甘肅天祝農牧區燕麥田孢囊線蟲調查及種類鑒定

李健榮，趙 鵬，徐鵬剛，堅晉卓，彭德良，李惠霞

(1.甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心,甘肅蘭州 730070;2.中國農科院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

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甘肅天祝農牧區燕麥田孢囊線蟲調查及種類鑒定

李健榮1，趙 鵬1，徐鵬剛1，堅晉卓1，彭德良2，李惠霞1

(1.甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心,甘肅蘭州 730070;2.中國農科院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

為了明確甘肅天祝農牧區燕麥田孢囊線蟲的發生情況及種類，2014年8-9月，采用Z字型取樣法，對天祝燕麥主要種植區進行了調查。結果表明，采集到的80份燕麥根際土樣中孢囊線蟲發生率為44%，孢囊密度為4.3個·100 g-1土樣。安遠鎮的發生率最高，為54.2%，華藏寺的發生率最低，為14.3%。孢囊淺褐色，闊檸檬形，長571 μm(447～727 μm)，寬449 μm(375～595 μm)。陰門雙膜孔，膜孔長31 μm(28～33 μm)，膜孔寬16 μm(13～20 μm )，陰門裂長9 μm(8～11 μm )，泡狀突明顯，未見陰門下橋。天祝5個鄉鎮孢囊線蟲rDNA-ITS區片段長度均為1 045 bp，經Blast比對發現，所測序列與燕麥孢囊線蟲(Heteroderaavenae)的ITS序列相似度達99%～100%。系統進化關系分析顯示，天祝孢囊線蟲與國內及國外燕麥孢囊線蟲在同一個大的進化分支，與中國的燕麥孢囊線蟲在同一個小的分支。因此，形態特征結合rDNA-ITS序列分析將甘肅天祝燕麥田的孢囊線蟲鑒定為燕麥孢囊線蟲。

天祝；農牧區；燕麥；孢囊線蟲

禾谷孢囊線蟲(Cereal cyst nematode，簡稱CCN)是危害禾谷類作物的病原線蟲，是一個復合種群，包含12個有效種，其中廣泛分布且有經濟意義的有燕麥孢囊線蟲(Heteroderaavenae)、菲利普孢囊線蟲(H.filipijevi)和麥類孢囊線蟲(H.latipons)[1]。其中燕麥孢囊線蟲的危害最嚴重、分布最廣泛。1924年，禾谷孢囊線蟲在德國阿切斯萊本的燕麥上被發現[2]，目前在亞洲、歐洲、美洲和澳洲40多個國家均有危害[3]。在沙特阿拉伯，該線蟲造成40%～92%的小麥減產；在巴基斯坦，該線蟲造成小麥產量損失15%～20%；在澳大利亞，該線蟲造成23%～50%的小麥減產[4]。我國首次于1989年在湖北天門發現禾谷孢囊線蟲病以來，相繼在山西、江蘇、天津、河南、山東、陜西、河北、北京、寧夏、安徽、青海、甘肅、內蒙古、新疆和西藏等15個省(市、區)相繼發現[5-10]，給我國糧食安全帶來了極大的威脅。在我國，燕麥孢囊線蟲可造成20%～30%的小麥減產，嚴重時更造成50%以上的產量損失[11]。楊傳廣等[12]報道，燕麥孢囊線蟲可使小麥株穗數減少13.8%，鮮重降低14.5%，最終導致小麥減產。

彭德良等[13]于2007年首次在甘肅省發現燕麥孢囊線蟲病。李惠霞等[14]在甘肅省小麥和大麥主產區均發現燕麥孢囊線蟲病。葉文興等[15]對甘肅省孢囊線蟲rDNA-ITS和28SrDNA-D2/D3區序列特征及ITS-RFLP分析，認為危害甘肅小麥的是燕麥孢囊線蟲。柳永娥[16]通過rDNA-ITS區序列特征分析，確定甘肅省孢囊線蟲為燕麥孢囊線蟲。燕麥孢囊線蟲的寄主范圍十分廣泛，包括小麥、青稞、燕麥、野燕麥、大麥、黑麥草、鵝冠草、葦狀羊茅、鴨茅等禾本科植物[17]。李惠霞等[18]發現危害天祝高寒草原牧草的孢囊線蟲是燕麥孢囊線蟲。燕麥作為天祝農牧交錯帶十分重要的牧草飼料，其是否也受到孢囊線蟲的危害以及受到何種孢囊線蟲的危害尚不明確。因此，本研究通過對甘肅天祝主要農牧區燕麥田取樣調查，利用形態學特征結合核糖體DNA-ITS序列分析鑒定線蟲種類，旨在了解該地區燕麥田孢囊線蟲病的分布情況及病原的種類，為燕麥線蟲病害的及時控制和進一步研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 土樣的采集

