高效液相色譜概況及其在水質(zhì)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

葉 南 劉 飛

(長(zhǎng)江委水文局長(zhǎng)江下游水環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 南京 210011)

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高效液相色譜概況及其在水質(zhì)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

葉 南 劉 飛

(長(zhǎng)江委水文局長(zhǎng)江下游水環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 南京 210011)

介紹了高效液相色譜的方法，原理及其在水質(zhì)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用，通過甲萘威重復(fù)性測(cè)試、平行性測(cè)試以及質(zhì)控樣測(cè)試，經(jīng)過精密度偏性驗(yàn)證后得出高效液相色譜儀的精密度和準(zhǔn)確度符合規(guī)范要求，可應(yīng)用于水質(zhì)監(jiān)測(cè)分析。

水質(zhì)監(jiān)測(cè)；高效液相色譜儀；測(cè)試監(jiān)測(cè)分析

1 液相色譜基本原理及其特點(diǎn)

1.1 液相色譜理論的發(fā)展

色譜法最早是由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特(Tswett)在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。

液相色譜法開始階段是在室溫和常壓下通過大直徑的玻璃管柱用液位差輸送流動(dòng)相，稱為經(jīng)典液相色譜法，該方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)(常有幾個(gè)小時(shí))、高效。

液相色譜法(LC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于20世紀(jì)60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜法(HPLC)。同時(shí)，因分析速度快而被稱為高速液相色譜法(HSLP)，還稱現(xiàn)代液相色譜。

1.2 高效液相色譜基本原理

HPLC又稱高效液相色譜法，是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜,基于儀器方法的高效能分離手段。20世紀(jì)70年代開始，廣泛應(yīng)用于化工、食品、飲料，生物技術(shù)、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域。

HPLC的分離原理就是利用待分離的各種物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)、吸附能力等親和能力的不同來進(jìn)行分離。HPLC主要由進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成。HPLC技術(shù)的發(fā)展趨向于高速化、高效化、自動(dòng)化、智能化等。HPLC分離度可用下式表示：

(1)

式中，tr2,tr1為保留時(shí)間；W2,W1為組分峰底寬。當(dāng)R=0.75時(shí)，兩峰不能分離；當(dāng)R=1.0時(shí)，達(dá)到一般定量分析要求，每峰純度達(dá)到96%；當(dāng)R=1.5時(shí)，兩峰完全分離。

通過色譜學(xué)的基本理論——塔板理論可知，這些塔板實(shí)際是不存在的，只是一種假設(shè)，用來幫助描述色譜柱里所發(fā)生的一切。在這些塔板里面，固定相和流動(dòng)相之間存在著一種平衡分析物。這種平衡里存在一種平衡系數(shù)K，定義K=C固定相/C流動(dòng)相。K值越大，分析物流出時(shí)間就越長(zhǎng)，即分析物在色譜柱中的保留時(shí)間就越長(zhǎng)。

理論塔板數(shù)(N)用來衡量色譜柱質(zhì)量好壞。理論塔板數(shù)越高，柱效越高；理論塔板高度(H)越大，柱效越低。高柱效色譜柱比低柱效色譜柱在同一保留時(shí)間峰更窄，理論塔板數(shù)越高，柱效越高。

有效塔板數(shù)可用下式表示：

(2)

有效板高可用下式表示：

(3)

不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)。

1.3 高效液相色譜的結(jié)構(gòu)

高效液相色譜儀器的基本結(jié)構(gòu)包括泵(含脫氣機(jī))、自動(dòng)進(jìn)樣器、色譜柱(放于柱溫箱中)、檢測(cè)器、系統(tǒng)控制軟件(電腦)，如圖1所示。

圖1 高效液相色譜儀器的基本結(jié)構(gòu)

1.4 技術(shù)指標(biāo)及主要特點(diǎn)

高效液相色譜技術(shù)指標(biāo)主要有：①檢測(cè)器參數(shù)(紫外檢測(cè)波長(zhǎng)，靈敏度)；②固定相(色譜柱及內(nèi)徑、長(zhǎng)短)；③流動(dòng)相(種類及配比，等度或梯度)；④流動(dòng)相輸送系統(tǒng)參數(shù)(流速)；⑤溫度控制；⑥進(jìn)樣量等。

