響應面分析法優化堿蓬黃酮提取工藝

龐庭才，鐘秋平，胡上英，徐淑慶，李創蓮

（欽州學院食品工程學院，廣西欽州535099）

響應面分析法優化堿蓬黃酮提取工藝

龐庭才，鐘秋平，胡上英，徐淑慶，李創蓮

（欽州學院食品工程學院，廣西欽州535099）

利用響應面分析法優化堿蓬黃酮的提取工藝。以黃酮得率為評價指標，采用單因素試驗和響應面分析法對乙醇體積分數、料液比、提取時間和提取溫度進行考察，優選出最佳堿蓬黃酮提取工藝為：乙醇體積分數89.0%，料液比1∶35（g∶mL），提取時間3.1 h，提取溫度67.0℃，堿蓬黃酮得率理論值為3.52%。在此最佳工藝條件下進行驗證試驗，堿蓬黃酮得率實際值為3.50%，說明該優化方法合理可行。

響應面法；堿蓬；黃酮；提取

堿蓬（Suaeda salsaL.）屬藜科，為一年生草本植物，一般生于海濱、湖邊、荒漠等處的鹽堿荒地上，是一種典型的鹽堿地指示植物[1]。在我國分布廣泛，堿蓬莖葉和種籽營養成分完整齊全，除富含脂肪、蛋白質外，礦物質元素和維生素的含量也很豐富[2-4]。隨著對野生植物資源開發研究的不斷深入，人們發現堿蓬是一種優質蔬菜、經濟作物和具有醫療保健價值的植物資源[5]。目前國內外對鹽地堿蓬的研究集中于植物生理、耐鹽性以及土壤改良等方面[6-8]。而對于堿蓬中黃酮類化合物的提取與分析方面的研究還比較少。而對于黃酮類化合物提取的方法主要有：水提取法、乙醇-水溶劑提取法、超聲波法、微波法、大孔樹脂吸附分離法、乙醇-水溶液加微波和樹脂提取分離法等。葉春等[9]采用微波法提取魚腥草葉總黃酮，提取率可達95%以上；滕海鵬等[10]研究了超聲波法提取菊米黃酮類化合物的工藝，最終總黃酮得率可達16.96%；王蕙等[11]采用添加纖維素酶提取銀杏葉總黃酮，提取量為6.367 6 mg/g；又以乙醇-水為提取液采用半仿生法提取，最終總黃酮提取量為6.459 8 mg/g。本研究在單因素試驗的基礎上采用響應面法對堿蓬中黃酮的提取工藝進行優化，探索堿蓬黃酮的最佳提取工藝條件，以期為進一步開發和利用堿蓬資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

堿蓬：采集于廣西欽州港沙質鹽沼濕地；蘆丁標準品（純度為99%）：上海金穗生物科技有限公司；乙酸乙酯、石油醚、丙酮、無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

EL204電子天平：梅特勒-托利多（上海）有限公司；UV-3200紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；H1850臺式離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；RE-3000旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 堿蓬黃酮提取工藝

操作要點：

a.預處理：將堿蓬莖葉清洗干凈，晾干后置于干燥箱中50℃烘干，粉碎過60目篩，置于4℃冰箱中保存備用。

b.脫脂：取10.0 g堿蓬粉末置于50 mL石油醚中浸泡2.5 h后過濾，濾渣烘干備用。

c.浸提：稱取2.0 g脫脂后的堿蓬粉末，加入60 mL體積分數85%乙醇溶液，60℃水浴浸提3h，濾液定容至100mL，即為黃酮待測液。

1.3.2 蘆丁標準曲線的繪制

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法[12]測定黃酮的含量。

精確吸取0.1mg/mL的蘆丁標準溶液0、0.5mL、1.0mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL，分別置于25 mL比色管中，加入體積分數85%乙醇溶液至10.0 mL，再加入5%NaNO20.8 mL，搖勻，靜置5min后，加入10%Al（NO3）30.8 mL，再靜置5min后，加入4%NaOH溶液10 mL，搖勻后定容至比色管刻度，搖勻，靜置15 min。在波長249 nm處測吸光度值[9]，以蘆丁質量濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線并得出線性回歸方程為：Y=46.366X+0.005 3（R2=0.999 3）。根據蘆丁標準曲線回歸方程計算堿蓬中黃酮的含量及黃酮得率，黃酮得率計算公式如下：

