48 h時，蠶豆曲的蛋白酶活力達到最大值，為687 U/g；繼續增加制曲時間，48 h后酶活力有所下降，但基本保持穩定。制曲過程曲料無結塊，表面有大量綠褐色孢子產生，顏色均勻，霉香味濃郁，基本無氨味，初步確定蠶豆曲的制曲時間為48 h。

2.2 制曲溫度對蠶豆曲蛋白酶活力的影響

制曲溫度對蠶豆曲蛋白酶活力的影響，結果如圖2所示。

圖2 制曲溫度對蠶豆曲蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of koji-making temperature on protease activity of broad bean koji

由圖2可知，當制曲溫度為28℃時，蠶豆曲蛋白酶活力達到最大值，為701 U/g；曲料蓬松、顏色均勻、基本無氨味及其他不良氣味。28℃以后蛋白酶活力隨著制曲溫度的升高而顯著降低。制曲溫度超過32℃后，蛋白酶活力明顯下降，可能是當溫度過高時，出現嚴重的燒曲現象，不利于霉菌的生長和繁殖，最后使蠶豆曲中蛋白酶活力降低。初步確定適宜的制曲溫度為28℃。

2.3 面粉添加量對蠶豆曲蛋白酶活力的影響

面粉添加量對蠶豆曲蛋白酶活力的影響，結果如圖3所示。

圖3 面粉添加量對蠶豆曲蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of koji-making flour bean addition on protease activity of broad bean koji

由圖3可知，隨著面粉添加量的增大，蠶豆曲蛋白酶活力呈先增加后下降的趨勢；當添加的面粉添加量為10%時，制成的蠶豆曲的蛋白酶活力最高686 U/g，繼續增大面粉添加量，酶活力有所下降，原因可能是面粉添加過多時影響到霉菌的生長代謝，從而導致蠶豆曲中蛋白酶活力下降，初步確定最適面粉添加量為10%。

2.4 接種量對蠶豆曲蛋白酶活力的影響

接種量對蠶豆曲蛋白酶活力的影響，結果如圖4所示。

圖4 接種量對蠶豆曲蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of koji-making inoculum on protease activity of broad bean koji

由圖4可見，隨著接種量的增加，蠶豆曲蛋白酶活力逐漸增加，當接種量為2%時，蠶豆曲的蛋白酶活力達到最大值709 U/g，此時的蠶豆曲制成的蠶豆曲孢子濃密，顏色深，初步確定最適接種量為2%。

2.5 正交試驗結果與分析

在單因素試驗基礎上，選擇制曲溫度（A）、制曲時間（B）、米曲霉和醬油曲霉（1∶1）孢子粉接種量（C）、面粉添加量（D）為評價因素，以蠶豆曲蛋白酶活力為評價指標，進行正交試驗，結果見表2，方差分析見表3。

表2 制曲工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for koji-making process optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，試驗中的4種因素對蠶豆曲蛋白酶活力影響的大小順序依次為A＞B＞C＞D，即制曲溫度對蠶豆曲的蛋白酶活力影響最大，其余影響因素依次是制曲時間、接種量和面粉添加量。通過直觀的極差分析方法可知，制曲的最佳工藝組合為A2B3C3D1，即制曲溫度28℃，制曲時間56 h，接種量2%，面粉添加量10%。在此條件下進行驗證試驗，測定蠶豆曲蛋白酶活為762 U/g，高于正交試驗結果。

由表2可知，A、B、C、D4個因素對蠶豆曲蛋白酶活力的影響均為極顯著（P＜0.01）。且根據F值大小可知，4因素影響主次順序為制曲溫度＞制曲時間＞接種量＞面粉添加量，與極差分析結果一致。

3 結論

本研究蠶豆瓣為原材料，考察制曲溫度、制曲時間、米曲霉（Aspergillus oryzae）和醬油曲霉（Aspergillus sojae）孢子粉接種量、面粉添加量對蠶豆曲蛋白酶活力的影響。通過單因素和正交試驗對影響蠶豆曲蛋白酶活的因素進行了篩選和優化，最終得出了豆醬制曲工藝的最佳條件為制曲溫度28℃，制曲時間56 h，接種量2%，面粉添加量10%。在此條件下，獲得的蠶豆曲蛋白酶活力為762 U/g。

[1]楊進，喬鑫，李冬生，等.黃豆醬的制曲工藝[J].食品研究與開發，2010，31（1）：90-93.

