枯草芽孢桿菌胺氧化酶基因的克隆與表達

楊春艷，沈璽龍，張問平，袁時潔，吳擁軍*

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

枯草芽孢桿菌胺氧化酶基因的克隆與表達

楊春艷，沈璽龍，張問平，袁時潔，吳擁軍*

（貴州大學生命科學學院，貴州貴陽550025）

以細菌型豆豉工業發酵菌種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ3-2為材料，根據NCBI中菌株B.subtilis168的胺氧化酶（AMO）基因序列設計同源引物，克隆獲得菌株B.subtilisBJ3-2的胺氧化酶基因YobN序列。測序結果顯示，YobN基因開放閱讀框（ORF）長為1 437 bp，編碼478個氨基酸，分子質量為53.79 ku，與菌株B.subtilis168同源性達98%。目的基因克隆至原核表達載體，獲得重組菌pET28a-YobN/BL21，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結果顯示，濃度為1.0 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）22℃誘導5 h，表達量最高達1.30 mg/mL。該研究為AMO活性的研究奠定了基礎，對豆類發酵食品中生物胺的控制具有重要意義。

枯草芽孢桿菌；胺氧化酶；基因克隆；基因表達

大豆起源于中國，大豆及其制品是東方食品的精華，是中國傳統食品的“瑰寶”。我國傳統豆制品制作歷史悠久，品種非常豐富[1]。豆豉、腐乳、豆醬、醬油并稱為我國四大傳統發酵豆制品[2]。大豆蛋白質中含有人體必需的8種氨基酸，且具有多種保健功能[3]。

豆豉作為中國傳統豆制品中的一種，現已發展成為馳名中外的地區品牌食品[4]。按發酵過程中主要微生物的不同，分為曲霉型、毛霉型和細菌型3種[5]。豆豉的生產主要以自然發酵為主，受生產條件的限制，帶來了一系列食品安全隱患[6]。如在發酵生產過程中的部分菌株常因具有較高的氨基酸脫羧酶活性而導致產品中生物胺（biogenic amine，BA）的大量積累。適量的生物胺可起到促進生理活動、提高生理機能，但是過量的生物胺會引起生物體產生很多不良的反應，嚴重時甚至會導致生物體死亡。但目前我國對食品中生物胺的現行標準僅涉及魚類制品中的組胺，對其他食品中的生物胺尚無限量標準[7-9]。豆豉作為貴州地區的一種特色食品，對貴州地區的經濟發展具有重要作用。所以為保證地區特色經濟的健康發展及發酵食品的安全性，有必要對豆豉產品中生物胺的控制進行進一步研究。

生物胺的代謝途徑是一個復雜的過程，游離氨基酸在氨基酸脫羧酶的催化作用下形成生物胺[10-12]。目前認為去除食品中過量生物胺最有前景的方法是利用某些微生物產生的胺氧化酶降解生物胺[13-16]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）可作為豆豉工業生產菌株[17]，但其胺氧化酶活性研究較少。本研究以菌株B.subtilisBJ3-2為目標菌株，根據NCBIB.subtilis168菌株假定的胺氧化酶（amine oxidase，AMO）中基因序列YobN，設計特異性引物，以B.subtilisBJ3-2基因組DNA為模板PCR擴增，T載體克隆獲得到pGEM-Yob N，測序驗證正確后，亞克隆至pET-28a，以大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）為宿主菌，獲得重組菌pET28a-YobN/BL21（DE3）。經異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）誘導表達后，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）電泳檢測。鎳柱純化后獲得AMO蛋白，可用于后期酶活測定及酶學性質的研究。通過控制豆豉發酵過程中的pH值、溫度、鹽濃度等因素可有效提高AMO活性，探索出AMO對生物胺中哪一種胺類物質的作用效果最大，從而降低豆類發酵食品中生物胺含量，提高其食用安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和質粒

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BJ3-2、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α均為本實驗室保藏菌株；宿主菌為大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）、表達載體pET28a：德國默克（中國）公司；克隆質粒pGEM-T載體：美國Promega公司。