高效液相色譜主要特點(diǎn)為，可對(duì)世界上80%左右的有機(jī)化合物進(jìn)行分離和分析，特別適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物以及生物活性物質(zhì)的分離和分析，且可做制備，不同的分析對(duì)象選擇不同的色譜柱，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、生命科學(xué)、化工和環(huán)保等領(lǐng)域。

2 檢測(cè)方法

HPLC檢測(cè)器可以分為溶質(zhì)性質(zhì)檢測(cè)器(選擇型)和整體性質(zhì)檢測(cè)器(通用型)。選擇型是對(duì)溶質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)，一般不反映流動(dòng)相的變化。通用型是不管是否有溶質(zhì)，對(duì)流動(dòng)相任何物理性質(zhì)的變化均能作出響應(yīng)。

HPLC檢測(cè)器選擇依據(jù)主要包括：①靈敏度(信號(hào)與噪音的比值，即峰高與基線噪音的比值(S/N)檢測(cè)線(LOD)∶S/N=3 定量限(LOQ)∶S/N=10，好的信噪比有利于更好的色譜峰確認(rèn)，更好定量，更好地完成色譜峰純度/均一性)；②分離的化合物/樣品的化學(xué)特性(化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量及紫外光譜等)；③流動(dòng)相的影響(溶劑、緩沖鹽改性劑等)；④梯度還是等度；⑤靈敏度需求；⑥采樣頻率；⑦是否有雙檢測(cè)的需求。HPLC檢測(cè)器的原理及優(yōu)缺點(diǎn)見表1。

表1 HPLC檢測(cè)器的原理及優(yōu)缺點(diǎn)

3 在水質(zhì)監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

3.1 比測(cè)方案確定

選定濃度為100 μg/mL 甲萘威標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(分別取50，100，150，200，250，500 μl稀釋到1 000 μl；配制 0.0，5.0,10.0,15.0,20.0,25.0，50 μg/mL)；選取規(guī)格Thermo C184.6 mm×250 mm色譜柱；選擇甲醇：水=(3+2)為流動(dòng)相；設(shè)定流動(dòng)相流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；柱溫為35 ℃；選取重蒸餾水為空白試樣；以江西省九江市湖口水文站斷面的水作為天然水樣，并對(duì)天然水樣做雙加標(biāo)處理，具體做法是分別加入100 μl和200 μL甲醇中甲萘威標(biāo)準(zhǔn)溶液,并用天然水稀釋到1 000 μl。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品檢驗(yàn)

選用水利部水環(huán)境監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)研究中心GBW(E)082072的甲醇中甲萘威(西維因)，批號(hào)為20140129，其標(biāo)準(zhǔn)值為101 μg/mL，不確定度為±5%，依據(jù)《高壓液相色譜法-紫外檢測(cè)器》(GB/T5750.9—2006)標(biāo)準(zhǔn)分析方法，對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋了10倍進(jìn)行了測(cè)試，12次測(cè)試結(jié)果的誤差均在不確定度±5%的范圍內(nèi)。可見儀器的準(zhǔn)確度很高，滿足相關(guān)要求，結(jié)果詳見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)樣品檢驗(yàn)測(cè)試結(jié)果

注：標(biāo)準(zhǔn)值為101，不確定度為5%。

3.3 重復(fù)性測(cè)試

使用上述標(biāo)準(zhǔn)樣品重復(fù)測(cè)試12次，測(cè)試甲萘威，絕對(duì)偏差范圍在-2.27 μg/mL～2.19 μg/mL之間；相對(duì)偏差圍在-2.25%～2.17%之間，平均偏差為-0.05，相對(duì)平均偏差為-0.04%；標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.18，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.16%。由此可見，儀器的重復(fù)性很好，滿足相關(guān)要求，詳見表3。

3.4 平行性測(cè)試

仍然選取甲萘威，將湖口水樣品，等分成10份，對(duì)每份樣逐一測(cè)試，絕對(duì)偏差、相對(duì)偏差、相對(duì)平均偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均為零，可見儀器的平行性很好，滿足相關(guān)要求。

