尾菜青貯乳酸菌的分離鑒定及其培養條件研究

邵建寧，彭章普，張文齊，麻和平，劉彩云，王潔，趙昊星

（甘肅省科學院生物研究所，甘肅蘭州730000）

尾菜青貯乳酸菌的分離鑒定及其培養條件研究

邵建寧，彭章普，張文齊，麻和平，劉彩云，王潔，趙昊星

（甘肅省科學院生物研究所，甘肅蘭州730000）

從泡菜中分離鑒定適合尾菜（廢棄白菜葉、青筍葉）青貯的乳酸菌，獲得產酸能力強、青貯效果好的2株菌株SD2和SD4，并對其培養條件進行研究。結果表明，菌株SD2、SD4最適培養溫度分別為35℃、37℃；最適培養時間分別為20 h、16 h；最適初始pH值均為6.5；最適接種量均為6%。菌株SD2和SD4分別在30℃條件下進行尾菜發酵7 d后，pH值均＜4.0，乳酸菌活菌數＞1×108CFU/g。對菌株SD2和SD4進行形態學、生化檢測及16S rRNA序列分析，鑒定菌株SD2為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株SD4為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。

尾菜；青貯；乳酸菌；分離鑒定；培養條件

隨著我國蔬菜種植面積不斷擴大和蔬菜種植布局不斷集中，在蔬菜產區蔬菜采收與初加工過程中常伴有大量的尾菜產生，造成了環境污染[1-2]。為解決尾菜污染環境，實現尾菜資源化利用，對無腐爛變質的尾菜進行青貯飼料制備，可以降低尾菜的營養物質損失，較長期保存尾菜的青鮮狀態，提高尾菜青貯飼料的適口性、消化率和營養價值[3-6]。青貯飼料是在厭氧條件下利用乳酸菌發酵產生乳酸，使青貯料pH值迅速下降，抑制其他耗氧微生物對青綠飼料營養成分的分解作用，并改善青貯飼料發酵品質，從而達到長期保存飼料營養物質的目的[7-9]。青貯過程中乳酸菌必須具備較強的產酸能力且達到一定數量，才能更好地發揮其生物功效。因此，篩選出產酸能力強、青貯發酵效果好的乳酸菌菌株，是制備優良青貯劑的核心，也是青貯成功的關鍵。目前，專門針對用于尾菜青貯的乳酸菌研究很少，自然青貯又不能保證尾菜青貯的品質，因此，分離鑒定可應用于尾菜青貯的優良乳酸菌非常重要。本實驗從市售泡菜中分離乳酸菌，進行產酸性能、青貯發酵效果研究，篩選適合尾菜青貯的乳酸菌，對篩選到2株菌株的最適培養條件進行了研究，并通過形態學、生化檢測及16S rRNA序列分析，對2株菌進行了鑒定。以期為尾菜青貯劑的研究開發與利用提供了參考和菌種保證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

實驗菌株是本研究室從蘭州市售泡菜中分離篩選出的菌株，由本研究室保藏。

1.1.2 培養基

MRS培養基[10]：酪蛋白胨10 g/L，牛肉粉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，吐溫80 1 mL/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.02 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，瓊脂粉15 g/L，蒸餾水1 L，pH 6.8。

MC培養基[11]：大豆蛋白胨5 g/L，牛肉粉5 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，乳糖20 g/L，CaCO310 g/L，瓊脂粉15 g/L，中性紅0.05 g/L，蒸餾水1 L，pH 6.0。

1.1.3 青貯原料

挑選無腐爛變質的廢棄白菜葉、青筍葉進行清洗，切割成長2 cm、寬3 cm，晾曬，使廢棄白菜葉、青筍葉水分含量降至70%左右備用。

1.1.4 化學試劑

蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉粉、大豆蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、乳糖：天津市百世化工有限公司；吐溫-80：上海大眾制藥廠；K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3：北京化工廠。所用化學試劑為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；DELTA320pH計：梅特勒-托利多（METTLERTOLEDO）集團；UV-120-02型分光光度計：日本島津公司；JA2003N電子天平：上海精密儀器有限公司；DG-1多功能培養箱：上海醫療器械修造廠；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；BH-2顯微鏡：日本奧林巴斯（OLYMPUS）公司。1.3方法

1.3.1 分離篩選

（1）乳酸菌分離與純化

從采購的市售泡菜中取5 mL泡菜汁和45 mL無菌生理鹽水，混勻，以10倍梯度稀釋，選取10-3、10-4、10-5三個稀釋度，各稀釋度取0.2 mL，分別均勻涂布于MC培養基平板上，30℃平板倒置培養48 h，選擇菌落顯紅色，周圍有明顯溶鈣環的單菌落進行保存。對分離的菌株在含有CaCO3的MRS培養基平板上劃線分離純化2～3次，挑取溶鈣圈明顯的單菌落，經鏡檢確認為純種后，用MRS液體培養基培養，采用甘油法進行保藏[12]。