[2]丁琦，孫漢巨，趙紅，等.鴨蛋醬的雙菌種制曲工藝[J].食品科學，2011，32（23）：197-200.

[3]李志江，戴凌燕，王欣，等.米曲霉和黑曲霉雙菌種制曲對豆醬酶系影響的研究[J].農產品加工·創新版，2010（10）：51-54.

[4]貢漢坤.傳統豆醬自然發酵的動態分析及人工接種多菌種發酵研究[D].無錫：江南大學，2004.

[5]丁祖志，劉金霞，蔣立勝，等.原料預處理工藝對豆瓣醬品質的影響[J].食品與生物技術學報，2011，30（5）：687-693.

[6]杜連啟，梁建蘭.雜豆食品加工技術[M].北京：化學工業出版社，2010：20-27

[7]ZHU Y P,FAN J F,CHENG Y Q,et al.Improvement of the antioxidant activity of Chinese traditional fermented okara(Meitauza)usingBacillus subtilisB2[J].Food Control,2008(19):654-661.

[8]周彥良.霉豆渣發酵的研究[D].廣州：華南理工大學，2009.

[9]藺立杰，趙媛，王建中，等.核桃醬油制曲條件的優化[J].食品與發酵工業，2012，38（5）：96-100.

[10]馬永強，宮安旭，陳曉昕，等.醬油制曲過程中蛋白酶和谷氨酰胺酶活力影響因素[J].食品科學，2010，31（17）：294-297.

[11]孟甜，黃韜睿，李玉鋒.響應面法優化郫縣豆瓣制曲工藝[J].食品科學，2014，35（15）：193-197.

[12]張長貴，董加寶，何紹洋，等.影響豆渣醬油曲品質的因素及其優化[J].中國調味品，2015，40（8）：10-14.

[13]李云霞.小麥醬發酵菌相分析與人工發酵技術研究[D].武漢：武漢工業學院，2012.

[14]金華勇.甜面醬發酵工藝試驗研究[D].武漢：湖北工業大學，2009.

[15]黃俊偉，彭睆睆，崔春，等.全小麥固體制曲條件優化研究[J].食品工業科技，2015，36（24）：155-158.

[16]王金晶，周敏，劉春鳳，等.蠶豆醬釀造過程中揮發性風味物質分析[J].東北農業大學學報，2013，44（8）：14-22.

Optimization of the koji-making technology of broad bean paste

LIU Yunzhen,XU Xilin,LIU Yongqi,LIU Dongmei*
(School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Using the broad bean as the main raw material,protease activity as the evaluation index,the effect ofAspergillus oryzaeandAspergillus sojaeon the koji-making of broad bean was researched.By single factor experiments,the effect of flour addition,koji-making temperature,time,and inoculum on the protease activity were researched.On the basis of single factor experiments,the koji-making process conditions were optimized by orthogonal experiment.The results showed that the optimum parameter of koji-making process were temperature 28℃,time 56 h,inoculum 2%and flour addition 10%.Under the conditions,the protease activity was 762 U/g.

broad bean;koji making;Aspergillus oryzae;Aspergillus sojae;protease activity

TS264.2

0254-5071（2016）11-0108-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.022

2016-07-06

廣東省農業攻關科技計劃項目（（2012B020311002）

劉云珍（1991-），女，碩士研究生，研究方向為食品工程。

*通訊作者：劉冬梅（1972-），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物利用與控制研究。