白色金針菇搖瓶發酵培養基的優化研究

張怡，王玉*，班立桐，黃亮，鄭志廣，肖月梅

（天津農學院農學與資源環境學院，天津300384）

白色金針菇搖瓶發酵培養基的優化研究

張怡，王玉*，班立桐，黃亮，鄭志廣，肖月梅

（天津農學院農學與資源環境學院，天津300384）

以菌絲球干質量、密度、直徑為考察指標，利用單因素試驗和L9(34)正交試驗對白色金針菇搖瓶發酵培養基進行優化。結果表明，最適搖瓶培養基配方為：葡萄糖10 g/L、紅糖13 g/L、黃豆粉3 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、VB10.01 g/L。在此條件下，白色金針菇菌絲球干質量達到15.48 g/L，菌絲球密度66.48個/mL，菌絲球直徑為1.45 mm。

白色金針菇；搖瓶發酵；培養基優化

白色金針菇（Flammulina velutipes）是一種低溫型、經濟價值很高的優質食用菌，其菇體乳白鮮嫩，菌柄絨毛少，口感較好，富含蛋白質、氨基酸、維生素、礦物元素等多種營養物質[1-2]。我國白色金針菇的生產大多利用空調、通風設備等在廠房中進行工廠化全年生產，傳統的食用菌菌種擴繁為母種、原種、栽培種三級固體菌種擴繁方式，存在生長周期長、菌齡不一致、成本高、管理過程繁雜等缺點[3]，而液體菌種具有生長周期短、出菇整齊、工藝簡便、易規模生產、成本低廉、效率高等優勢[4-5]。

本試驗通過單因素試驗及正交試驗確定白色金針菇搖瓶發酵培養基的最佳配方，為白色金針菇液體發酵工廠化生產過程的控制提供相關的技術參數。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

白色金針菇（Flammulina velutipes）T-011：天津濱海德盛農業科技有限公司。

1.1.2 培養基

斜面培養基[6]：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。

種子、液體發酵培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，VB10.01 g/L。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖：秦皇島鵬遠淀粉有限公司；瓊脂、蛋白胨、牛肉浸粉、酵母膏：北京奧博星生物技術有限公司；磷酸二氫鉀：天津市光復科技發展有限公司；硫酸鎂：天津市化學試劑三廠；氫氧化鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司；乙醇（體積分數為95%）：天津市風船化學試劑科技有限公司；乳糖：天津市奧淇醫科醫藥銷售有限公司；麥芽糖：新興化工試劑研究所；紅糖：北塘區博零食尚食品商行；尿素：天津市北方天醫化學試劑廠；麥麩：市售；黃豆粉：北大荒集團；玉米漿：上海方畦儀器有限公司。所有化學試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

BSP-250恒溫培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所；GIX-GF101-1-S-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥箱：上海賀德實驗設備有限公司；ZHWY-2102恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1 菌種活化[7-8]

將白色金針菇菌種塊（1.5～2.0 cm2）接種到斜面培養基上，25℃條件下培養至滿管，挑取菌絲粗壯、濃密、無污染的菌種4℃條件下冷藏備用。

1.3.2 白色金針菇液體菌種生長曲線的測定

將0.5 cm24塊活化的白色金針菇菌塊置于裝液量為100mL/250mL液體發酵基中，25℃靜置24h，25℃、120r/min繼續培養至200 h，定時取樣，分別測量液體菌種的菌絲球干質量、密度、直徑等指標，確定白色金針菇生長狀態。

1.3.3 種子液的制備

將0.5cm24～5塊活化的白色金針菇菌塊接種于裝液量為100mL/250mL種子培養基中，25℃靜置培養24h，25℃、120 r/min繼續培養72 h。

1.3.4 白色金針菇搖瓶液體菌種的制備

裝液量為100 mL/250 mL，接種量10%，25℃靜置24 h，25℃、120 r/min繼續培養120 h。

1.3.5 白色金針菇液體發酵最適碳源的篩選

分別考察添加量為20 g/L的葡萄糖、紅糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖，搖床（25℃、120 r/min）培養7 d后，檢測菌絲球干質量、密度和直徑，確定最適碳源。

