有機磷農藥樂果在厭氧消化系統中降解的實驗研究

吉喜燕， 劉麗春， 張無敵， 尹 芳， 趙興玲， 王昌梅， 柳 靜， 楊 紅， 劉士清

(1. 云南師范大學， 云南 昆明 650500； 2. 云南省麗江市農村能源管理站， 云南 麗江 674100)

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有機磷農藥樂果在厭氧消化系統中降解的實驗研究

吉喜燕1， 劉麗春2， 張無敵1， 尹 芳1， 趙興玲1， 王昌梅1， 柳 靜1， 楊 紅1， 劉士清1

(1. 云南師范大學， 云南 昆明 650500； 2. 云南省麗江市農村能源管理站， 云南 麗江 674100)

為了解決有機磷農藥對環境造成的持久性污染，文章研究了利用厭氧消化法來降解有機磷農藥。厭氧消化的原料采用廢棄大白菜，有機磷農藥采用樂果。利用樂果對乙酰膽堿酯酶具有抑制作用得原理，采用分光光度法測定樂果在廢棄白菜厭氧消化系統(濕發酵)中的濃度變化。實驗結果表明樂果農藥在厭氧消化系統中具有降解趨勢，初始樂果滴入量越少厭氧消化罐中的樂果降解周期越短,在實驗所設置的厭氧消化系統負荷之下，160 mg·L-1的樂果是此系統能夠消解的極限。實驗結果同時表明，樂果的濃度達到90 mg·L-1以上時，逐漸開始出現對厭氧消化系統產沼氣的抑制作用，系統的產沼氣能力降低，樂果濃度在150 mg·L-1以上時已對產氣造成了嚴重抑制。

厭氧消化； 有機磷農藥； 樂果； 降解

由于殺蟲劑的廣泛使用，不可避免地帶了農藥殘留問題。在眾多農藥殺蟲劑中，有機磷類農藥憑借其強大的殺蟲效果而被大量使用于農業生產中，有數據顯示，在我國，有機磷農藥的用量占到了農藥總用量的一半[1]。現在世界上有機磷農藥商品已達150多種，我國使用的有機磷農藥約有30種，包括殺蟲劑、除草劑、殺菌劑[2]。有磷農藥的過度使用必然造成農殘超標，隨著生物鏈的濃縮效應，極易造成人畜的急性中毒。

有機磷農藥的降解是一個復雜的物理、化學和生物的協同過程[3-4]，有機磷農藥的難降解性致使它對環境有極大的持久性危害性。由世界衛生組織統計，全世界每年的農藥中毒人數大約有30萬，其中有機磷農藥中毒者占到了70%。根據我國農藥學專家的篩選分級，發現每10種強烈污染環境的農藥中就有7種屬于有機磷農藥類。因此，為了確保農業效益的提高和人民生活健康，必須要嚴格控制有機磷農藥殘留，尋找到有機磷農藥的高效降解方法。

有機磷農藥的危害已經引發國內外科學家的關注，并針對有機磷農藥做了大量有價值的相關研究。目前國內外對于有機磷農藥的降解方法有超聲波技術、吸附、洗滌和電離輻射等物理方法；微生物、降解酶和工程菌等生物降解方法；水解、氧化分解和光化學降解等化學方法[5]。以目前的技術來看，農藥殘留降解的研究已進入分子水平，物理、化學和生物方法相互結合，同時也各有利弊。

此外，有效降解有機磷農藥，降低蔬菜瓜果和土壤中有機磷農殘也是至關重要的。然而面對有機磷農藥降解成本高，有效菌株分離難以達到較高效率等諸多問題，有必要探索、研發一種操作簡便、成本低廉，同時具有較高降解效率和良好效果的有機磷農藥降解途徑—厭氧消化系統降解有機磷農藥。為了填補此類空缺，筆者針對有機磷農藥之一樂果在厭氧消化(濕發酵)系統中的降解情況作了相關實驗探究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗以云南省昆明市呈貢區柏枝營社區菜場的廢棄白菜為厭氧消化底物，以實驗室長期運行良好的中溫厭氧消化反應器中的馴化豬糞污泥作為接種物，接種物TS含量為12.30%，VS含量為75.32%。廢棄白菜的TS含量為13.3 %，VS含量為85.17%。實驗使用的有機磷農藥為市售40%的樂果乳油，在農藥售賣店即可買到。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立厭氧消化系統