于2014年8-9月燕麥揚花至灌漿期，在天祝縣華藏寺鎮、打柴溝鎮、安遠鎮、石門鎮、抓喜秀龍鄉等五個鄉鎮20個村，采用Z字形取樣法采集土樣80份，每塊地采集20～30個點，裝入塑料袋作為1份樣品。用GPS定位系統記錄當地經緯度、海拔并記錄地名，寫好標簽，帶回實驗室備用。采樣信息詳見表1。

1.2 孢囊的分離與計數

采用簡易漂浮分離法[19]，將土樣混勻后取100 g置于塑料桶中，加水攪拌，使土塊完全溶解，靜置2～3 min后，將懸浮液傾入26目和65目的套篩中，重復沖洗3次。然后小水沖洗，使大雜物留在26目篩上，而孢囊和小雜物留在65目篩上。棄去26目篩上的雜物，將65目篩上的混合物輕輕搓洗，直至洗去土壤顆粒。用洗瓶將孢囊混合物沖至100目的紗布上，置于濾紙上。在解剖鏡下計數。每個樣點隨機取5個飽滿孢囊，擠破檢測孢囊卵粒數。

1.3 孢囊線蟲形態學鑒定

每個樣點隨機挑取20個飽滿孢囊，測量孢囊、卵的長、寬和二齡幼蟲的體值。取部分飽滿孢囊切取陰門錐，制成玻片后，在顯微鏡下直接觀察，對孢囊線蟲種類進行初步鑒定。陰門錐標本的制作參照馮志新[20]的方法，在光學顯微鏡下觀察其形態特征、拍照、測量和鑒定。二齡幼蟲標本的制作依據謝 輝[21]的方法，將盛有二齡幼蟲懸浮液的試管放入65 ℃的水浴鍋中加熱2 min，用FAA(福爾馬林-冰醋酸-乙醇固定液)固定。以水做浮載劑，將固定好的線蟲挑入，蓋上蓋玻片，在光學顯微鏡下觀察、拍照、測量和鑒定。

1.4 孢囊線蟲的分子鑒定

1.4.1 孢囊線蟲DNA的提取

參考彭德良等[22]的方法，挑取單個飽滿的孢囊置于Eppendorf管中，加入10 μL滅菌重蒸水、3 μL蛋白酶K(600 μg·ml-1)、7 μL的10×PCR-buffer(含Mg2+)。放入盛有液氮的雙層保溫桶速凍1 min，取出后用玻璃棒研磨1～2 min后，置于-20 ℃冷凍至少2 h。將Eppendorf管置于65 ℃下溫育1.5 h，95 ℃ 10 min，4 ℃至少5 min，最后-20 ℃保存備用。

1.4.2 孢囊rDNA-ITS的PCR擴增、電泳及測序分析

PCR反應采用50 μL體系，線蟲通用引物AB28(F：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′)與TW81(R：5′-GTTTCCGTAGGTGAAC CTGC-3′)各1 μL、10×PCR-buffer(含Mg2+)5 μL、dNTPs 4 μL、ExTaqDNA Polymerase 1 μL，模板3 μL、ddH2O補足到50 μL，同時設置陰性對照。PCR擴增反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min， 35個循環，2 ℃ 10 min，4 ℃ 5 min，最后-20 ℃保存。取5 μL擴增產物加1 μL 6×Loading buffer在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，120 V電泳30～40 min，Gelview染色；在BIO-RAD成像儀紫外光燈下觀測并照相。將所得到的有效擴增產物送至上海生工進行雙向測序，所得序列經DNAMAN6.0、Chromas分析比對，提交NCBI并下載已知近親緣種序列，在GenBank注冊，用MEGA 5.2中的UPGMA法構建孢囊線蟲群體的系統發育樹，進行親緣關系分析。