式中：C為測量液中黃酮含量，mg/mL；V1為測量液的定容體積，mL；V2為測量時量取的體積，mL；V3為提取液的定容體積，mL；m為堿蓬樣品的質量，mg。

1.3.3 單因素試驗

分別選取不同的乙醇體積分數（75%、80%、85%、90%、95%和100%）、料液比（1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45和1∶50（g∶mL））、提取溫度（45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃）和時間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h和3.5 h）進行單因素試驗，考察各因素對堿蓬黃酮得率的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，利用DesignExpert8.0.5軟件，根據Box-Benhnken中心組合設計原理[13]，選取料液比（X1）、提取溫度（X2）、提取時間（X3）、乙醇體積分數（X4）為4個試驗因素，以黃酮得率（Y）為響應值，采用4因素3水平的響應面分析試驗對堿蓬黃酮提取工藝進行優化，響應面因素與水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對黃酮得率的影響

考察不同乙醇體積分數對黃酮得率的影響，結果見圖1。

圖1 乙醇體積分數對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol content on the yield of flavonoids

由圖1可知，當乙醇體積分數為75%～85%時，隨著乙醇體積分數的增大，黃酮得率也隨之增大；當乙醇體積分數達到85%時，黃酮得率達到最大值，為3.12%；但當乙醇體積分數＞85%時黃酮得率又有所下降。這可能是因為當乙醇體積分數較高時，一些醇溶性雜質的溶出量增加，與黃酮類化合物競爭乙醇，從而導致總黃酮得率下降[14]。因此，選擇乙醇體積分數85%為宜。

2.1.2 料液比對黃酮得率的影響

考察不同料液比對黃酮得率的影響，結果見圖2。

圖2 料液比對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of flavonoids

由圖2可知，當料液比＜1∶30（g∶mL）時，隨著料液比的增大，黃酮得率也呈上升趨勢；當料液比為1∶30（g∶mL）時，黃酮得率達到最大，為3.15%；但是隨著料液比的增大，黃酮得率反而呈下降趨勢。主要的原因是料液比影響溶劑的極性，從而影響不同極性黃酮類化合物的溶解性；當液料比增大時，乙醇中提取出的總黃酮含量相對較小，傳質阻力較小，利于樣品中黃酮類化合物的溶出，但是當料液比太大時，在較長的后續處理加熱過程中對熱不穩定的黃酮可能被氧化分解等，從而黃酮得率降低[15]。因此，選擇料液比1∶30（g∶mL）為宜。

2.1.3 提取溫度對黃酮得率的影響

考察不同提取溫度對黃酮得率的影響，結果見圖3。

圖3 提取溫度對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

由圖3可知，在45～60℃范圍內，隨著提取溫度的升高，黃酮得率也隨之增加，當提取溫度為60℃時，黃酮得率達到最大值，為3.20%；當提取溫度＞60℃時，黃酮得率卻逐漸降低。這可能是因為溫度升高能使植物組織軟化膨脹，增加可溶性成分的溶解和擴散速度，加熱溫度越高，溶劑的粘度越小，植物有效成分的擴散速度越快[16]。但由于植物有效成分大多是不耐熱的，生物活性極易受到破壞，過高的浸取溫度會使之分解、變質或揮發散失[17]。因此，選擇提取溫度60℃為宜。

2.1.4 提取時間對黃酮得率的影響

考察不同提取時間對黃酮得率的影響，結果見圖4。

圖4 提取時間對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

由圖4可知，在提取時間為1.0～3.0 h時，隨著提取時間的延長，黃酮得率顯著增加；當提取時間為3.0 h時，黃酮得率達到最大值，為3.11%；之后隨提取時間的增加，黃酮得率卻有所下降，這可能是因為提取時間過長，醇溶性物質溶出率增加，部分黃酮可能被氧化使黃酮提取率下降。因此，選擇提取時間3.0 h為宜。