實驗采用批量式發酵產沼氣的裝置，反應瓶規格為500 mL(共裝入400 mL的物料)。接種物用量為整個反應體系質量分數的30%，即120g。整個厭氧消化反應體系干物質的濃度為6%，加入消化底物白菜 69.5 g。滴加樂果的量為0 mg，4 mg， 8 mg，12 mg，16 mg，20 mg，24 mg，28 mg，32 mg，36 mg，40 mg，44 mg，48 mg，52 mg，56 mg，60 mg，64 mg(每個濃度設置3個平行)設置實驗條件為30℃恒溫水浴。每個厭氧消化系統的農藥具體滴加量和對應濃度見表1。

表1 樂果滴加量及初始濃度

實驗啟動后，每天記錄每個發酵瓶的產沼氣量、測定沼氣中的甲烷含量并每天檢測發酵料液中的樂果的含量(測定料液對乙酰膽堿酯酶的抑制率，再將抑制率帶入工作曲線方程即可求得此抑制率對應的樂果農藥的濃度)[6-9]。裝置見圖1。

A.水槽； B.液體取樣管； C.玻璃導管； D.玻璃三通管； E.氣體取樣口； F.集氣瓶； G.排水瓶； H.智能加熱器； I.數字智能溫控儀圖1 厭氧消化反應裝置

1.2.2 檢測系統中的樂果含量

首先測定實驗中裝入厭氧消化反應系統中的白菜中樂果的殘留含量，方法采用《GB/T5009-2002蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留快速檢測方法標準》。按照國標要求提取白菜液，將按照國標要求配好的對照液和待測樣品液放入721分光光度計的比色池中進行412 nm波長下吸光度的測試并記錄3 min內的吸光度的變化ΔAt。按照公式，抑制率(%)=[(ΔA0-ΔAt)/ΔA0]，計算白菜中樂果對乙酰膽堿酯酶的抑制率。抑制率測定操作方法如下：

1.2.2.1 試劑

pH 值8.0緩沖液：分別取11.9 g無水磷酸氫二鉀+3.2 g磷酸二氫鉀+1000 mL蒸餾水

顯色劑：分別取160 mg 二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)+15.6 mg碳酸氫鈉+20 mL緩沖液，于4℃的冰箱中保存

底物：取25 mg的硫代乙酰膽堿+3 mL蒸餾水，搖勻后置于4℃冰箱中保存使用，但是保存期不得超過兩周。

乙酰膽堿酯酶溶液：8 mg乙酰膽堿酯酶(AchE)+5 mL蒸餾水

1.2.2.2 樣品提取

將收集來的廢棄白菜洗去表面的泥土，用剪刀剪成1 cm左右的方碎片，取剪好的白菜1 g,放入錐形瓶中，加入5 mL緩沖液，震蕩1～3 min，倒出白菜提取液，在搖床上震動5 min，用濾紙濾除提取液，靜置5 min待用。

1.2.2.3 對照溶液

于試管中加入2.5 mL緩沖液，再加入0.1 mL酶液，0.1 mL顯色劑，搖勻后置于37℃水浴中保持15 min。加入0.1 mL底物搖勻，此時被測液體開始顯色反應，應將其立即放入分光光度計比色池中，記錄反應 3 min的吸光值的變化ΔA0。

1.2.2.4 樣品測試

于試管中加入2.5 mL的提取液，其他操作與對照溶液測試的操作相同，記錄反應3 min的吸光值的變化ΔAt。結果按照公式(1)計算:

(1)