表1 天祝縣五個鄉鎮燕麥田孢囊線蟲發生及分布情況

2 結果與分析

2.1 孢囊線蟲的發生分布

由表1可知，80份土樣中，35份有孢囊檢出，發生率為44%，其中抓喜秀龍鄉和安遠鎮的發生率最高，分別達到了48.4%和54.2%；華藏寺鎮的最低，為14.3%。平均孢囊數為4.3個·100 g-1土樣，其中空、實孢囊數相近，平均為2和2.3個·100 g-1土樣。孢囊的平均卵量為215粒，其中石門鎮的最高，為250粒；華藏寺鎮的最低，為175粒。由此可見，燕麥田孢囊線蟲在甘肅天祝普遍發生，部分鄉鎮發生嚴重。

2.2 孢囊線蟲的形態特征

2.2.1 孢囊的形態特征

孢囊闊檸檬型，黃褐色至暗褐色，頸部明顯(圖1)。由表2可知，孢囊的體長為571 μm(447～727 μm)，體寬為449 μm(375～595 μm)，陰門錐為雙膜孔型，無下橋，泡狀突明顯。膜孔長31 μm(28～33 μm)，寬16 μm(13～20 μm)，陰門裂長9 μm(8～11 μm)。

2.2.2 二齡幼蟲及卵粒的形態特征

由表3可知，本試驗分離的二齡幼蟲線形，體長為538 μm(412～604 μm) ，體寬為 25 μm(22～27 μm)；唇區圓，與身體連接處縊縮明顯，口針粗壯(圖1)，長為22 μm(18～26 μm)；尾部呈錐形，長49 μm(39～69 μm)；有較長的透明區，長31 μm(23～48 μm)；卵呈橢圓型，長121 μm(100～136 μm) ，寬48 μm(41～54 μm)。根據孢囊陰門錐特征及測量值和二齡幼蟲的特征及測量值，并與王明祖[23]、陳品三等[24]、Mulvey[25]及Williams等[26]報道的數據相比較，初步將天祝燕麥田采集到的孢囊線蟲鑒定為燕麥孢囊線蟲(H.avenae)。

2.3 孢囊線蟲的分子鑒定結果

每個鄉鎮各選取2個孢囊，依次編號為HZ1、HZ2、SH1、SH2、DC1、DC2、ZH1、ZH2、 AN1、AN2。進行rDNA-ITS區PCR擴增，均得到長約為1 000 bp的條帶，陰性對照無該條帶(圖2)。將PCR產物經回收、純化、克隆和測序，得到長度為1 045 bp的ITS序列，將序列提交GenBank并與NBCI下載的ITS序列進行Blast比對，已知序列分別包括Avenae組的有中國(AY148382)、法國(AY148374)、德國(AY148360)、以色列(AY148366)、印度(AF274397)的H.avenae、德國的H.Mani(AY148377)、美國的H.filipjevi(GU079654)、英國的H.arenaria(AF274396)；Schachtii組的有伊朗的H.glycines(AF498387)、比利時的H.schachtii(AY166438)；Goettingiana組的有荷蘭的H.cruciferae(AF274411)、意大利的H.carotae(AY347917)、比利時的H.urticae(AF274412)。用MEGA 5.2的UPGMA方法構建ITS區的系統發育樹。

聚類分析結果(圖3)表明，所有的序列聚為3個大的分支，其中天祝五鄉鎮的10個禾谷孢囊線蟲種群與上述Avenae組的5個群體聚為一個大的分支，Schachtii組的聚為一分支，其置信度為100%；Goettingiana組3個群為一支。在Avenae組的分支中，天祝線蟲群體與中國的燕麥孢囊線蟲群體聚為一個小的分支，其置信度為98%，其他國家的H.avenae聚在另外一個小的分支中。因此，進一步將天祝燕麥田孢囊線蟲鑒定為燕麥孢囊線蟲(H.avenae)。

A:淺褐色胞囊；B:受精卵；C卵和二齡幼蟲；D、E、F:陰門膜孔和泡狀突；G:二齡幼蟲頭部；H:二齡幼蟲尾部；I:二齡幼蟲。

A:Cyst; B:Eggs;C:Eggs and second-stage juvenile;D,E,F:Fenestra area and Ballae;G:Head of second-stage juvenile;H:tail of second-stage juvenile; I:second-stage juvenile.

