具有降糖作用的鼠李糖乳桿菌生物學特性研究

陳 佩,黨 輝,王 偉,陳 衛

(1.陜西廣播電視大學，陜西西安 710119;2.陜西理工學院,生物科學與工程學院，陜西漢中 723001;3.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;4.陜西師范大學 食品工程與營養科學學院,陜西西安 710119)

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具有降糖作用的鼠李糖乳桿菌生物學特性研究

陳 佩1,2,黨 輝3,4,王 偉1,陳 衛3,*

(1.陜西廣播電視大學，陜西西安 710119;2.陜西理工學院,生物科學與工程學院，陜西漢中 723001;3.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;4.陜西師范大學 食品工程與營養科學學院,陜西西安 710119)

本研究旨在評價一株具有降糖作用的鼠李糖乳桿菌的生物學特性。結果表明,該菌株生長較快,2 h進入生長對數期,14 h后進入穩定期,最適生長pH為5～7,最適生長溫度為37 ℃,最適接種量為1%～2%(V/V)。此外,該菌株在強酸條件下可以生長,對人工胃腸液都具有很好的耐受性,耐受膽鹽的延遲時間為0.86 h,在NaCl濃度為9%(W/V)的培養條件下仍可以存活。更為重要的是,這株菌對Caco-2細胞具有較強的粘附能力。綜上所述:該鼠李糖乳桿菌菌株可作為一株具有潛在降糖作用的發酵菌株,用以開發具有降糖作用的新型發酵產品。

降糖,鼠李糖乳桿菌,生物學特性

糖尿病(Diabetes Mellitus)是由多種病因引起的代謝性疾病[1]。我國糖尿病患者人數在過去30年中快速增長了近10倍[2]。目前我國糖尿病人數已超過1億,成為全球糖尿病人數第一大國[3]。因此,對糖尿病的預防和治療有非常迫切的需求。

近年來,乳酸菌被證實具有預防和治療糖尿病的作用。1997年開始Matsuzaki[4]等人發現干酪乳桿菌可降低NIDDM KK-Ay小鼠的血糖,并改善機體免疫。Ma[5]等研究表明VSL#3(雙歧桿菌,唾液鏈球菌,乳酸桿菌)可預防自發性糖尿病的發生。Laitinen[6]等發現鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌可以很好的控制孕婦生產前后的血糖水平,使其具有良好的葡萄糖耐受性,并可提高胰島素敏感性。Yun[7]等研究表明加氏乳桿菌可降低血糖并改善db/db小鼠糖尿病癥狀。Andreasen[8]發現嗜酸乳桿菌可以改善正常志愿者、糖耐量受損病人和Ⅱ型糖尿病患者的胰島素敏感性,并且植物乳桿菌能夠降低糖尿病小鼠血糖。Naito[9]等表明乳酸桿菌代田株能夠改善糖尿病小鼠的糖耐量。Moroti[10]發現嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌顯著降低糖尿病老年患者血糖水平。Ejtahed[11]研究表明嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌改善Ⅱ型糖尿病人空腹血糖并具有抗氧化作用。因此,篩選具有降糖作用的乳酸菌仍然是一個重要的課題。本實驗在前期已篩選并證明鼠李糖乳桿菌具有降糖作用[12],在此研究基礎上,本文主要研究這株鼠李糖乳桿菌的生物學特性,以期為后續的生產應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠李糖乳酸桿菌 江南大學食品生物與技術中心菌株保藏庫;胃蛋白酶(1∶10000)、胰蛋白酶(1∶250)、巰基乙酸鈉 美國sigma公司;人結腸癌腺細胞系Caco-2細胞株 上海生命科學研究院細胞資源中心;DMEM高糖培養基、0.25%胰酶、胎牛血清、雙抗(青、鏈霉素) 美國Gibico公司。

SW-CJ-1CV超凈臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;UV-2100紫外可見分光光度計 尤尼科上海有限公司;5415R冷凍離心機 德國Eppendorf公司;CX41-12C02倒置顯微鏡 日本Olympus公司;細胞培養瓶 美國Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鼠李糖乳桿菌的制備 將凍存于-80 ℃的鼠李糖乳酸桿菌接入MRS液體培養基中,37 ℃培養18 h,連續活化三代后用于后續實驗。