式中：ΔA0為對照溶液反應3 min的吸光值變化值；ΔAt為樣品溶液反應3 min的吸光值變化值。

1.2.2.5 判定依據

根據酶抑制率曲線方程來確定樂果的精確含量。

1.2.3 樂果工作曲線繪制

樂果(Dimethoate)具有較高毒性，能夠造成乙酰膽堿酯酶的不可逆抑制，從而降低了酶的催化活性，減緩底物水解速度，進而影響顯色反應，引起產物在412 nm波長下吸光度值的變化[10-12]。按實驗中酶抑制分光光度法研究了不同濃度樂果對固定化酶(乙酰膽堿酯酶)的抑制作用，如圖2工作曲線。首先把樂果配成10 mg·L-1，20 mg·L-1，30 mg·L-1，40 mg·L-1，50 mg·L-1，60 mg·L-1，70 mg·L-1，80 mg·L-1，90 mg·L-1，100 mg·L-1，110 mg·L-1，120 mg·L-1，130 mg·L-1，140 mg·L-1，150 mg·L-1，160 mg·L-1一系列濃度的標準溶液，然后測定反應體系的吸光度，按照下列公式計算抑制率：

y=(A空白-A抑制)/A空白×100%

以y=30%為檢測限。以抑制率y為縱坐標對樂果濃度(mg·L-1)作圖得固定化酶抑制樂果的工作曲線，在30～130 mg·L-1范圍內呈現性關系，線性回歸方程為y=0.5026x+14.53，相關系數R2=0.9972，最低檢出限為30 mg·L-1。樂果的工作曲線見圖2[13-14]。

由圖2可以看出，當農藥樣品的濃度在30～130 mg·L-1時，農藥樂果對乙酰膽堿酯酶的抑制率與農藥濃度成線性關系，即抑制率對農藥濃度的線性回歸范圍在30～130 mg·L-1之內。如果濃度過高時，可以將其稀釋到線性回歸的濃度范圍之內來計算。

圖2 樂果的酶抑制工作曲線

2 實驗結果與分析

2.1 樂果在厭氧消化系統中的濃度變化量

經過32 d的厭氧消化周期，在產沼氣周期完結的同時，被滴進厭氧消化系統的樂果也得到了有效的降解。樂果在每組厭氧消化系統中濃度的變化見圖3。從圖中可以看出初始滴入量較少的厭氧消化罐中的樂果降解周期越短，30 mg·L-1初始濃度組的降解至無法檢出，只需3 d，其后，隨著初始滴入農藥濃度的加大，其降解周期逐漸增長：從5 d，8 d，12 d，13 d，15 d，18 d，20 d，25 d，28 d，32 d不等。另外，從圖中可以顯然地看出，農藥的初始濃度越大，它的降解周期越長并且越難徹底降解，其降解曲線在相同時刻下的斜率也遠遠小于低濃度的實驗組。在實驗周期的前5 d這個時間段內，30 mg·L-1,40 mg·L-1兩個濃度的樂果農藥被厭氧消化系統降解完全。厭氧消化啟動15 d之內，130 mg·L-1以下濃度的樂果農藥被消解完全，經過回歸計算，他們消解后的濃度均接近于0 mg·L-1。當農藥初始濃度超過140 mg·L-1時，其降解周期明顯增加，尤其當農藥的初始濃度增加至160 mg·L-1時，其降解的速率明顯下降，直至厭氧消化的周期結束，依然有少量的樂果未被徹底降解。

從圖3可以推斷，樂果可以在以廢棄白菜為發酵底物的厭氧消化系統中得以有效降解，農藥濃度越大，所需的消解完全的周期越長。在本實驗設計的厭氧消化體系負荷之下，其所能承受的可以消解的樂果的上限為160 mg·L-1。

圖3 樂果濃度在厭氧消化系統中隨時間的變化

2.2 日產氣量和累積產氣量分析

自厭氧消化實驗啟動之日起，對照組、各個實驗組均正常產氣，均無酸化現象。每天記錄每個厭氧消化系統的產沼氣量。具體的日產沼氣量情況見圖4。從圖4，可以直觀地看出實驗中，90 mg·L-1濃度以下的厭氧消化反應體系中，日產沼氣量和未滴加樂果的反應體系中的日產沼氣量幾乎相差無幾。此濃度以下的反應體系日產氣量高峰都集中在反應周期的第7～11 d。并且在此濃度段，樂果的濃度并沒有對日產氣量、日產氣量高峰值產生負影響。從100 mg·L-1樂果濃度至140 mg·L-1濃度段，則對日產氣量的高峰產生了負面影響，從圖4中不難看出，此濃度段的樂果致使反應體系在日產氣量高峰下降的同時，將日產氣量的高峰向后推遲到反應周期的第18～20 d。圖中表征更為明顯的是當樂果濃度升至150～160 mg·L-1濃度段時，樂果的存在已經嚴重抑制了系統的正常產氣，此濃度段的日產氣量高峰只有130 mL，僅為其他反應系統日產氣量最高峰的15%左右。同時日產氣量的高峰期被推至整個厭氧消化周期的末期，大約在反應周期的第23至24 d。

