奶山羊乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)下最適共培養(yǎng)體系的建立

木合依扎·熱很別克，邵偉，趙艷坤，余雄

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

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奶山羊乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)下最適共培養(yǎng)體系的建立

木合依扎·熱很別克，邵偉，趙艷坤，余雄

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

【目的】研究乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的機(jī)制，提高奶山羊乳腺上皮增殖水平。【方法】采用分離培養(yǎng)的1月齡健康薩能奶山羊乳腺上皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分別設(shè)乳腺上皮細(xì)胞單純培養(yǎng)組和不同比例的乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)組，培養(yǎng)24、48、72、96、120和168 h時觀察各組細(xì)胞的生長狀態(tài)并檢測細(xì)胞增殖率和貼壁率。【結(jié)果】混合培養(yǎng)組增值率和貼壁率比單純培養(yǎng)組高，且細(xì)胞扁平時間晚于單純培養(yǎng)組，混合培養(yǎng)體系可促進(jìn)BMEC的增殖，減緩細(xì)胞凋亡。當(dāng)BMEC與BMSCs以2∶1的比例混合培養(yǎng)到96 h時細(xì)胞的增值率和貼壁率最高。【結(jié)論】奶山羊乳腺上皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系能夠減緩乳腺上皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞貼壁率。最佳共培養(yǎng)濃度為2∶1，最佳作用時間為96 h。

乳腺上皮細(xì)胞；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；共培養(yǎng)；細(xì)胞因子

0 引 言

【研究意義】乳腺上皮細(xì)胞是一種特化的、具有合成和分泌乳汁功能的細(xì)胞。體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞不但具有一定的泌乳功能[1-2]，而且能真實(shí)地反映乳腺生長發(fā)育及泌乳的細(xì)胞或分子生物學(xué)機(jī)制[3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有易分離純化和體外擴(kuò)增，研究表明其可分泌多種細(xì)胞因子[4]。共培養(yǎng)體系是為了模擬組織之間的相互作用，將多種細(xì)胞置于同一環(huán)境中，用以研究這些細(xì)胞之間復(fù)雜的相互反應(yīng)[5]，所以該體系比單一細(xì)胞培養(yǎng)更能夠準(zhǔn)確地反映整體情況。【前人研究進(jìn)展】由于乳腺細(xì)胞的增殖和分化始終貫穿于乳腺發(fā)育及泌乳過程的兩個重要方面。王立文[6]發(fā)現(xiàn)UC-BMSCs共培養(yǎng)能夠促進(jìn)BMEC的增殖。陳秋月[7]通過BMSCs與DPCs共培養(yǎng)可以在不減弱成牙能力的基礎(chǔ)上顯著提高細(xì)胞增殖力。【本研究切入點(diǎn)】試驗(yàn)將乳腺上皮細(xì)胞(BMEC)單純培養(yǎng)和乳腺上皮細(xì)胞(BMEC)與不同比例的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)混合培養(yǎng)，在不同的時間段觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)及形狀，用MTT方法檢測細(xì)胞增值率，細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測細(xì)胞貼壁率。【擬解決的關(guān)鍵問題】檢測乳腺上皮細(xì)胞單純培養(yǎng)與混合培養(yǎng)對乳腺上皮細(xì)胞的增殖及分化的影響，研究奶山羊乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)最佳培養(yǎng)體系，為乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、低速離心儀、Benchmark酶標(biāo)儀、六孔板。

1.1.2 主要試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25胰蛋白酶+EDTA、0.01%PBS、MTT檢測試劑盒。

1.1.3 細(xì)胞制備

1月齡健康薩能奶山羊的乳腺組織中分離乳腺上皮細(xì)胞(BMEC)和骨髓中提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，將乳腺上皮細(xì)胞(BMEC)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)經(jīng)3代純化培養(yǎng)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將奶山羊的乳腺組織中分離乳腺上皮細(xì)胞和骨髓中提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)3代培養(yǎng)純化后設(shè)乳腺上皮細(xì)胞單純培養(yǎng)組和不同比例的乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)組，分別按照1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1等不同比例接種于六孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞總數(shù)維持在1×105/孔，單純BMEC和單純BMSCs對照組每皿接種1×105個細(xì)胞，保持接種細(xì)胞密度相同。37°、5%CO2孵育箱連續(xù)培養(yǎng)7 d，每天換液并收集各組上清保存于-80C°冰箱以便進(jìn)一步檢測。