4 質(zhì)量控制

4.1 質(zhì)量控制基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)

4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及線性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)系列應(yīng)在線性范圍內(nèi)選取至少6個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，扣除空白值后，以響應(yīng)值的數(shù)據(jù)為縱坐標(biāo)，濃度值為橫坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線，見圖2，并計(jì)算下列參數(shù)。

表3 重復(fù)性測(cè)試成果及其標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖2 甲萘威的標(biāo)準(zhǔn)曲線

(1) 相關(guān)系數(shù)γ為 0.999 7，滿足γ≥0.999的規(guī)范要求。

(2) 列出回歸方程y=a+bx，對(duì)截距a進(jìn)行t檢驗(yàn)，要求截距與零無顯著性差異，否則找原因重做。檢測(cè)結(jié)果t=0.003<2.776，說明截距與零無顯著性差異。

4.1.2 準(zhǔn)確度(回收試驗(yàn))

進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率P%，經(jīng)計(jì)算回收率的平均值為104.4%，滿足規(guī)范要求。標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)數(shù)據(jù)，湖口斷面天然水樣雙加標(biāo)樣品試驗(yàn)數(shù)據(jù)以及質(zhì)控樣品試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4。

4.1.3 精密度偏性分析質(zhì)量控制試驗(yàn)

用標(biāo)準(zhǔn)水樣、天然水樣及加標(biāo)天然水樣，以隨機(jī)次序每天一批，每次2份，高壓液相色譜法-紫外檢測(cè)器共6批[5]。計(jì)算批內(nèi)變異MS批內(nèi)、批間變異MS批間和批內(nèi)、批間變異分析等參數(shù)，并將結(jié)果填入表5。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

表5 精密度偏性檢驗(yàn)

總標(biāo)準(zhǔn)差小于被測(cè)濃度的5%可以接受，當(dāng)5%濃度低于方法給定的檢測(cè)限時(shí)，即用檢測(cè)限作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。

通過加標(biāo)回收試驗(yàn)可得出以下結(jié)論，即加標(biāo)回收率檢驗(yàn)和分析批內(nèi)批間變異，檢驗(yàn)總標(biāo)準(zhǔn)差等2種檢驗(yàn)均合格，滿足規(guī)范要求。

5 結(jié) 語

通過對(duì)高效液相色譜儀的學(xué)習(xí)、研究、比測(cè)和考核，可得出以下主要認(rèn)識(shí)和結(jié)論：

(1) 高效液相色譜是一項(xiàng)非常成熟的現(xiàn)代化分析方法；

(2) 通過實(shí)驗(yàn)證明，儀器滿足水質(zhì)監(jiān)測(cè)分析所要求精密度和準(zhǔn)確度；

(3) 方法檢出限適合長(zhǎng)江水質(zhì)分析的需求；

(4) 彌補(bǔ)和提高了實(shí)驗(yàn)室對(duì)于有機(jī)化合物分析的不足。

綜上所述，該儀器及方法均滿足相關(guān)規(guī)范技術(shù)要求，可以投入生產(chǎn)應(yīng)用。

[1] 張華，王英鋒，施燕支.高效液相色譜及聯(lián)用技術(shù)在砷形態(tài)分析中的應(yīng)用[J].光譜學(xué)與光譜分析，2007,27(2)：386-390.

[2] 任晉，黃翠玲，趙國(guó)棟.固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用機(jī)在線分析水中痕量除草劑[J]. 分析化學(xué)，2001,29(8)：876-880.

[3] 曹磊，趙潔麗.超高效液相色譜(UPLCTM)的優(yōu)點(diǎn)及其在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[J]. 環(huán)境科學(xué)與管理，2009,34(9)：124-127.

[4] 張麗娟，陳縣發(fā)，糜松元，等.UltiMate3000DGLC培訓(xùn)教材[R].上海：賽默飛世爾公司，2012.

[5] 中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站，環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測(cè)質(zhì)量保證手冊(cè)(第二版)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.

(編輯：唐湘茜)

2016-09-15

葉南，男，長(zhǎng)江委水文局長(zhǎng)江下游水環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，工程師.

1006-0081(2016)11-0051-04

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