肝竇內皮細胞誘導T細胞免疫耐受

景亞青，劉 義，韓 菲，袁晶華，李克秋，李 光

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肝竇內皮細胞誘導T細胞免疫耐受

景亞青1，劉 義1，韓 菲2，袁晶華1，李克秋1，李 光1

目的 探討肝竇內皮細胞(LSEC)對T細胞的耐受作用。方法 CD3和CD28抗體活化的人T細胞和人LSEC混合培養，檢測48 h時單獨培養和混合培養T細胞的凋亡情況和細胞因子白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素4(IL-4)和白細胞介素10(IL-10)的表達量及分泌量。結果 和LSEC混合培養的T細胞凋亡率顯著高于單獨培養的T細胞，混合培養的T細胞中IL-2的表達量沒有發生明顯變化，IL-4的表達量顯著升高，IL-2/IL-4的值降低，IL-10的表達量增加。IL-2、IL-4和IL-10細胞因子分泌情況和表達量一致。結論 LSEC可通過降低T細胞數目和改變細胞因子分泌兩種途徑誘導T細胞產生耐受。

LSEC；T細胞耐受；混合培養；凋亡檢測；細胞因子

肝臟是人體最大的有消化和排毒功能的臟器，容易受到傷害。肝臟功能失調會導致各種并發癥的產生。目前，肝移植是治療各種終末期肝病(肝癌、肝硬化)最重要的手段[1]。和其他器官移植相比，肝臟更容易產生耐受。肝是人體重要的免疫器官，人的肝臟有兩個血液供應途徑：門靜脈和肝動脈[2]，分別含有胃腸道和系統免疫的抗原，環境的復雜性要求肝臟既可以抵御外來抗原還可以防止肝臟細胞被破壞。肝臟可通過外周耐受途徑，防止免疫細胞(特別是T細胞)對肝造成損傷。肝的免疫耐受作用主要由非實質細胞發揮[3]，肝竇內皮細胞(liver simusoidal endothelial cell, LSEC)是肝臟內含量最多的非實質細胞，其功能與移植物的存活狀態有關[4-5]。本研究通過LSEC對體外活化的T細胞凋亡情況和細胞因子分泌情況進行分析，探討其對活化T細胞的耐受作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人原代LSEC株購自上海復蒙生物科技有限公司。富含血小板的白膜購自天津市血液中心。

1.2 主要試劑 內皮細胞培養基(endothelial cell medium, ECM)購自美國Sciencell公司；淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物技術公司；CD3免疫磁珠購自德國Miltenyi公司；AnnexinV/7-AAD凋亡檢測試劑盒購自美國eBioscience公司；IL-2、IL-4和IL-10 ELISA檢測試劑盒購自北京達科為生物技術有限公司；TRIzol、MLV-cDNA合成試劑盒和Real-time PCR檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 LSEC復蘇 將1 ml 10 μg/ml纖連蛋白溶液加到10 cm培養皿中，輕輕晃動使液體均勻附在培養皿底，37 ℃恒溫培養箱中孵育過夜。將含有105個LSEC的凍存管放置到37 ℃恒溫水浴鍋中，緩慢轉動凍存管至完全融化，將液體移至已包被好的培養皿中，并加入ECM培養基，37 ℃、5% CO2恒溫培養箱培養16 h后進行細胞換液，并繼續培養。待細胞生長至覆蓋90%培養皿時，進行胰酶消化傳代培養。

1.3.2 T細胞分離活化 將人白膜細胞和生理鹽水等體積混合并吹打均勻，輕輕加入到含等體積淋巴細胞分離液的離心管中，使分離液和細胞層界限清晰，2 000 r/min室溫離心20 min，吸出中間的細胞層，PBS清洗2次，進行細胞計數。

取108個淋巴細胞懸液離心，加入800 μl預冷的磁珠緩沖液重懸細胞，4 ℃孵育15 min，加入12 ml磁珠緩沖液1 200 r/min離心10 min。用1 ml磁珠緩沖液重懸細胞，將細胞過MS分離柱，1 000 r/min離心10 min，制備細胞懸液，計數細胞數目。

吸取T細胞懸液50 μl放入1.5 ml離心管中，加入1 μl FITC標記的CD3抗體，4 ℃避光孵育30 min。將細胞懸液1 000 r/min離心5 min，PBS清洗2次，并加入1 ml 4%多聚甲醛重懸細胞，流式細胞儀(BD verse，美國BD公司)分析T細胞含量。