2.2 響應面試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，通過對料液比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分數進行響應面分析，以堿蓬中黃酮得率為響應值（Y），響應面試驗設計結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

綜合單因素試驗結果，采用Design Expert 8.0.5.0軟件對表2中試驗結果進行二次多元回歸擬合，得到黃酮得率Y與4個因素X1、X2、X3、X4之間的二次回歸方程為：Y= 3.47-0.052X1+0.12X2+0.080X3-0.15X4-0.028X1X2+0.17X1X3-0.13X1X4+0.18X2X3-0.18X2X4-0.070X3X4-0.17X12-0.27X22-0.37X32-0.48X42。

由表3回歸模型進行方差分析可知，模型P＜0.000 1，表明回歸模型達到顯著水平。失擬項P=0.188 1，并無顯著性影響，表明數據沒有異常點，不需要分析更高次數的項，模型適當。由于相關系數為R2=97.52%，說明響應值的變化有97.52%來源于所選變量，說明回歸方程擬合度良好，回歸方程極顯著（P＜0.01）。由P值可知，方程的X2、X3、X4、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X12、X22、X32、X42對黃酮得率Y值影響極顯著（P＜0.01），X1、X1X2、X3X4對黃酮得率Y值影響顯著（P＜0.05），表明該方程并非簡單的線性關系，交互作用對響應值影響很大，方程二次項對響應值影響也很大。由F值可知，各因素對堿蓬黃酮得率影響的主次為乙醇體積分數＞提取溫度＞提取時間＞料液比。

根據回歸方程得出不同因素的響應面分析圖及相應等高線圖結果見圖5。響應面斜度相對陡峭，表明響應值受提取條件的改變的影響很大，反之如果響應面斜度相對較平，表明響應值受提取條件的改變的影響很小[18]。由等高線圖可以看出橢圓越密集，說明響應值受提取條件的影響就越大。由圖5可知，響應面開口向下，隨著每個因素的增大，響應值增大，當響應值增大到極值后，隨著因素的增大，響應值逐漸減小。該模型有穩定點，且穩定點是最大值。從其等高線圖可看出，等高線為橢圓形，證明各因素之間交互作用顯著。

圖5 料液比、提取溫度、提取時間和乙醇體積分數交互作用對黃酮得率影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between solid-liquid ratio,temperature, time and ethanol content on flavonoids yield

2.3 最佳提取工藝的預測與驗證試驗

通過二次多項回歸的預測，得出堿蓬中黃酮的最佳提取工藝條件為料液比1∶35.12（g∶mL），提取溫度66.85℃，提取時間3.11 h，乙醇體積分數88.77%，在此條件下，堿蓬黃酮得率的預測值為3.52%。考慮到試驗操作的可行性，將最優提取條件修正為料液比1∶35（g∶mL），提取溫度67.0℃，提取時間3.1 h，乙醇體積分數89.0%，在此條件下所測得黃酮得率為3.50%，預測值與實際值偏差為0.02%，說明該回歸方程能夠比較真實地反應各因素對堿蓬黃酮得率的影響，通過響應面優化的提取條件真實可靠。

3 結論

本研究利用響應面分析法優化堿蓬黃酮的提取工藝。以黃酮得率為評價指標，采用單因素和響應面分析法對乙醇體積分數、液料比、提取時間和提取溫度進行考察，得出各因素對堿篷黃酮得率影響的主次為乙醇體積分數＞提取溫度＞提取時間＞料液比，最佳提取工藝為：乙醇體積分數89.0%，料液比1∶35（g∶mL），提取時間3.1 h，提取溫度67.0℃，在此條件下，堿蓬黃酮得率為3.50%，說明該優化方法合理可行。目前，黃酮類物質在醫療保健、生物工程、食品等方面的應用日益引起人們重視，其抗氧化活性也已成為重要的研究方向。本試驗可為開發黃酮類物質在抗癌、抗衰老、食品保健等方面提供相應的技術支持和參考。

[1]張學杰，樊守金，李法曾.中國堿蓬資源的開發利用研究狀況[J].中國野生植物資源，2003，22（2）：1-3.