圖4 不同濃度樂果對厭氧消化日產沼氣量的影響

顯而易見，圖4展現了整個厭氧消化周期中樂果對底物消化日產沼氣量的影響。可以由圖中表征的現象推斷，在樂果的濃度達到90 mg·L-1以上時，逐漸開始發揮出對厭氧消化系統產沼氣的抑制副作用。此濃度以上的階段逐漸使系統的產沼氣能力降低。尤其150 mg·L-1以上的樂果濃度已經對產氣造成了嚴重影響和抑制。推斷造成此種負面現象的原因，有可能是較高濃度的樂果致使產甲烷細菌活性的喪失，或者是樂果存在的環境殺死了大量的產甲烷細菌和產氫產乙酸菌，從而導致產沼氣能力的直接降低。

圖5 不同樂果濃度在厭氧消化體系累積產氣量

對應圖4，不同濃度樂果對各組厭氧消化系統日產沼氣量的影響也同樣直接反應在累積產氣量的變化情況上面。圖5詳細表征了實驗中各組厭氧消化系統的累積產氣量情況。從圖中可以看出累積產氣量增長最為快速，也就是曲線斜率最大的階段恰好對應圖4中日產氣量的高峰階段。顯而易見，各個厭氧消化系統的累積產量的最終值呈3個區域分布：第1個區域是2600 mL至3200 mL，存在于此區域30 mg·L-1至60 mg·L-1初始濃度段；第2個區域是70 mg·L-1至140 mg·L-1濃度段；第3個區是2300 mL以下，位于此區域的是150 mg·L-1和160 mg·L-1兩個濃度。這表明，較高濃度的樂果已經抑制了厭氧消化系統的正常產氣。

2.3 甲烷含量變化和pH值變化分析

在厭氧消化中滴加入樂果農藥之后，隨著實驗啟動之后每天測定各個厭氧消化系統所產沼氣的甲烷含量。每個初始農藥濃度下的產氣甲烷含量如圖6。

從圖6中可以看出，滴加農藥組和未滴加農藥的厭氧消化系統在10 mg·L-1至130 mg·L-1濃度段時所產沼氣的甲烷含量沒有明顯差別。也就是說，在此濃度段內，樂果的加入并沒有對沼氣甲烷含量產生影響。但是，當滴加農藥的初始濃度在140 mg·L-1至160 mg·L-1時，甲烷含量明顯下降，甲烷含量高峰也僅為50%，而甲烷含量最高的30 mg·L-1組的甲烷含量高峰則在70%。這說明在實驗所設置的厭氧消化系統負荷之下，當樂果的濃度達到140～160 mg·L-1時，就會對厭氧消化產沼氣的質量產生持續性的負面影響。

圖6 不同樂果濃度下產沼氣甲烷含量

圖7 不同樂果濃度下厭氧消化料發酵料液pH值變化

實驗過程中，在檢測了厭氧消化系統的甲烷含量變化這一參數之外，同時還測定了發酵料液的pH值變化。并將厭氧消化實驗周期內發酵料液每天的pH值隨時間的變化情況繪制成圖7。實驗中的pH值由美國Thermo Euthech臺式pH測試儀測定，測量精度為±0.1。從圖7可以看出，在實驗啟動的第1 d，滴加農藥初始濃度越高的發酵料液其pH值就越小。農藥初始濃度越低的系統，發酵料液的pH值就相對于農藥濃度高的系統要高，但是所有滴加樂果農藥的發酵料液的初始pH值均在6以下，說明滴加樂果農藥后，導致了原發酵料液酸性增強，并且樂果農藥的濃度越大，致酸性就越強。究其原因，是因為樂果農藥一般呈現弱酸性，隨著厭氧消化過程的進行，所有滴加農藥的系統中的料液的pH值隨著樂果在系統中的濃度越來越低而逐漸呈升高趨勢，這也從另一方面驗證了樂果農藥的結構和性質在厭氧消化的作用下發生改變，一定程度上失去了酸性。隨著樂果的降解，各個滴加有樂果農藥的厭氧消化系統的pH值又漸漸恢復到了甲烷細菌最適宜的生長環境，即6. 5～7.3之間。