1.2.2 鼠李糖乳桿菌在人工模擬胃腸液中的生長測定 人工模擬胃腸液需新鮮配制。用PBS(pH3.0)配制濃度為3 g/L的胃蛋白酶,過0.22 μm濾膜后制備成所需模擬胃液。用PBS(pH8.0)配置濃度為1 g/L的胰蛋白酶,過0.22 μm濾膜后制備成模擬腸液[13]。

乳酸菌以生理鹽水重懸,并將其菌液密度在模擬胃液(pH3.0)中調節至 1×109CFU/mL,充分混勻,在37 ℃培養1、2和3 h后檢測活菌數。3 h后,取模擬胃液(pH3.0)中的培養液1 mL加入至9 mL的模擬腸液(pH8.0)中,充分混勻,在37 ℃培養2、4和8 h后檢測活菌數[14]。用MRS固體培養基37 ℃培養48 h,乳酸菌的存活率用以下公式計算:

存活率(%)=log cfu N1/log cfu N0×100

N1=經過模擬胃腸液處理之后的乳酸菌活菌數,N0=未處理前乳酸菌的活菌數[15]。

1.2.3 鼠李糖乳桿菌對膽鹽的耐受能力 取對數生長期的鼠李糖乳桿菌,以2%的接種量分別接種于含有或不含0.3%膽鹽的MRS-THIO(MRS含有0.2%的巰基乙酸鈉)培養中,充分混合均勻,在37 ℃下培養。記錄培養基吸光值到達0.3個單位時各組所需的時間,不加膽鹽與加了膽鹽兩組的時間差即為鼠李糖乳桿菌在膽鹽中生長的延遲時間(LT),延遲時間的長短,反映了乳酸菌對膽鹽的耐受能力。時間越短,說明耐受膽鹽的能力越強,反之則耐受膽鹽的能力越弱[16]。

1.2.4 鼠李糖乳桿菌對Caco-2細胞的粘附能力測定 以含有20%胎牛血清,1% L-谷氨酰胺,1%非必需氨基酸和1%雙抗的高糖DMEM完全培養基培養Caco-2細胞,37 ℃,5% CO2的培養箱中進行培養,每天換液,待細胞增殖融合率達到80%左右時,胰酶消化后按照1∶3進行傳代。取對數生長期的細胞進行下步實驗。

Caco-2細胞以4×104cell/孔接種于6孔板中,37 ℃培養24 h。將培養至對數期的鼠李糖乳桿菌離心后用PBS(pH7.2)沖洗3次,重懸于高糖DMEM完全培養基中,調整菌液濃度為1×109CFU/mL,加入到已生長好的Caco-2細胞單層中,37 ℃培養2 h。再以PBS沖洗細胞單層3次,后用甲醇固定30 min,再進行革蘭氏染色。隨機找20個視野數100個細胞,以平均每個細胞上粘附的鼠李糖乳桿菌數來評價其粘附能力[17]。

1.2.5 鼠李糖乳桿菌對NaCl的耐受能力測定 取對數生長期的鼠李糖乳桿菌,以2%接種量分別接入到NaCl質量分數為0%、2%、4%、6%、7%、8%、9%(w/v)的MRS液體培養基中,充分混合均勻,在37 ℃下培養18 h后測定其菌液OD600 nm值[18]。

1.2.6 鼠李糖乳桿菌的最適接種量測定 取對數生長期的鼠李糖乳桿菌,按接種量0.5%、1%、1.5%、2%、5%和10%(v/v)分別加入到MRS液體培養基中,充分混合均勻,在37 ℃下培養18 h后測定其菌液OD600 nm值[19]。

1.2.7 鼠李糖乳桿菌的最適pH測定 以HCl(1 mol/L)調節MRS液體培養基pH分別為2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5和7.0,取對數生長期的鼠李糖乳桿菌,以2%的接種量接種,充分混合均勻,在37 ℃下培養18 h后測定其菌液OD600 nm值[19]。

1.2.8 鼠李糖乳桿菌的最適生長溫度測定 取對數生長期的鼠李糖乳桿菌,按接種量2%接種后,分別在22、26、34、37、42 ℃下培養18 h后測定其菌液OD600 nm值[19]。