1.3.6 白色金針菇液體發酵最適氮源的篩選

分別考察添加量為5 g/L蛋白胨、牛肉浸粉、尿素、麥麩、酵母膏、黃豆粉、玉米漿，搖床（25℃、120 r/min）培養7 d后，檢測菌絲球干質量、密度和直徑，確定最適氮源。

1.3.7 白色金針菇液體發酵培養基優化正交試驗[9]

在單因素試驗基礎上，利用L9（34）正交設計，以菌絲球干質量為評價指標，對葡萄糖（A）、紅糖（B）、黃豆粉（C）含量進一步優化，正交試驗因素與水平見表1。

表1 培養基配方優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium formula optimization

1.3.8 指標檢測方法[10]

（1）菌絲球干質量測定方法

取一定體積發酵培養液，80目篩網過濾得到菌絲球，蒸餾水洗滌2次，于80℃烘干至恒質量。

（2）菌絲球密度檢測方法

1 mL發酵培養液中菌絲球的數目即為菌絲球密度。

（3）菌絲球直徑檢測方法

取1 mL培養液置于皿中，隨機取至少10個菌絲球，將其緊密相連排成一線，用直尺測量其總長度，并計算菌絲球平均直徑。

2 結果與分析

2.1 白色金針菇液體菌種生長曲線的測定

將種子液接種于發酵培養基靜置24 h后，每24 h取樣，檢測菌絲球干質量、密度和直徑，結果見圖1。

圖1 白色金針菇生長曲線Fig.1 Growth curve ofF.velutipes

由圖1可知，隨著培養時間的增加，白色金針菇液體菌種菌絲球干質量也逐漸增大；72 h后菌體進入快速生長階段，192h時菌絲球干質量達到最大值；192 h后，菌絲球逐漸變為棉絮狀，培養液黏度很大，導致溶氧不足，且由于養分減少，菌絲逐漸自溶，干質量下降。菌絲球直徑隨著培養時間延長先增大后減小，菌絲球密度變化趨勢與直徑相反，菌球直徑變小而密度增加。液體菌種接種于栽培瓶后，菌絲球密度越大則生長點越多，且前期預實驗結果表明，直徑偏小的菌絲球在栽培料中萌發較快。本試驗與馬瑞霞等[11-12]的結果一致。結果表明，為保證菌絲球生長良好，確定液體發酵搖瓶培養時培養120 h為宜。

2.2 白色金針菇液體發酵最適碳源的篩選

考察不同碳源（添加量均為20 g/L）對白色金針菇液體發酵生長的影響，結果見圖2。

圖2 不同碳源對白色金針菇生長的影響Fig.2 Effects of different carbon sources onF.velutipes growth

由圖2可知，當碳源為紅糖時，菌絲球干質量最大，菌絲球的密度和直徑僅次于碳源為葡萄糖的情況；當碳源為葡萄糖時，菌絲球的密度最大，直徑最小，而干質量僅次于紅糖。本實驗與PANAGIOTA D等[13]的研究結果一致。由于紅糖價格較高，因此選擇紅糖和葡萄糖各10 g/L作為培養基碳源。

2.3 白色金針菇液體菌種最適氮源的篩選

考察不同氮源（添加量均為5 g/L）對白色金針菇液體發酵生長的影響，結果見圖3。

圖3 不同氮源對白色金針菇生長的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources onF.velutipesgrowth