1.2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與純化

參考解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全骨髓法制備大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞方法，無菌采集1月齡雌性薩能奶山羊股骨，剔除肌肉、筋膜、骨膜、軟骨等，用吸有培養(yǎng)液的一次性注射器沖出骨髓。采用percoll密度梯度離心法純化細(xì)胞[8-9]。將分離純化的細(xì)胞培養(yǎng)至P3代。

1.2.3 乳腺上皮細(xì)胞的分離、純化

參考李慶章等[]的乳腺上皮細(xì)胞分離、純化及傳代方法，培養(yǎng)純化至P3代。

1.2.4 乳腺上皮細(xì)胞(BMEC)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)混合培養(yǎng)

將培養(yǎng)至P3代生長狀態(tài)良好的BMEC和BMSCs混合培養(yǎng)，10%FBS、5%CO2、37℃下培養(yǎng)，每48 h換液一次。

1.2.5 測定指標(biāo)

形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞的形狀及生長狀況、MTT法檢測細(xì)胞增殖、用細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算細(xì)胞貼壁率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間差異采用t檢驗(yàn)，SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMEC單純培養(yǎng)組與BMSCs混合培養(yǎng)組細(xì)胞形態(tài)變化檢測

2.1.1 BMEC單純培養(yǎng)組形態(tài)學(xué)觀察

研究表明，P3代BMEC主要為呈多角形和卵圓形的上皮樣細(xì)胞，在培養(yǎng)24～48 h時乳腺上皮細(xì)胞生長迅速、排列緊密、連接成片、輪廓清晰、細(xì)胞核呈圓形或橢圓形；96 h時細(xì)胞形狀成類似圓頂狀的結(jié)構(gòu)；120 h時大部分細(xì)胞均可貼壁，呈現(xiàn)明顯的生長暈，形成島嶼狀的閉合型細(xì)胞生長群，并逐漸匯合成以鵝卵石或鋪路石樣為主的上皮細(xì)胞，間有少量的成纖維樣細(xì)胞。圖1

2.1.2 BMSCs單純培養(yǎng)組形態(tài)學(xué)觀察

P3代BMSCs培養(yǎng)24 h換液后，即可觀察到貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)短小，呈長梭型、紡錘形；培養(yǎng)至96 h細(xì)胞明顯增多、變長、變大、長梭型、紡錘形形態(tài)更加明顯；120 h時，細(xì)胞基本鋪滿皿壁，細(xì)胞排列呈螺旋狀或漩渦狀。但細(xì)胞開始出現(xiàn)扁平化，部分細(xì)胞開始凋亡。

2.1.3 BMEC與BMSCs混合培養(yǎng)組形態(tài)學(xué)觀察

倒式顯微鏡下觀察共培養(yǎng)體系發(fā)現(xiàn)BMEC與BMSCs混合培養(yǎng)后兩種細(xì)胞共同生長，24 h時較多細(xì)胞貼壁，BMEC呈圓形和多角形，大小不一；BMSCs呈長梭型和紡錘形。48 h時細(xì)胞明顯增多，BMEC呈類似圓頂狀，BMSCs呈長棱型或紡錘形。當(dāng)96 h時BMEC呈鵝卵石或鋪路石樣；BMSCs呈長棱型或螺旋狀。各組細(xì)胞生長狀態(tài)均達(dá)到最佳，到168 h時細(xì)胞開始呈扁平狀，收縮、體積變小。在同一時間不同比例條件下BMEC與BMSCs混合培養(yǎng)的形態(tài)跟兩種細(xì)胞單純培養(yǎng)下的形態(tài)無太大區(qū)別，但以2∶1的比例時細(xì)胞的生長狀態(tài)最好并BMEC與BMSCs的形態(tài)跟原有的形態(tài)更相似。混合培養(yǎng)組的細(xì)胞在每個時間段形成的形狀比單純培養(yǎng)組的早一個時間點(diǎn)。