磁珠分選得到的T細胞加入含1 μg/ml CD3和1 μg/ml CD28抗體的1640培養基(包括15%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素抗生素溶液)中培養24 h。

1.3.3 LSEC和T細胞混合培養 生長狀況良好的LSEC進行傳代，計數細胞，將105個LSEC接種到纖連蛋白包被的6孔板中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜。吸去ECM培養液，調整T細胞濃度，分別將2×105個T細胞接種到含或不含LSEC的6孔板中，37 ℃、5% CO2培養48 h。

1.3.4 AnnexinV/7-AAD凋亡檢測 將培養的T細胞吸出，1 100 r/min 離心4 min，吸去上清液，PBS清洗細胞。1 100 r/min 離心4 min后，吸去上清液，加入1 ml溶液懸浮細胞。單獨培養的T細胞和混合培養的T細胞進行PE標記的AnnexinV和7-AAD染色30 min，PBS清洗細胞2次，加入1 ml 4%多聚甲醛溶液重懸細胞，采用BD verse細胞儀檢測細胞凋亡情況，FlowJo 7.6.1軟件分析T細胞凋亡情況。

1.3.5 mRNA表達水平 TRIzol法提取單獨培養48 h T細胞和混合培養48 h T細胞的mRNA，采用Nanodrop儀(Nanodrop 2000，美國Thermo公司)檢測mRNA的濃度和純度，選用MLV-cDNA逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA。采用熒光定量PCR儀(7500 Fast，美國ABI公司)檢測IL-2、IL-4、IL-10的mRNA水平，引物序列見表1。根據擴增的Ct值計算基因表達量，以48 h單獨培養的T細胞為參照計算ΔΔCt，基因相對表達量為2-ΔΔCt。

表1 Real-time PCR檢測mRNA表達情況引物序列

1.3.6 細胞因子含量測定 采用雙夾心酶標法檢測細胞因子IL-2、IL-4和IL-10的分泌情況，按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測單獨培養的LSEC、單獨培養的T細胞和混合培養細胞48 h時上清液中細胞因子的分泌情況。采用ELISACal軟件繪制細胞因子標準曲線，并根據標準曲線和樣本吸光度值計算細胞因子的分泌量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 LSEC和T細胞生長情況 LSEC解凍后均勻的懸浮在ECM中，經過16 h的過夜培養，LSEC呈梭形貼附在培養皿底部生長，更換新的ECM培養48 h時LSEC貼壁生長，細胞形態為鵝卵形或梭形，細胞表面光滑，折光率較強。CD3免疫磁珠分離得到1.5×107個T細胞，得率為15%，純化的T細胞比例由62.7%增加到98.3%，見圖1。培養24 h后的T細胞形態均一，大小一致，透光率較高。培養48 h的T細胞與LSEC混合培養，24 h后觀察T細胞貼附在LSEC細胞表面，兩者狀態較好，見圖2。

圖1 白膜和CD3磁珠分選后T細胞比例

A：T細胞在白膜淋巴細胞的比例；B：CD3磁珠分選后T細胞的比例

圖2 單獨培養和混合培養下的LSEC

A：單獨培養的LSEC×100；B：T細胞和LSEC混合培養×200

2.2 LSEC促進T細胞凋亡 由圖3可見，單獨培養的T細胞凋亡率為(9.70±0.36)%，與LSEC混合培養的T細胞早期凋亡率為(17.43±0.70)%，混合培養T細胞凋亡率明顯高于單獨培養的T細胞(t=9.76，df=4,P=0.000 6)，說明LSEC可有效誘導T細胞凋亡。

2.3 細胞因子IL-2、IL-4及IL-10的mRNA表達水平 單獨培養的T細胞和混合培養的T細胞mRNA檢測結果表明：IL-2 mRNA的表達量兩者沒有明顯變化，混合培養的T細胞IL-4和IL-10 mRNA的表達量顯著高于單獨培養的T細胞，混合培養的T細胞IL-2和IL-4 mRNA的比值顯著低于單獨培養的T細胞(IL-2t=2.10, df=4，P=0.103 2; IL-4t=7.67, df=4,P=0.001 6; IL-2/IL-4t=16.22, df=4,P<0.000 1; IL-10t=12.43, df=4,P=0.000 2)，見圖4。