1.1.2 PCR擴增引物

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增目的基因的名稱及引物序列見表1。

表1 擴增目的基因的名稱及引物序列Table 1 Name and primer sequence of amplified target gene

1.1.3 主要試劑

T4DNA連接酶（ligase enzyme）、溶菌酶：美國Promega公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）、DL2000DNAMarker、rTaqDNAPolymerase、限制性核酸內切酶、DNA連接試劑盒：TaKaRa（大連）公司；氨芐青霉素（ampicillin）、卡拉霉素（kanamycin）：北京索萊寶科技有限公司；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒：美國Omega公司；基因組DNA提取試劑盒：美國Promega公司。

1.1.4 培養基

LB培養基：配制方法見參考文獻[18]。

1.2 儀器與設備

MyCycler PCR儀、Gel Doc XR凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；DYY-4型穩壓穩流電泳儀、DYCZ-25D小型垂直電泳槽（SDA-PAGE電泳槽）：北京六一儀器廠；SW-CJ-1FD標準型凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；GMSX-280高壓滅菌鍋：英國阿斯太歐（Astell）公司；SHZ-82A氣浴恒溫振蕩器：江蘇榮華儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA的提取

挑取B.subtilisBJ3-2單菌落，接種到5 mLLB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜，參考Promega公司的革蘭氏陽性細菌中提取基因組的試劑盒說明書提取B.subtilisBJ3-2全基因組。

1.3.2 PCR擴增胺氧化酶基因

以提取的B.subtilisBJ3-2基因組DNA為模板，使用PCR擴增引物進行目的片段的擴增。PCR反應體系：10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP Mixture 1.6 μL，10 μmol/μL Forward Primer 0.5 μL，10 μmol/μL Reverse Primer 0.5 μL，Template DNA 1.0 μL，rTaqDNA Polymerase 0.1 μL，ddH2O 14.3 μL，總體積20μL。PCR反應條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，58.5℃復性45s，72℃延伸45s，30個循環，72℃、10min。反應結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 重組質粒pGEM-YobN的構建及測序

PCR產物采用膠回收試劑盒進行純化，純化后的PCR產物與pGEM-T載體連接。連接及連接產物的轉化方法按試劑盒操作說明書進行。將10μL連接產物按常規方法轉化至E.coliDH5α感受態細胞中。挑選重組子提取質粒進行PCR鑒定測序。將陽性菌株提取質粒后送至Life Technologies公司進行測序。序列通過網站http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi的BLAST軟件對基因序列進行在線比對分析，分析判定所克隆的基因是否為目的基因。將測序鑒定正確的重組質粒命名為pGEM-YobN。

1.3.4 重組表達載體pET28a的構建

將質粒pGEM-YobN及表達載體pET28a分別用BamH I（37℃）和XhoI（37℃）雙酶切，將目的片段膠回收并純化，用T4DNA Ligase enzyme將其與雙酶切的載體pET28a連接。按照試劑盒DNA Ligation Kit Ver.2.1中的說明書的使用方法進行連接。按摩爾比3∶1進行酶連，酶連產物轉化E.coliDH5α。

1.3.5 目的蛋白的表達分析

將重組表達載體pET28a-YobN和空載體pET28a分別轉化E.coliDH5α，將獲得的轉化子再分別接種到含有卡那霉素（kanamycin，Kan）的LB固體平板上劃線，37℃恒溫培養箱中過夜培養。從平板上挑取單克隆菌落，接種入5 mL含有卡那霉素（Kan）50 μg/mL的LB液體培養基中，37℃、180 r/min振蕩培養過夜。次日將培養物離心，收集菌體，對菌體進行超聲波破碎后離心（破碎條件為冰水浴、220 W、30 min、超聲3 s間歇3 s），取上清10%進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測。

22℃溫度條件下，用終濃度分別為0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、0.75 mmol/L、1.00 mmol/L、1.25 mmol/L、1.50mmol/L、1.75mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）在5 mL試管內進行小量誘導表達，誘導7 h。各取出1 mL加上樣緩沖液經沸水煮20 min，12 000 r/min條件下離心10 min，取上清12%進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.3.6 重組蛋白的純化及濃度測定

利用德國Novagen公司提供的His.Bind PurificationKit蛋白純化試劑盒進行蛋白純化。最后用考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度。

2 結果與分析

2.1 B.subtilisBJ3-2基因組DNA的提取及PCR擴增

以菌株B.subtilisBJ3-2基因組DNA為模板，溫度梯度PCR擴增YobN基因，經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。由圖1可知，在1～4號泳道均出現3條帶，其中約1 400 bp處擴增條帶與預期的YobN片段大小相符。