（2）乳酸菌初篩及復篩

初篩：將上述分離純化的菌株活化后，按5%（V/V）接種量（菌種活菌數約為1×108CFU/mL）接入MRS液體培養基，置于30℃恒溫培養箱培養24 h，每隔2 h無菌取樣測定各菌株發酵液的pH值，根據發酵時間和pH值繪制產酸速率曲線。選擇能在MRS液體培養基，16～20 h內發酵液pH值下降到4.0以下的菌株作為初篩菌株。

復篩Ⅰ：將初篩得到的菌株在30℃靜置培養24 h，進行產酸量測定，采用酸堿滴定法中和法，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定，計算產酸量，產酸量以吉爾涅爾度（°T）表示。

復篩Ⅱ：將復篩Ⅰ選出菌株培養液按質量比0.5%的接種量（菌種活菌數約為1×109CFU/mL），接種在預處理后的廢棄白菜葉、青筍葉中。分別均勻噴灑到500 g青筍葉及500 g白菜葉中，裝袋后壓實、袋口密封，在30℃條件下發酵，測定尾菜青貯飼料pH值及活菌數，綜合尾菜青貯飼料感官指標評價復篩菌株發酵性能[13]。

1.3.2 活菌數測定

（1）發酵菌液活菌數測定

取1 mL待測定發酵菌液，用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋，選取10-6、10-7稀釋梯度，吸取0.2 mL菌懸液置于MRS瓊脂平板上，每個稀釋梯度做3個平行，以滅菌的涂布器將菌懸液均勻涂開，然后將平板倒置于培養箱中，37℃條件下培養48 h，進行菌落計數[14]。

（2）尾菜飼料乳酸菌總數測定

取5 g尾菜青貯飼料和45 mL無菌生理鹽水混勻，以10倍梯度稀釋，選取10-5、10-6稀釋梯度，吸取0.2 mL菌懸液用涂布棒涂布于MC瓊脂平板上，培養48 h后，選擇菌落顯紅色，周圍有明顯溶鈣環的菌落進行計數。

1.3.3 pH值測定

發酵液pH測定：無菌取樣5 mL，用pH計測定發酵液的pH值。

青貯尾菜pH測定：稱取尾菜青貯樣品20g，加入180 mL蒸餾水，使用組織搗碎機搗碎，然后用四層紗布和濾紙分別進行過濾，用pH計測定尾菜青貯樣品過濾液的pH值。

1.3.4 培養條件研究

將培養溫度分別設定為30℃、33℃、35℃、37℃、40℃、42℃，初始pH值分別調至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接種量分別按照1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%（V/V），用MRS液體培養基靜置培養24 h，每隔2 h在波長600 nm條件下測定培養液的OD600nm值，考察培養溫度、初始pH值、接種量及培養時間等因素對菌株生長的影響。每個實驗條件做3個平行樣取平均值。

1.3.5 菌種鑒定

（1）形態特征觀察：將篩選獲得的菌株分別涂布到MRS固體培養基，37℃條件下培養2 d左右，觀察菌落特征，取典型菌落涂片，進行革蘭氏染色，油鏡下觀察細胞形態[15]。

（2）生理生化特性測定：對待鑒定菌株進行過氧化氫酶、吲哚、明膠試驗及葡萄糖、木糖、水楊苷、七葉苷、麥芽糖、甘露醇、蔗糖碳水化合物發酵產酸試驗[16]。

（3）16S rRNA基因序列分析：提取待鑒定菌株16S rRNA，引物為原核生物16S rRNA的通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-CTACGGCTACC TTGTTACGA-3'。16S rRNA PCR產物全序列由上海派森諾生物科技有限公司測定，將測得的16SrRNA序列與NCBI GenBank中的已知序列進行同源性比較后，判定菌株種類，從而確定鑒定菌株的屬種信息[17]。

2 結果與分析

2.1 分離篩選

2.1.1 分離純化

本實驗從采購的市售泡菜中進行乳酸菌分離純化，從MC培養基選擇菌落顯紅色，周圍有明顯溶鈣環的單菌落進行保存，對分離菌株在含有CaCO3的MRS平板培養基上反復劃線純化，挑選出溶鈣環明顯的單菌落，經鏡檢確認為純種，最終分離獲得20株產酸菌株。