圖3 AnnexinV/7-AAD檢測T細胞凋亡情況

A：T細胞48 h凋亡情況；B：LSEC混合培養的T細胞凋亡情況

2.4 細胞因子IL-2、IL-4及IL-10的分泌情況 ELISA法檢測細胞因子的分泌情況，統計結果顯示與LSEC共培養的T細胞，上清液中IL-4和IL-10的分泌量增加，IL-2的分泌量無明顯變化，表明LSEC可降低IL-2/IL-4的值并有效刺激IL-10的分泌，有利于誘導免疫偏離，與mRNA表達檢測結果一致，見圖5(FIL-2=157.60,P<0.000 1；FIL-4=88.54,P<0.000 1；FIL-10=30.47,P=0.007)。

3 討論

肝臟是實體器官移植中比較容易產生耐受的器官，其它器官(皮膚、心臟、腎)連同肝臟共同移植可降低排斥的發生率，從而增加器官存活時間[6]。LSEC屬于肝臟的非實質細胞的組成部分，約占非實質細胞的50%，含量最多[7]。1970年，Eddie Wisse第一次有確信的證據指出LSEC是一種新的細胞類群。LSEC在肝竇腔內將肝細胞和血液分開，內皮層不含有序的基底細胞層，在肝細胞和內皮細胞間形成一個空隙，稱為Disse間隙，可以防止肝細胞和竇腔直接接觸[8]。LSEC構成了肝臟與外界接觸的第一道防線，可進行物質交換并參與免疫反應，與肝臟的移植耐受過程有關。耐受大鼠血清中LSEC透明質酸含量比排斥大鼠的低，大分子蛋白的攝取速度較快，表明LSEC在機體免疫耐受中可能發揮重要作用[9]。LSEC表面有清道夫受體、甘露糖受體，參與細胞的吞噬作用，表面分子MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ可將抗原呈遞給CD8+和CD4+T細胞，表面分子L-SIGN、ICAM可以將細胞黏附到LSEC。解剖學和分子生物學特征表明LSEC在免疫調節過程中發揮了作用。

圖4 IL-2、IL-4和IL-10的mRNA表達含量

圖5 IL-2、IL-4和IL-10分泌情況

器官移植后免疫排斥反應的發生主要是由細胞免疫反應造成的，活化的T細胞可識別外來的移植物抗原，對移植物發生免疫反應造成移植物喪失功能[10]。移植耐受患者中，免疫反應性T細胞含量減少，而可誘導免疫耐受的調節性T細胞含量增加[11]。在本實驗中LSEC可促進CD3抗體和CD28抗體聯合活化的T細胞凋亡，減少T細胞數量，降低免疫反應。T細胞細胞因子的分泌發生改變是T細胞耐受的形成途徑之一。在T細胞耐受中，主要通過Th1和Th2細胞因子的比例決定[12]。Th細胞是T細胞的一種重要的細胞亞群，可以通過分泌細胞因子來調節機體的免疫應答。Th1細胞主要分泌IL-2、γ-干擾素及腫瘤壞死因子，介導細胞免疫應答，在抗感染、器官移植排斥反應和自身免疫性疾病的誘導過程中起重要作用。Th2細胞產生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，介導體液免疫。有研究[13-14]表明，在器官移植中，長期存活的移植患者可檢測到高表達的IL-10，而在發生急性排斥反應的移植患者中，幾乎檢測不到IL-10。Th1和Th2細胞所誘導的免疫反應能互相調節或產生交叉調節作用[15-16]，其動態平衡對誘導和維持免疫耐受十分重要。Th2可下調Th1誘發的排斥反應，消除損傷效應，從而有助于建立移植免疫耐受。本實驗中和LSEC混合培養的T細胞IL-2/IL-4的比值降低，Th1細胞功能受到抑制，Th2細胞功能增強，Th2分泌的免疫抑制因子IL-10增多[12]。T細胞因子分泌的改變也表明LSEC可促進T細胞耐受。本研究結果表明，LSEC可通過促進T細胞凋亡和調節Th1/Th2細胞因子分泌兩種方式誘導T耐受。

[1] Bosch A,Dumortier J,Maucort-Boulch D,et al.Preventive administration of UDCA after liver transplantation for primary biliary cirrhosis is associated with a lower risk of disease recurrence[J]. J Hepatol, 2015, 63(6):1449-58.

[2] DeLeve L D. Liver sinusoidal endothelial cells and liver regeneration[J]. J Clin Invest,2013,123(5):1861-6.

[3] Spiering R,Margry B,Keijzer C.DEC205+ dendritic cell-targeted tolerogenic vaccination promotes immune tolerance in experimental autoimmune arthritis[J]. J Immunol,2015,194(10):4804-13.

[4] Jenne C N,Kubes P. Immune surveillance by the liver[J].Nat Immunol,2013,14(10):996-1006.