[2]周東生，王奇志，王鳴，等.鹽地堿蓬化學成分及其開發利用的研究進展[J].中國野生植物資源，2011，30（1）：6-9.

[3]趙海林，馬艷芝，李靜霞，等.鹽地堿蓬食用價值的研究[J].安徽農業科學，2010，38（26）：14350-14351.

[4]徐紅娟.野生鹽地堿蓬汁中9種微量元素的測定[J].醫學動物防制，2006，22（6）：459-460.

[5]孫宇梅，趙進，周威，等.我國鹽生植物堿蓬開發的現狀與前景[J].北京工商大學學報：自然科學版，2005，23（1）：1-4.

[6]QI C H,CHEN M,SONG J,et al.Increase in aquaporin activity is involved in leaf succulence of the euhalophyteSuaeda salsaunder salinity[J].Plant Sci,2009,176:200-205.

[7]SONG J,FAN H,ZHAO Y Y,et al.Effect of salinity on germination, seedling emergence,seedling growth and ion accumulation of a euhalophyteSuaeda salsain an intertidal zone and on saline inlind[J]. Aquat Bot,2008,88:331-337.

[8]趙可夫，范海，江行玉，等.鹽生植物在鹽漬土壤改良中的作用[J].應用與環境生物學報，2002，8（1）：31-35.

[9]葉春，范家佑，楊根琴，等.微波輔助提取魚腥草葉總黃酮的工藝研究[J].中國釀造，2009，28（1）：134-137.

[10]滕海鵬，仲山民，吳峰華，等.超聲波輔助提取菊米中的總黃酮[J].中南林業科技大學學報，2009，29（3）：146-149.

[11]王蕙，付燕，郎久義，等.酶法及半仿生法提取銀杏黃酮的工藝研究[J].遼寧中醫院大學學報，2009，11（2）：146-148.

[12]劉玉芬，夏海濤.響應面法優化堿蒿黃酮提取工藝及其體外抗氧化作用[J].食品科學，2012，33（12）：63-68.

[13]扶慶權，侯佩，陳能.響應面法優化蘆蒿葉總黃酮的提取工藝[J].食品科學，2013，34（4）：94-98.

[14]王昌濤，孫嘯濤，周雪.響應面分析法優化雪靈芝黃酮提取工藝[J].食品科學，2013，34（14）：91-95.

[15]王文蘭，楊梅，嚴平，等.響應面分析法優化回流提取岷江柏總黃酮工藝[J].食品科學，2012，33（18）：57-62.

[16]李娜，董明，張國慶，等.響應面法優化榴蓮皮中總黃酮的提取工藝[J].食品工業科技，2011，32（9）：325-332.

[17]盧曉江.中藥提取工藝與設備：第一版[M].北京：化學工業出版社，2004：125-128.

[18]吳現芳，趙成愛，余梅燕，等.響應面法優化八寶景天葉總黃酮的超聲提取工藝[J].食品工業科技，2013，34（1）：224-228.

Optimization of extraction process of flavonoids fromSuaeda salsaby response surface methodology

PANG Tingcai,ZHONG Qiuping,HU Shangying,XU Shuqing,LI Chuanglian
(College of Food Engineering,Qinzhou University,Qinzhou 535099,China)

The extraction conditions of flavonoids fromSuaeda salsawere optimized by response surface methodology.Using the flavonoids yield as evaluation index,the ethanol content,solid-liquid ratio,extraction time and temperature were researched by single factor experiments and response surface methodology.The optimal extraction conditions of flavonoids fromSuaeda salsawere ethanol content 89.0%,solid-liquid ratio 1∶35(g∶ml), extraction time 3.1 h and temperature 67.0℃.Under the conditions,the theoretical value and actual value ofS.salsaflavonoids yield was 3.52%and 3.50%,respectively,which showed that the optimal method was reasonable and feasible.

response surface methodology;Suaeda salsa;flavonoids;extraction

TS201.1

0254-5071（2016）11-0140-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.029

2016-07-06

欽州學院校級科研項目（2013XJKY-09B）

龐庭才（1985-），男，實驗師，碩士，研究方向為植物有效成分提取與分析。