圖1 天祝燕麥田孢囊線蟲的形態特征

Fig.1 Illustration of cyst nematode in oat field from part populations in Tianzhu

表2 燕麥田孢囊線蟲的孢囊、陰門錐的形態測量值

表3 燕麥田孢囊線蟲的二齡幼蟲、受精卵的形態測量值

M:Maker(DL2000)；N：陰性對照；1～10：華藏寺鎮1、華藏寺鎮2、石門鎮1、石門鎮2、打柴溝鎮1、打柴溝鎮2、抓喜秀龍鄉1、抓喜秀龍鄉2、安遠鎮1、安遠鎮2。

M:Marker(DL2000)；N：Negative control;1-10:HZ1,HZ2,SH1,SH2,DC1,DC2,ZH1,ZH2,AN1,AN2.

圖2 甘肅天祝農牧區燕麥田孢囊線蟲群體rDNA-ITS序列PCR擴增產物

Fig.2 PCR products of rDNA-ITS sequence of cyst nematodes from agricultural and pastoral oat field at Tianzhu of Gansu province

3 討 論

孢囊線蟲病擴散迅速，在我國的分布逐年擴大，嚴重影響我國糧食產量。甘肅天祝是農牧業的交錯混合區域，具有生態多樣性和復雜性，燕麥種植面積大，這為孢囊線蟲的擴散[27]提供了有利的條件。本研究所調查的天祝5個燕麥主要種植區在不同程度上均有孢囊線蟲的發生，其中平均孢囊檢出量為4.3個·100 g-1土樣，且平均卵量為8.6粒·g-1土樣。李秀花等[28]報道孢囊線蟲的經濟閾值為5個卵·克-1土樣，天祝燕麥田孢囊線蟲蟲源基數超過了這個經濟閾值，這勢必對天祝農牧區燕麥產量造成嚴重的影響。孢囊線蟲病在天祝發生普遍，可能與該區域燕麥多年連作有關系，李秀花等[29]研究表明燕麥連作后燕麥孢囊線蟲的發生呈上升趨勢，休閑或輪作一年以上可有效減低土壤中燕麥孢囊線蟲的蟲口密度。張東升等[30]報道燕麥孢囊線蟲適宜低溫高濕的環境，具高溫滯育的現象。而天祝常年的氣溫較低，環境陰濕，土壤富含腐殖質，這非常有利于燕麥孢囊線蟲的發生。因此，筆者建議在孢囊線蟲密度高于經濟閾值的地塊，依據環境條件、農事操作和品種抗性等因素采取適宜的防治措施。

H.avenae:燕麥孢囊線蟲；H.mani:稀少孢囊線蟲；H.arenaria:蚤綴孢囊線蟲；H.Filipjevi:菲利普孢囊線蟲；H.glycines:大豆孢囊線蟲；H.schachtii:甜菜孢囊線蟲；H.urticae:蕁麻孢囊線蟲；H.carotae:胡蘿卜孢囊線蟲；H.cruciferae:十字花科孢囊線蟲。橫線上數字為置信度(Numbers on the line indicate degree of confidence)。

圖3 UPGMA法構建的甘肅天祝農牧區燕麥田孢囊線蟲群體及其近緣種的ITS序列系統進化樹

Fig.3 Phylogenetic tree of close related species and the tested populations in agricultural and pastoral oats field of the Tianzhu，Gansu province based on rDNA-ITS sequence using UPGMA method