[5] Karimi M H,Geramizadeh B,Malek-Hosseini S A.Tolerance induction in liver[J]. Int J Organ Transplant Med, 2015, 6(2):45-54.

[6] Topilsky Y,Raichlin E,Hasin T,et al.Combined heart and liver transplant attenuates cardiac allograft vasculopathy compared with isolated heart transplantation[J]. Transplantation, 2013, 95(6):859-65.

[7] Igarashi Y, Onoe T, Ohdan H. The role of liver sinusoidal endothelial cells in induction of carbohydrate reactive B cells tolerance through the programmed death 1/programmed death ligand 1 pathway[J]. Transplantation, 2015, 99(11):2325-36.[8]DeLeveLD.Liversinusoidalendothelialcellsinhepaticfibrosis[J].Hepatology, 2015, 61(5):1740-6.

[9]GeX,NowakG,EriczonBG.Liversinusoidalendothelialcellfunctioninrejectedandspontaneouslyacceptedratliverallografts[J].TransplInt,2008, 21(1):49-56.

[10]MatignonM,AissatA,Canoui-PoitrineF,etal.Th-17alloimmuneresponsesinrenalallograftbiopsiesfromrecipientsofkidneytransplantsusingextendedcriteriadonorsduringacuteTcell-mediatedrejection[J].AmJTransplant,2015, 15(10):2718-25.

[11]DenneyHA,WhittleRJ,LaiJ,etal.RegulatoryTcellsinchronicGraft-Versus-Hostdiseaseafterextracorporealphotopheresis:correlationwithskinandglobalorganresponses,andabilitytotapersteroids[J].Transplantation, 2016:[Epubaheadofprint].

[12]LiB,TianL,DiaoY.ExogenousIL-10inducescornealtransplantationimmunetolerancebyamechanismassociatedwiththealteredTh1/Th2cytokineratioandtheincreasedexpressionofTGF-β[J].MolMedRep, 2014, 9(6):2245-50.

[13]IngelstenM,GustafssonK,OlaussonM,etal.Rapidincreaseofinterleukin-10plasmalevelsaftercombinedauxiliaryliver-kidneytransplantationinpresensitizedpatients[J].Transplantation, 2014, 98(2):208-15.

[14]ShouvalDS,BiswasA,GoettelJA,etal.Interleukin-10receptorsignalingininnateimmunecellsregulatesmucosalimmunetoleranceandanti-inflammatorymacrophagefunction[J].Immunity, 2014, 40(5): 706-19.

[15]ObremskiK.ChangesinTh1andTh2cytokineconcentrationsinilealPeyer′spatchesingiltsexposedtozearalenone[J].PolJVetSci, 2014, 17(1):53-9.

[16]HuA,LiQ,ShiH,etal.Donor-derivedbonemarrowtransfusionproducesmixedchimerismandpromotesaTh2shiftinTh1/Th2balanceinratheterotopicsmallboweltransplantation[J].DigLiverDis, 2012, 44(12):988-94.

T cell immune tolerance induced by LSEC

Jing Yaqing1, Liu Yi1, Han Fei2, et al

(1DeptofGenetics,SchoolofBasicMedicalSciences,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070;2DeptofClinicalLaboratory,TheSecondHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300211)

ObjectiveToexploretheroleofLSEConTcelltolerance. MethodsTcellapoptosis,cytokine(IL-2,IL-4andIL-10)expressionandsecretionofhumanTcellsactivatedbyCD3/CD28aloneandmixed-culturedwithhumanLSECweredetected.ResultsTheratioofcellapoptosiswashigherinmixed-culturedTcellsthanTcellsalone.ThegeneexpressionsofIL-4andIL-10werehigherinmixed-culturedTcellsthanTcellsalone,whilegeneexpressionofIL-2hadnosignificantdifferenceinmixed-culturedTcellsthanTcellsalone.ThecytokinesecretionofIL-2,IL-4andIL-10wasconsistentwithgeneexpression.ConclusionLSECcouldinduceTcelltolerancebydecreasingTcellnumberandalteringcytokinesecretion.

LSEC;Tcelltolerance;mixedculture;apoptosisdetection;cytokine

國家高技術研究發展計劃(863計劃)(編號：2012AA021003)

1天津醫科大學基礎醫學院遺傳學系，天津 3000702天津醫科大學第二醫院檢驗科，天津 300211

景亞青，女，助理實驗師； 李 光，女，教授，博士生導師，責任作者，E-mail: lig@tmu.edu.cn

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.004.html

R 392

A

1000-1492(2016)11-1569-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.004

2016-06-27接收