由圖3可知，以尿素為氮源時，培養基中僅有少量菌絲，無菌絲球產生，其余氮源均有菌絲球產生，可見無機氮源不利于白色金針菇的生長。菌絲球干質量較高的氮源種類依次為黃豆粉、蛋白胨和麥麩，其中黃豆粉為氮源的菌絲球中混有少量未降解的黃豆粉原料。黃豆粉的菌絲球密度也最大，且明顯高于麥麩和蛋白胨，并且菌絲球直徑也最小。朱家騮等[14]的實驗表明最適氮源為麩皮或麩皮水。本研究認為由于麥麩（麩皮）在使用前需先煮沸取上清液，工序復雜不利于工業化生產。因此，選擇黃豆粉為最適氮源。

2.4 白色金針菇液體菌種最適培養基的正交試驗

由于無機鹽與維生素對金針菇菌絲生長影響較小[15]，所以本研究以菌絲干質量為評價指標，利用L9（33）正交設計對白色金針菇液體菌種培養基的主要成分進行了優化，正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，通過極差比較，各因素對白色金針菇液體發酵菌絲產量的影響由小到大順序為：紅糖＞黃豆粉＞葡萄糖。培養基配方最優組合為A2B3C2，即最適搖瓶培養基的配方為：葡萄糖10 g/L、紅糖13 g/L、黃豆粉5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、VB10.01 g/L。在此最佳培養基配方條件下進行驗證試驗，白色金針菇液體發酵菌絲干質量可達到15.48g/L，菌絲球密度66.48個/mL，菌絲球直徑1.45mm。由表3可知，葡萄糖、紅糖和黃豆粉對白色金針菇液體發酵菌絲產量均有顯著影響（P＜0.05），其中紅糖含量有極顯著影響（P＜0.01）。

表2 培養基配方優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由于表2中沒有最優組合為A2B3C2，因此進行驗證實驗，結果表明，在最適培養基配方中，白色金針菇液體發酵菌絲干質量可達到15.48g/L，菌絲球密度66.48個/mL，菌絲球直徑1.45mm。優化后的白色金針菇液體菌種菌絲球干質量大、密度大、直徑小、且大小均一，較之初始配方干質量和密度分別提高了90.88%、89.50%，各項指標明顯提高。

3 結論

通過對白色金針菇液體菌種生長曲線的測定，確定發酵養時間為靜置24 h后，培養72 h。利用單因素試驗確定最適碳源、氮源分別為葡萄糖、紅糖，黃豆粉。通過正交試驗確定二級搖瓶培養基配方為葡萄糖10 g/L、紅糖13 g/L、黃豆粉5 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.5 g/L、VB10.01 g/L。優化后的白色金針菇液體菌種菌絲球干質量大、密度大、直徑小、且大小均一，較未優化培養基干質量和密度分別提高了90.88%、89.50%。

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Optimization of shaking flask fermentation medium ofFlammulina velutipes

ZHANG Yi,WANG Yu*,BAN Litong,HUANG Liang,ZHEN Zhiguang,XIAO Yuemei
(College of Agronomy&Resources and Environment,Tianjin Agricultural University,Tianjin,300384,China)

Using the dry mass,density and diameter of mycelia as the evaluation indexes,the shaking flask medium ofFlammulina velutipeswas optimized by single factor experiments and L9(34)orthogonal experiments.The results showed that the optimum shaking flask medium formula were glucose 10 g/L,brown sugar 13 g/L,soybean meal 3 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO40.5 g/L,VB10.01 g/L.Under the conditions,the dry mass,density and diameter of mycelia were 15.48 g/L,66.48 unit/mL and 1.45 mm,respectively.

Flammulina velutipes;shake flask fermentation;medium optimization

S646.1

0254-5071（2016）11-0136-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.028

2016-06-26

天津市農業科技成果轉化與推廣項目（201303010）；東麗區科技型中小企業發展專項資金產學研合作項目（2014001）

張怡（1985-），女，實驗師，碩士，主要從事食用菌方面的研究工作。

*通訊作者：王玉（1980-），女，副教授，碩士，主要從事食用菌方面的研究工作。