目前，孢囊線蟲種類的鑒定主要采用形態和分子相結合鑒定的方法。形態鑒定特征主要有孢囊長寬、色澤、形狀，陰門錐形狀、膜孔長寬、陰門裂、下橋有無等，二齡幼蟲形態的觀察及相關形態特征值的測定。通過形態測量值與參考標準的對比可以初步確定到屬，但是單個個體經常不能鑒定到種的水平。本研究對采集自甘肅天祝農牧區燕麥田的孢囊進行形態觀察，天祝群體均與燕麥孢囊線蟲群體相同，陰門錐無下橋，形態測量值和王明祖[23]、陳品三等[24]、Mulveys[25]、Williams等[26]報道的測量值相比較，部分測量值略微偏小。測量值的偏差可能是寄主種類、地域差異及一些環境因子造成的[31]。以孢囊線蟲rDNA-ITS區序列構建系統發育樹顯示，天祝燕麥田孢囊線蟲群體均與燕麥孢囊線蟲群體在一個大的分支上，且與中國的燕麥孢囊線蟲群體處在進化樹的同一支。燕麥孢囊線蟲國內和國外群體分別處在不同的進化支上，說明燕麥孢囊線蟲在中國群體內具有更高的親緣關系，這與王 瑄等[32]對江蘇群體分子特征分析所得到的結論一致。系統發育樹中，中國的燕麥孢囊線蟲與印度的、德國的、英國的及美國的燕麥孢囊線蟲處于不同的分支，說明中國群體與印度群體和歐洲群體有差異性，這與Zheng等[33]對山西太谷群體的分子特征研究結果相一致。與傳統的形態鑒定相比，分子生物學鑒定更快捷、簡單，但有研究表明燕麥孢囊線蟲rDNA-ITS區有異質性，不同群體間ITS序列存在變異[34]，因此形態學鑒定對于植物線蟲的鑒定不可替代，分子鑒定可作為輔助工具，提高鑒定的準確度。

本次調查只是針對天祝主要農牧區，而對于其他不同區域和不同作物是否有孢囊線蟲的侵染，不同線蟲群體之間有沒有致病性的差異還需做進一步研究。

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Investigation and Identification of Cyst Nematode in Agricultural and Pastoral Oats Fields in Tianzhu of Gansu Province

LI Jianrong1,ZHAO Peng1,XU Penggang1,JIAN Jinzhuo1,PENG Deliang2,LI Huixia1

(1.College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University/Key Laboratory of Grassland Ecosystem,Ministry of Education/Sino-U.S. Centers for Grazing Land Ecosystem Sustainability,Lanzhou,Gansu 730070,China;2.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pest/Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)

In order to define the occurrence and distribution of oat cyst nematode in agricultural and pastoral areas of Tianzhu of Gansu,investigations were carried out from August to September in 2014,based on methods of Z type. The results showed that the incidence of cyst nematode was 44% in the 80 soil samples with 4.3 cysts per 100 g soil sample. The highest incidence of cyst nematodes was 54.2%,appearing in Anyuan town. The lowest incidence of cyst was 14.3%,appearing in Huazansi town. The cysts were light brown and large lemon-shaped,with the average length of 571 μm(447-727 μm) and average width of 449 μm(375-595 μm). The vulva cones were double Fenestra area,with the length of 31 μm(28-33 μm) and the width of 16 μm(13-20 μm),and the length of vulval slit was 9 μm(8-11 μm). There was obvious bullaeno without under-bridge in vulva. The fragments of rDNA-ITS from five counties in Tianzhu were all 1 045 bp length. The similarities between these groups andHeteroderaavenaewere 99%-100% by alignment blasting on Gene Bank.The phylogenetic tree revealed that the Tianzhu populations were grouped with domestic and abroad populations ofH.avenaeinto a branch and Tianzhu populations were grouped with China populations ofH.avenae. Thus,the nematodes collected from oats in Tianzhu were identified asH.avenae.

Tianzhu; Pastoral areas; Oat; Cyst nematode

時間：2016-07-07

2016-02-28

2016-03-08

國家公益性行業(農業)科研專項(201503114)；國家自然科學基金項目(31460463)

E-mail：1072285812@qq.com

李惠霞(E-mail:lihx@gsau.edu.cn)

S512.6；S433

A

1009-1041(2016)07-0961-08

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160707.1531.038.html