圖1 目的基因PCR擴增電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of target gene by PCR amplification

2.2 重組質粒PCR的鑒定

膠回收目的DNA片段，T載體連接后轉化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α。菌落PCR鑒定為陽性的重組菌落接種LB培養基過夜培養，提取質粒DNA，并進行質粒PCR鑒定，結果見圖2。由圖2可知，在預期大小處出現特異性條帶，說明目的基因已正確克隆至pGEM-T載體中，重組載體命名為pGEM-YobN。

圖2 重組質粒PCR擴增電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of recombinant plasmid by PCR amplification

2.3 目的基因的序列分析

將質粒PCR均鑒定為陽性的重組質粒測序。結果表明，克隆基因全長1 437 bp，BioXM軟件分析基因編碼478個氨基酸殘基，計算其蛋白質理論分子質量為53.79 ku，等電點為7.8，其中鳥嘌呤（G）+胞嘧啶（C）含量為44.17%。將所克隆的基因序列與GenBank數據庫進行序列Blast比對，結果表明，克隆得到的基因序列與B.subtilis168的假定胺氧化酶（amine oxidase，AMO）基因序列的同源性達到98%，說明所克隆的基因正確。

2.4 重組表達載體pET28a-YobN的構建及鑒定

將該基因與pET28a載體連接，雙酶切驗證結果見圖3。由圖3可知，酶切產物片段大小與克隆的基因大小相符。在一號泳道中出現了兩個條帶，其中較小的條帶出現的位置大約在1 430 bp處，與目的基因（YobN）序列大小一致。這表明克隆的胺氧化酶基因與表達載體pET28a連接成功，即預期獲得重組表達載體pET28a-YobN重組子。

圖3 pET28a-YobN重組質粒酶切鑒定Fig.3 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET28a-YobN

2.5 目的蛋白誘導表達

22℃溫度條件下，用終濃度分別為0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、0.75 mmol/L、1.00 mmol/L、1.25 mmol/L、1.50 mmol/L、1.75 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）在5 mL試管內進行小量誘導表達，誘導7 h。各取出1 mL經沸水煮20 min，SDS-PAGE電泳檢測菌體裂解液，結果見圖4。

由圖4可知，在1號泳道中未添加誘導物的菌液蛋白基本不表達，在2～8號泳道中出現了很明顯的蛋白條帶，蛋白表達顯著。通過軟件Quantity One分析得出目的蛋白的分子質量大小約為53.79 ku，與推測的蛋白質分子質量大小相當，2～8號泳道的條帶灰度值（trace值）大小分別為319、355、353、359、350、354、332 INT。因為5號泳道的trace值為最大，而此時用到的IPTG的濃度為1.0 mmol/L，所以得出濃度在1.0 mmol/L IPTG處的蛋白表達量最大。

圖4 SDS-PAGE檢測蛋白小量誘導表達結果(不同IPTG濃度)Fig.4 Induced expression results of protein by SDS-PAGE analysis (different IPTG concentration)

22℃溫度條件下，用終濃度為1.0 mmol/L的IPTG在5 mL試管內進行小量誘導表達，誘導時間分別為2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，菌體裂解液經SDS-PAGE電泳檢測，結果見圖5。

圖5 SDS-PAGE檢測蛋白小量誘導表達結果(不同時間)Fig.5 Induced expression results of protein by SDS-PAGE analysis (different time)

由圖5可知，通過軟件QuantityOne分析可得，trace值大小為199、238、243、253、254、296、306 INT，數值趨勢大致為梯度增加，由此可知蛋白的表達量跟隨誘導時間的延長而逐步提高，且在5 h后表達的蛋白濃度基本趨于穩定。由此可以推測，在相同的條件下，誘導時間是影響蛋白表達的主要因素。

2.6 目的蛋白提取、純化

將重組菌液接種于500 mL含卡拉霉素（kanamycin）的LB培養基，搖瓶培養，以終濃度1 mmol/L IPTG，22℃誘導表達5 h。超聲處理后的細胞混合裂解液、上清及未誘導的細胞裂解液進行SDS-PAGE電泳檢測。選取上清蛋白部分，利用His純化試劑盒進行過柱純化除去雜蛋白，結果見圖6。