1.2.9 鼠李糖乳桿菌的生長曲線測定 取對數生長期的鼠李糖乳桿菌,以2%的接種量接入到MRS液體培養基中,在37 ℃下培養24 h,每隔2 h取樣,測定其菌液OD600 nm值[19]。

2 結果與討論

2.1 鼠李糖乳桿菌在人工模擬胃液(pH3.0)中的存活率

人體胃液的pH(2.5～3.5)一般維持較低水平,是阻止細菌進入腸道的天然屏障,一般食物在胃中消化停留時間為2～4 h[13]。乳酸菌要進入腸道發揮其益生作用,首先應該具有耐受胃液的能力。圖1表明,鼠李糖乳桿菌在人工模擬胃液(pH3.0)中可存活3 h,并且存活率大于80%。Matsumoto[20]等研究發現菌株的耐酸能力大小,與菌株的H+-ATP酶活性有關。因此,本實驗中的鼠李糖乳桿菌具有較好的耐酸能力,可能與其H+-ATP酶活性有關。

圖1 鼠李糖乳桿菌在模擬胃液(pH3.0)中的存活率Fig.1 Survival rate of L. rhamnosus to simulated gastric juice(pH3.0)

2.2 鼠李糖乳桿菌在人工模擬腸液(pH8.0)中的存活率

如圖2所示,鼠李糖乳桿菌在模擬腸液(pH8.0)中可存活8 h,且存活率可達到90%以上,這與Haarman[21]等研究結果一致,乳桿菌在腸液中的存活率較高,故其是人體腸道中的主要益生菌群。

圖2 鼠李糖乳桿菌在模擬腸液(pH8.0)中的存活率Fig.2 Survival rate of L. rhamnosus to simulated intestinal juice(pH8.0)

2.3 鼠李糖乳桿菌對膽鹽的耐受性

人體腸道中膽鹽的含量大約為0.3%,乳酸菌經攝入后,先后經過人體的胃和小腸,最終才能定殖。目前,菌株對于膽鹽的耐受能力已經成為評價菌株是否能夠在腸道中生存與定殖的一個重要條件[22]。表1中所示,本實驗中的鼠李糖乳桿菌對于膽鹽的延遲時間為0.86 h,說明此菌株對膽鹽具有很好的耐受性。

表1 膽鹽對鼠李糖乳桿菌生長的作用Table 1 Effect of bile salts on the growth rate of L. rhamnosus

2.4 鼠李糖乳桿菌對Caco-2細胞的粘附能力

為了調節腸道菌群,發揮益生作用,乳酸菌必須能夠在胃腸道中良好定殖,粘附是乳酸菌與宿主細胞相互作用的第一步[23]。因此,菌株的粘附能力是評價其是否能夠成為優良菌株的一個必要條件。Caco-2細胞是一種人克隆結腸腺癌細胞,結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞,可以較好的模擬人體腸道中的環境。

圖3中可看出,鼠李糖乳桿菌菌體形態完整,并且對Caco-2細胞具有一定的粘附能力,依據實驗統計結果表明粘附率為10 個/cell。由此推測,鼠李糖乳桿菌在人體腸道中應具有較好的定殖能力。李清[24]等研究表明菌株對Caco-2細胞的粘附能力與其表面蛋白類物質及其他大分子物質有關。

圖3 鼠李糖乳桿菌對Caco-2細胞的粘附形態(×400)Fig.3 The morphology of adherent of L. rhamnosus to Caco-2 cells(×400)

2.5 鼠李糖乳桿菌對NaCl的耐受性

鼠李糖乳桿菌對NaCl具有較強的耐受能力,其在NaCl濃度為9%時仍然可以生長。如圖4所示,當NaCl濃度超過4%后,菌株的生長能力急劇下降。

圖4 不同NaCl濃度下鼠李糖乳桿菌生長情況Fig.4 The growths of L. rhamnosus in different levels of sodium chloride

2.6 鼠李糖乳桿菌在不同接種量下的生長情況

圖5 不同接種量對鼠李糖乳桿菌生長的影響Fig.5 The growth effect of the L. rhamnosus in different inoculums densities