注：A1-A8分別為BMEC和BMSCs濃度比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1培養(yǎng)組，右側(cè)2張為BMEC單純培養(yǎng)組與BMSCs單純培養(yǎng)組

圖1 BMEC的單純培養(yǎng)組與BMSCs混合培養(yǎng)組細(xì)胞形態(tài)變化
Fig.1 BMEC simple culture group and BMSCs group mixed culture cell morphology change map

2.2 MTT檢測細(xì)胞增殖結(jié)果

研究表明，將BMEC和BMSCs按照不同濃度比混合培養(yǎng)后，BMEC與BMSCs以2∶1的比例培養(yǎng)組的OD值最高，也高于單純培養(yǎng)組，50∶1與100∶1的比例組OD值低于其他濃度組；2∶1濃度混合培養(yǎng)組在各時間段的OD值相比BMEC單純培養(yǎng)組的增值率分別為40.74%、45.16%、46.34%、43.58%、37.14%、35.48%。從24 h時開始各組的OD值慢慢升高，到96 h時各組OD值均高于其他各時間段，從120 h時開始出現(xiàn)下降狀態(tài)。表1

表1 不同濃度BMEC和BMSCs混合共培養(yǎng)后在不同時間點(diǎn)的OD值
Table 1 The OD values of the co-culture at different time(490 nm)

分組Group24h48h72h96h120h168hA10.350.410.430.530.410.33A20.380.450.560.60.480.42A30.330.420.460.510.440.31A40.310.40.440.480.440.32A50.330.410.40.420.40.28A60.30.380.380.410.410.26A70.280.360.350.370.330.27A80.250.330.320.370.30.23BMSCs0.230.320.310.390.340.2BMEC0.270.310.390.410.350.31增值率(%)40.7445.1643.5846.3437.1435.48

注：A1-A8分別為BMEC和BMSCs濃度比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1培養(yǎng)組；增殖率表示2∶1濃度組與BMEC單純培養(yǎng)組相比的增殖率

2.3 細(xì)胞貼壁率檢測

研究表明，將BMEC和BMSCs按照不同濃度比混合共培養(yǎng)后，各組細(xì)胞貼壁率均隨時間的增加而增加，其中2∶1濃度組細(xì)胞貼壁率最高，但與其余各組之間差異不顯著；BMEC與BMSCs單純培養(yǎng)組24 h時開始貼壁，而混合培養(yǎng)組在24 h時部分細(xì)胞已貼壁，當(dāng)96 h時混合培養(yǎng)組1∶1、2∶1、3∶1比例組的細(xì)胞貼壁率已超過80%，而BMEC與BMSCs單純培養(yǎng)組的貼壁率分別為78%和75%。當(dāng)96 h時各組細(xì)胞貼壁率達(dá)到高峰，從120 h開始慢慢下降。圖2

注：A1-A8分別為BMEC和BMSCs濃度比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1、50∶1、100∶1培養(yǎng)組。

圖2 不同濃度BMEC和BMSCs混合共培養(yǎng)后在不同時間點(diǎn)的各組細(xì)胞貼壁率
Fig.2 The cells adherent rate of the co-culture at different time

3 討 論

3.1 BMEC與BMSCs共培養(yǎng)對BMEC細(xì)胞形態(tài)變化的影響

試驗(yàn)將奶山羊乳腺上皮細(xì)胞(BMEC)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)單純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)混合培養(yǎng)24 h時BMEC呈圓形和多角形，與乳腺上皮細(xì)胞單純培養(yǎng)48 h的形態(tài)更接近，混合培養(yǎng)96 h時BMEC呈鵝卵石或鋪路石樣，各組細(xì)胞生長狀態(tài)均達(dá)到最佳，與BMEC單純培養(yǎng)組120 h的形態(tài)所接近，從而推測為共培養(yǎng)加快了乳腺上皮細(xì)胞的生長、增殖。這是因?yàn)楣撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制、多向分化潛能的干細(xì)胞，既容易分離又易于在體外擴(kuò)增，它通過旁分泌功能可分泌各種可溶性細(xì)胞因子，從而為乳腺上皮細(xì)胞的生長和增殖提供必要的微環(huán)境，所以這些細(xì)胞因子調(diào)控了乳腺上皮細(xì)胞的增殖并提前了乳腺上皮細(xì)胞的增殖時間。