3 結論與展望

實驗探究了樂果在厭氧消化系統中的降解情況，通過對所得實驗數據的處理和分析，得到以下4個結論：

(1)樂果能夠在以廢棄白菜為消解底物的中溫(30℃)厭氧消化系統中得到有效降解。實驗中設計的農藥濃度梯度范圍之內可以100%降解完全。所有系統降解速率最快、效率最高的樂果降解高峰期集中在整個厭氧消化周期的前5 d。

(2)當樂果農藥濃度達到90 mg·L-1以上時，開始對正常的厭氧消化系統的產氣情況產生負面影響：導致日產氣量高峰的降低和高峰來臨時間不同程度的滯后；導致累積產氣量的逐步減少和日產氣量增長速率的明顯降低。

(3)當農藥的濃度范圍在10 ～130 mg·L-1時，每個系統所產沼氣中的甲烷頷量均與無樂果農藥滴加的系統相差無幾，但當樂果濃度提升至140～160 mg·L-1時，其甲烷含量明顯降低，即高濃度樂果對甲烷含量的提升產生了負影響。

(4)樂果的滴加會使系統變酸，隨著樂果的消解，發酵料液的pH值又恢復到有利于厭氧消化進行的正常pH值環境。隨著樂果農藥的消解，整個系統的pH值緩慢平穩上升，但上升的限值是7.2。

通過以上4個結論，不難推測，樂果這種有機磷農藥有望依靠以厭氧消化為主要工藝的沼氣工程來加以消解，以此可以解決廢棄蔬菜和土壤中有機磷對環境的污染和破壞，在有效降解有機磷的同時，還產生了綠色能源—沼氣。在下一步工作中，筆者研究組將對樂果在厭氧消化系統中的降解最大負荷做進一步測算，并進行沼氣工程的相關設計和計算，從而實現廢棄蔬菜有機磷農藥降解在工程方面的推廣。

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Experiment on Degradation of Organophosphorus Pesticide of Dimethoate in Anaerobic Degradation System /

JI Xi-yan1, LIU Li-chun2, ZHANG Wu-di1, YIN Fang1, ZHAO Xing-ling1, WANG Chang-mei1, LIU Jing1, YANG Hong1, LIU Shi-qing1/

Yunnan Normal University, Kunming 650500, China; 2. Yunnan Lijiang City Rural Energy Station, Lijiang 674100, China)

The anaerobic digestion was adopted to degrade organophosphorus pesticides of dimethoate in this paper. Waste cabbage was used as raw material for anaerobic digestion. Dimethoate was dropped into the digester. The dimethoate content during the digestion was detected by spectrophotometry. The result showed that dimethoate could be degraded in anaerobic digestion, in which the lower the dimethoate concentration, the quicker the degradation speed, and dimethoate concentration of 160 mg · L-1was the highest degradable concentration in this designed experiment. At the dimethoate concentration of 90 mg · L-1, there began to appear the biogas production inhibition, and when the dimethoate concentration was over 140 mg · L-1, the inhibition became serious.

anaerobic digestion; dimethoate; degradation; enzyme inhibition method

2016-01-11

項目來源： 高等學校博士學科點專項科研基金(20135303110001)； 國家自然科學基金(51366015)； 云南省應用基礎研究基金重點項目(2014FA030)； 云南省科技創新提升計劃(2013DH041); 云南省農村能源工程重點實驗室基金(2015)

吉喜燕(1989- )，女，河南洛陽人，碩士，研究方向為生物質能與環境工程，E-mail:ji_xiyan@126.com

張無敵，E-mail:wootichang@163.com; 尹 芳，E-mail:yf709@sina.com

S216.4; X171

A

1000-1166(2016)04-0013-06