不同接種量下菌株的生長情況見圖5。隨著接種量的增加鼠李糖乳桿菌的OD值呈上升趨勢,相應的pH呈下降趨勢。綜合考慮,菌株培養時可選取的最適接種量在1%～2%之間,培養液的pH在4.4左右。

2.7 鼠李糖乳桿菌在不同pH下的生長情況

鼠李糖乳桿菌在不同pH中的生長情況見圖6,結果表明菌株生長的最適pH為5～7。該菌株在pH2的低酸環境中依然可以生長,說明其有較好的耐酸性,這與本文之前耐受人工胃液的結果一致。

圖6 不同pH對鼠李糖乳桿菌生長的影響Fig.6 The growth effect of the L. rhamnosus in different pH

2.8 鼠李糖乳桿菌在不同溫度下的生長情況

鼠李糖乳桿菌在不同溫度中的生長情況見圖7,結果表明菌株在溫度為22～42 ℃范圍內均可以生長,pH隨著菌液OD值的變化而有相應的變化。綜合考慮,此菌株的最適培養溫度為37 ℃,培養液的pH在4.4左右。

圖7 不同溫度對鼠李糖乳桿菌生長的影響Fig.7 The growth effect of the L. rhamnosus in different temperature

2.9 鼠李糖乳桿菌的生長曲線

鼠李糖乳桿菌的生長曲線見圖8,結果表明此菌株的生長周期較短,培養2 h后即進入對數生長期,14 h后進入穩定期。

圖8 菌液OD值隨培養時間變化曲線Fig.8 The changes of bacteria liquid OD value with culture time

3 結論

目前,全球的糖尿病發病率和患者總數都呈逐年增加的趨勢,而傳統降糖藥物的使用會引發一系列的副作用,因此人們逐漸將目光投入到更安全的天然食品,以尋求理想的降糖保健食品。國內外的研究表明乳酸菌通過調節宿主腸道菌群達到降糖的作用,篩選具有降糖作用的乳酸菌是一個非常有意義的課題。本研究對一株具有潛在的降糖作用的鼠李糖乳桿菌生物學特性進行了研究。結果表明該菌株在強酸條件下可以生長,對人工胃腸液都具有很好的耐受性,耐受膽鹽的延遲時間為0.86 h,在高濃度的NaCl(9%,W/V)溶液中仍可以存活,并且該菌株對Caco-2細胞具有較強的粘附能力。故該菌株可以作為潛在降糖的益生菌,未來可進一步研究開發出具有降糖作用的新型發酵產品。

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Biological characteristics ofLactobacillusrhamnosuswith antidiabetic activity

CHEN Pei1,2,DANG Hui3,4,WANG Wei1,CHEN Wei3,*

(1.Shaanxi Radio & TV University,Xi’an 710119,China;2.Shaanxi University of Technology,School of Biological Science and Engineering,Hanzhong 723001,China;3.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;4. College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China)

ToinvestigatethebiologicalcharacteristicsofaLactobacillus rhamnosusstrainwithanti-diabeticactivity.TheresultsshowedthatthelogarithmictimeofthisLactobacillus rhamnosusstrainwasfrom2thhourto14thhour.TheoptimumpHandtemperatureforitsgrowthwas5～7and37 ℃,respectively,anditsoptimuminoculatedconcentrationwas1%～2%(V/V).Besides,thisstraincouldgrowunderstronglyacidicconditions,andsurviveinthesimulatedgastro-intestinaljuice.Thebiletoleranceofthisstrainintheformoflagtimewas0.86h,anditcouldgrowunder9%NaCl(W/V)conditions.Moreimportantly,itpossessedstrongadhesivepropertiestoCaco-2cells.Insummary,thisLactobacillus rhamnosusstrainwithantidiabeticactivitycouldbeappliedtodevelopnovelfermentedfoodproductswithhypoglycemiceffect.

antidiabetic;Lactobacillus rhamnosus;biologicalcharacteristics

2016-01-14

陳佩(1983-)，女，博士，講師，研究方向：食品微生物,E-mail:angelchen186@163.com。

*通訊作者:陳衛(1966-)，男，博士，教授，研究方向：功能性益生乳酸茵的開發及其在乳制品中的應用，E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn。

陜西省農業科技創新與攻關項目(2015NY025);陜西廣播電視大學重點課題(15D-08-A02)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)21-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.023