當(dāng)BMEC與BMSCs混合培養(yǎng)到168 h時細(xì)胞開始縮小、呈扁平狀，而單純培養(yǎng)組在120 h后開始呈現(xiàn)扁平化，說明混合培養(yǎng)組細(xì)胞衰老時間晚于單純培養(yǎng)組。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過分泌的細(xì)胞因子激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，調(diào)控BMEC的細(xì)胞周期[10]，所以混合培養(yǎng)組中BMSCs可以分泌多種細(xì)胞細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子激活了PI3K/Akt/mTOR信號通路，調(diào)控BMECs的細(xì)胞周期，從而延緩了細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞變形時間推遲。

在混合培養(yǎng)體系下比較不同濃度組的細(xì)胞生長狀態(tài)發(fā)現(xiàn)BMSCs濃度越高細(xì)胞的生長狀態(tài)越好，與兩種細(xì)胞本身的形態(tài)越接近，其中BMEC與BMSCs按2∶1的濃度混合培養(yǎng)組細(xì)胞形態(tài)最佳。施曉雷等[11]在豬肝細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞最適共培養(yǎng)體系的建立中證實(shí)肝細(xì)胞與MSCs以2∶1的比例混合培養(yǎng)組的增殖能力最強(qiáng)。其與試驗(yàn)結(jié)果相符，所以BMEC與BMSCs以2∶1的濃度混合培養(yǎng)更適合BMEC的增殖。

3.2 BMEC與BMSCs共培養(yǎng)對BMEC細(xì)胞增值率的影響

MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，MTT值的高低表示細(xì)胞的活性。試驗(yàn)用MTT法檢測細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示BMEC與BMSCs按2∶1濃度混合培養(yǎng)96 h時的增值率最高，96 h時2∶1濃度混合培養(yǎng)組的OD值比BMEC單純培養(yǎng)組的增值率高46.34%，其次是72 h和120 h的增值率較高；在不同比例的混合培養(yǎng)組各個時間段的增值率幾乎都高于單純培養(yǎng)組。

李全修等[12]用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與髓核細(xì)胞接觸共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能顯著增加髓核細(xì)胞增殖，故試驗(yàn)BMSCs與BMEC混合培養(yǎng)中BMSCs通過自身分泌和旁分泌功能分泌大量的細(xì)胞因子，從而調(diào)控了BMEC的增殖，使混合培養(yǎng)組細(xì)胞的活性更加旺盛。Sneddon等[13]證實(shí)使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)系統(tǒng)、選擇匹配的組織來源的干細(xì)胞可以提高胚胎干細(xì)胞增殖和自我更新的能力，所以共培養(yǎng)體系可影響干細(xì)胞多向分化能力和增值能力。

3.3 BMEC與BMSCs共培養(yǎng)對BMEC細(xì)胞貼壁率的影響

將BMEC和BMSCs按照不同濃度比混合共培養(yǎng)后，各組細(xì)胞貼壁率均隨時間的增加而增加，其中2∶1濃度組細(xì)胞貼壁率最高。當(dāng)96 h時各組細(xì)胞貼壁率達(dá)到高峰，從120 h開始慢慢下降。這是細(xì)胞在進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞外層角質(zhì)開始延伸，貼緊細(xì)胞瓶生長，而角質(zhì)的生長受到細(xì)胞自身活性、培養(yǎng)體系營養(yǎng)水平和生長因子的影響。在此次試驗(yàn)中各組細(xì)胞培養(yǎng)體系營養(yǎng)水平相同，但共培養(yǎng)組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，提高了細(xì)胞活性，促進(jìn)了角質(zhì)的增長，提高細(xì)胞的貼壁。