2.1.2 初篩

青貯要求在較短時間內青貯基質pH值迅速下降到4.0以下，這樣才能有效抑制真菌及其他雜菌的生長。對分離純化獲得的20株菌株進行產酸速率試驗，選擇能在MRS培養液中16～20 h內發酵液pH值下降到4.0以下的菌株作為初篩菌株，經初篩后選出7株產酸量大、產酸快的菌株見圖1。由圖1可以看出，菌株SD2、SD4、SD5、SD13、SD14、SD16、SD17在20 h時培養液pH值均降到4.0以下，7株菌株的pH值變化趨勢基本一致，在培養初期pH值的變化都不明顯。8 h以后pH值下降較快，隨著培養時間延長，pH值逐漸下降。

圖1 初篩菌株在不同培養時間下pH變化Fig.1 pH changes of primarily screening strains at different culture time

2.1.3 復篩Ⅰ

圖2 初篩菌株產酸能力測定結果Fig.2 Determination results of acid-producing ability of primarily screening strains

將初篩到的7株菌株在MRS液體培養基中30℃條件下靜置培養24 h，進行產酸量測定，結果見圖2。從圖2可以看出，菌株SD2、SD4、SD14、SD16、SD17酸度均≥70°T，其中菌株SD2、SD4產酸量較高，酸度達到了75°T以上，復篩出5株產酸性能較好的菌株；SD5、SD13產酸量較低，酸度均＜70°T。因此，將菌株SD2、SD4、SD14、SD16、SD17進行下一步復篩。

2.1.4 復篩Ⅱ

將復篩Ⅰ選出菌株接種在預處理后的廢棄白菜葉、青筍葉中，測定尾菜青貯飼料發酵7 d后的pH值及乳酸菌活菌數，綜合尾菜青貯飼料感官指標評價復篩Ⅰ菌株發酵性能，結果見表1。由表1可知，從感官指標、pH值、乳酸菌活菌數量比較可見，菌株SD2、SD4發酵廢棄白菜葉、青筍葉，發酵7 d，尾菜青貯飼料pH均＜4.0，乳酸菌數量＞1.0×108CFU/g，顏色、氣味、質地等感官指標良好，適合用于尾菜青貯飼料的發酵。

表1 不同復篩菌株發酵青貯尾菜結果Table 1 Results of vegetable wastes silage fermented by different secondary screening strains

2.2 培養條件研究

2.2.1 不同培養溫度對菌株生長的影響

將菌株SD2、SD4分別接種在裝MRS液體培養基中，置于不同溫度下靜置培養24 h，測定培養液OD600nm值，考察不同培養溫度對篩選菌株SD2、SD4生長的影響，結果見圖3。由圖3可知，菌株SD2在35℃條件下，培養液OD600nm值最高，因此，35℃是菌株SD2最適生長溫度。菌株SD4在37℃條件下，培養液OD600nm最高，因此，37℃是菌株SD4最適生長溫度。

圖3 不同培養溫度對菌株生長的影響Fig.3 Effects of different culture temperature on strains growth

2.2.2 不同初始pH對菌株生長的影響

將菌株SD2、SD4分別接種在不同初始pH的MRS液體培養基中，置于37℃條件下靜置培養24 h，測定培養液OD600nm值，考察不同初始pH對篩選菌株SD2、SD4生長的影響，結果見圖4。由圖4可知，培養基初始pH過高或過低均不利于菌株的生長。SD2在初始pH 6.5培養基中，培養液OD600nm值最高，因此，選擇pH 6.5為菌株SD2最適生長初始pH值。SD4在初始pH 6.5培養基中，培養液OD600nm值最高，因此，選擇pH 6.5為菌株SD4最適生長初始pH值。

圖4 不同初始pH值對菌株生長的影響Fig.4 Effects of different initial pH on strains growth

2.2.3 不同接種量對菌株生長的影響

圖5 不同接種量對菌株生長的影響Fig.5 Effects of different inoculum on strains growth

將菌株SD2、SD4分別按不同接種量接種在MRS液體培養基中，置于37℃條件下靜置培養24 h，測定培養液OD600nm值，考察不同接種量對篩選菌株SD2、SD4生長的影響，結果見圖5。由圖5可知，菌株SD2、SD4在接種量6%的條件下，培養液OD600nm值最高，因此選擇菌株SD2、SD4最佳接種量均為6%。

2.2.4 不同的培養時間對菌株生長的影響

將株SD2、SD4分別在上述最適培養條件下的培養24h，考察不同培養時間對篩選菌株SD2、SD4生長的影響，結果見圖6。由圖6可知，菌株SD2培養約10 h進入對數生長期，培養20 h后進入穩定期；菌株SD4培養約8 h進入對數生長期，培養16 h后進入穩定期。因此，SD2、SD4的最佳培養時間分別為20 h及16 h。