圖6 純化蛋白電泳圖Fig.6 Electrophoretogram of purified protein

由圖6可知，在預期大小附近均看到蛋白濃度較高的誘導表達帶。根據軟件QuantityOne分析可得四個泳道的trace值分別為438、552、418、389INT。比較1、2與3、4號泳道數值大小，兩者差距不明顯，說明目的蛋白在上清部分的含量較高，在沉淀中的含量較少，所以后續實驗均取上清作為蛋白提取液。在5號泳道中目的蛋白純化結果表明，蛋白與柱結合效果較好，用200 mmol/L的咪唑洗脫可獲得較高濃度的蛋白。

2.7 目的蛋白濃度測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，以牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標準蛋白質，以不同質量濃度蛋白質（X）為橫坐標，吸光度值A595nm（Y）為縱坐標，繪制牛血清蛋白標準曲線，得出回歸方程：Y=0.351 3X+0.002 1，相關系數為R2=0.998 5。按照回歸方程計算樣品中蛋白質質量濃度高達1.30 mg/mL，可用于后期酶活測定及酶學性質的研究。

3 結論

細菌型豆豉作為貴州地區一種廣受大眾喜愛的特色發酵食品，年產值達幾十億，如“老干媽風味水豆豉”等暢銷國內外，對貴州地區的經濟發展具有重要作用。現在豆豉的生產主要以自然發酵為主，因此會有多種微生物的參與。在很多這些微生物中都含有氨基酸脫羧酶，且豆類食品中含有非常多的游離氨基酸，所以通過對參與發酵微生物的分析發現食品中存在潛在的生物胺污染風險，盡管豆豉中毒事件已有不少報道，但生物胺引起的食品中度還未見關注。

生物胺合成的最主要的途徑是氨基酸的脫羧反應，而胺氧化酶作為分解生物胺的關鍵酶，因此必須對胺氧化酶所對應的基因、表達量、及酶活性等等進行研究，最終使其大量表達，且具有較高的活性，從而降低發酵食品中生物胺的含量。本研究以枯草芽孢桿菌作為豆豉發酵過程中的主要菌種，研究成功克隆獲得了菌株B.subtilisBJ3-2胺氧化酶基因YobN，并以pET-28a作為表達載體，1 mmol/LIPGT誘導表達純化后獲得1.30 mg/mL目的蛋白。作為胺氧化酶來說，它的活性受到溫度、pH、NaCl等因素的影響，而生產實踐中不僅要考慮這些因素對該酶活性的影響，還要面對很多食品輔料（如辣椒、花椒、味精等）對它的影響。因此，獲得純化的AMO對進一步深入研究其活性影響因素及酶學性質奠定了基礎，對指導生產具有實際意義。

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Cloning and expression of amine oxidase genes fromBacillus subtilis

YANG Chunyan,SHEN Xilong,ZHANG Wenping,YUAN Shijie,WU Yongjun*
(College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Using the bacterial type Douchi industrial fermentation strainBacillus subtilisBJ3-2 as a material,homology primers were designed according to the amine oxidase(AMO)gene sequence ofB.subtilis168 in national center for biotechnology information(NCBI),the AMOYobNgene ofB.subtilisBJ3-2 was cloned and obtained.The results of sequence analysis indicated that open reading frame length(ORF)ofYobNgene was 1 473 bp,which could encode 478 amino acids with molecular mass of 53.79 ku,and homology of YobN gene was 98%withB.subtilis168.The target gene was cloned into prokaryotic expression vector to obtain recombinant strain pET28a-YobN/BL21.The results of SDS-PAGE showed the target protein was induced with 1.0 mmol/L IPTG at 22℃for 5 h,and the expression of AMO was up to 1.30 mg/ml.The study laid the foundation for the research of AMO activity,and had important significance for the control of biogenic amines in fermented soy foods.

Bacillus subtilis;amine oxidase;gene clone;gene expression

Q936

0254-5071（2016）11-0153-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.032

2016-08-24

國家自然科學基金項目（31260394/C200207）

楊春艷（1991-），女，碩士研究生，研究方向為微生物學。

*通訊作者：吳擁軍（1971-），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。