有關(guān)乳腺上皮細(xì)胞的研究較多，但乳腺上皮細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)的研究較少，王立文等[]在奶牛乳腺上皮細(xì)胞與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)中證實(shí)奶牛臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與乳腺上皮細(xì)胞按1∶2的比例培養(yǎng)72 h時共培養(yǎng)體系細(xì)胞的增殖最佳；顧勁揚(yáng)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與肝細(xì)胞共培養(yǎng)研究試驗(yàn)中提出肝細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞2∶1組成的最適共培養(yǎng)體系培養(yǎng)至第2 d時有望為今后BAL的構(gòu)建提供理想細(xì)胞材料；試驗(yàn)與其不同是奶山羊乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以2∶1的比例混合培養(yǎng)96 h時增殖最佳。原因是不同動物的細(xì)胞生長情況不相同，所以推測為奶山羊的乳腺上皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖比奶牛的乳腺上皮細(xì)胞與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖慢些。

4 結(jié) 論

奶山羊乳腺上皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系能夠減緩乳腺上皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞貼壁率。最佳共培養(yǎng)濃度比值為2∶1，最佳作用時間為96 h；2∶1濃度混合培養(yǎng)組在24、48、72、96、120和168 h的OD值相比BMEC單純培養(yǎng)組的增值率分別為40.74%、45.16%、46.34%、43.58%、37.14%、35.48%，其中96 h時的OD值比例最高，增殖為46.34%。

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Fund project:Xinjiang Key Laboratory topics(2015KL018)；China Postdoctoral Foundation；2015 National Natural Science Foundation(31560645) ；Xinjiang College Research Program(XJEDU2013S17)；"Twelve Five" National Science and Technology Support Project(2012BAD12B09)；Ministry of Agriculture, the modern dairy industry technology system (Cars-37) funding.

Establishment of the Optimal Co-culture System of Dairy Goat Mammary Epithelial Cells and Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Mixed Culture

Muheyizha Rehenbieke, SHAO Wei, ZHAO Yan-kun,YU Xiong

(CollegeofAnimalSciences,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

【Objective】 To explore the effects of mammary epithelial cells co-cultured with mesenchymal stem cells on cell proliferation.【Method】1-month-old Saanen dairy goat mammary epithelial cell and bone marrow mesenchymal stem cells were used and mammary epithelial cells and bone marrow mesenchymal stem cells mixed culture group were set up respectively in the simple culture group along with different proportions of mammary epithelial cells. After they were cultured 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 168 h, the growth state of the cells was observed and the cell proliferation rate and adherence rate were detected.【Result】The results showed that appreciation and attachment rate of mixed culture group were higher than those of the simple culture group, and cell flat time was later than pure culture group．Mixed culture system could promote the proliferation of BMEC and slow apoptosis．When the ratio of BMEC and BMSCs was mixed in the proportion of 2∶1 to 96 h, the rate of increment and adherence rate of the cells was the highest.【Conclusion】The co-culture system of dairy goat mammary epithelial cells and bone marrow mesenchymal stem cells can slow down the apoptosis of mammary epithelial cells, promote breast epithelial cell proliferation，and increase cell adhesion rate．The best co-culture concentration is 2∶1，and the time is 96 h.

mammary epithelial cells；mesenchymal stem cells；co-culture；cytokine

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.10.024

2016-06-07

新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2015KL018)；中國博士后基金委；國家自然基金項(xiàng)目(31560645)；新疆維吾爾自治區(qū)高等學(xué)校科研計(jì)劃項(xiàng)目(XJEDU2013S17)；“十二五”國家科技支撐項(xiàng)目(2012BAD12B09)；農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代奶業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(Cars-37)

木合依扎·熱很別克(1991-)，女，新疆沙灣人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯游餇I養(yǎng)與飼料學(xué)，(E-mail)1437976787@qq.com

余雄(1958-)，教授，博士生導(dǎo)師，中國奶產(chǎn)業(yè)體系科學(xué)家，研究方向?yàn)閯游餇I養(yǎng)與飼料，(E-mail)yuxiong8763601@126.com

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-4330(2016)11-1954-07