圖6 菌株SD2及菌株SD4生長曲線Fig.6 Growth curves of strain SD2 and strain SD4

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態觀察

對篩選獲得菌株SD2、SD4進行菌落形態和細胞形態觀察，結果分別見圖7及圖8。由圖7及圖8可知，菌株SD2在MRS瓊脂平板上，菌落灰白色，圓形，凸起，表面平滑，濕潤，邊緣整齊，直徑2～3 mm。顯微鏡油鏡下觀察，菌體呈長桿狀，單個，成對或成短鏈，革蘭氏染色陽性。菌株SD4在MRS瓊脂平板上，菌落微白色，圓形，扁平，濕潤，邊緣不規則，直徑為1～2 mm。顯微鏡油鏡下觀察，細胞短桿狀，單個、成對或鏈狀排列，革蘭氏染色陽性。

圖7 菌株SD2(A)及菌株SD4(B)的菌落形態Fig.7 Colonial morphology of strain SD2(A)and strain SD4(B)

圖8 菌株SD2(A)及菌株SD4(B)的細胞形態Fig.8 Cells morphology of strain SD2(A)and strain SD4(B)

2.3.2 生理生化檢測

對篩選獲得菌株SD2、SD4進生理生化檢測，結果見表2。由表2可知，菌株SD2明膠液化、吲哚形成、過氧化氫酶試驗均為陰性，葡萄糖、木糖、水楊苷、七葉苷、麥芽糖、甘露醇、蔗糖碳水化合物發酵產酸試驗均為陽性。菌株SD4明膠液化、吲哚試驗、過氧化氫酶試驗，木糖、水楊苷、七葉苷、麥芽糖、甘露醇發酵產酸試驗均為陰性，葡萄糖、蔗糖發酵產酸試驗為陽性。從菌株菌落、菌體形態和革蘭氏染色反應基礎上結合生理生化檢測結果，菌株SD2初步鑒定為植物乳桿菌，菌株SD4初步鑒定為發酵乳桿菌。

表2 菌株SD2及菌株SD4生理生化檢測結果Table 2 Physiological and biochemical detection results of strain SD2 and strain SD4

2.3.3 16S rRNA測序

將菌株SD2、SD4的16S rRNA基因測序結果在NCBI Genbank進行BLAST比對，從基因序列同源性對比結果可知，菌株SD2與登錄號FJ386491.1的16S rDNA基因序列相似性為100%，菌株SD4與登錄號EU419593.1的16S rDNA基因序列相似性為99%，結合2株菌的菌落形態、菌體形態特征，生理生化試驗結果，將菌株SD2鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株SD4鑒定為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentums）。

3 結論

從泡菜中分離篩選適合尾菜青貯的乳酸菌，通過產酸性試驗和尾菜青貯發酵試驗篩選出出SD2、SD4兩株產酸能力強，青貯廢棄白菜葉、青筍葉效果良好的菌株。在30℃進行尾菜青貯發酵，尾菜青貯飼料7 d后pH均低于4.0，尾菜青貯飼料乳酸菌活菌數大于1×108CFU/mL。

菌株SD2、SD4最適培養溫度分別為35℃、37℃，最適培養基初始pH均為6.5，最適接種量均為6%，最適培養時間分別為20 h、16 h。兩株菌在最適條件下培養20 h后pH值均能下降到pH 3.5以下，具有良好的尾菜青貯發酵潛能。

對篩選獲得的菌株SD2、SD4經細菌形態學觀察，生理生化特性檢測及16S rRNA基因序列分析，菌株SD2鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株SD4鑒定為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentums）。

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Isolation,identification and culture condition of lactic acid bacteria for vegetable wastes silage

SHAO Jianning,PENG Zhangpu,ZHANG Wenqi,MA Heping,LIU Caiyun,WANG Jie,ZHAO Haoxing
(Institute of Biology,Gansu Provincial Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

Lactic acid bacteria strain SD2 and SD4 which had a strong acid-producing ability and good silage effect on vegetable wastes(the waste Chinese cabbage leaves and endive sprout leaves)were isolated from pickles and identified,and their culture conditions were researched.The results showed that the optimum culture temperatures of strain SD2 and SD4 were 35℃and 37℃,respectively.The optimum culture times were 20 h and 16 h,respectively.The both optimum initial pH were 6.5.The both optimum inoculums were 6%.The strain SD2 and SD4 were proceeded vegetable wastes fermentation at 30℃,respectively.After 7 d,the both vegetable wastes silage pH were lower than 4.0,and the viable cell counts of lactic acid bacteria were more than 1×108CFU/g.The morphology,biochemical detection and 16S rRNA sequence of strain SD2 and SD4 were analyzed.The strain SD2 and SD4 were identified asLactobacillus plantarumandLactobacillus fermentum,respectively.

vegetable waste;silage;lactic acid bacteria;isolation and identification;culture condition

Q939.97

0254-5071（2016）11-0123-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.025

2016-09-02

蘭州市科技計劃項目（2012-2-143）

邵建寧（1971-），男，高級工程師，本科，主要從事生物工程應用基礎研究工作。