牛膝各拆分組分的抗炎活性研究

楊柳，顏美玲，吳麗紅，姜海，舒尊鵬，楊大宇，楊炳友，王秋紅，匡海學

(黑龍江中醫藥大學北藥基礎與應用研究省部共建教育部重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

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牛膝各拆分組分的抗炎活性研究

楊柳，顏美玲，吳麗紅，姜海，舒尊鵬，楊大宇，楊炳友，王秋紅，匡海學*

(黑龍江中醫藥大學北藥基礎與應用研究省部共建教育部重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：研究牛膝各拆分組分的抗炎活性。方法：建立醋酸所致小鼠腹腔炎癥滲出模型和角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹模型，考察牛膝各拆分組分的抗炎活性。結果：在醋酸所致小鼠腹腔炎癥滲出模型中，牛膝甾酮組分高劑量組和牛膝皂苷組分高、中、低三個劑量組均有不同程度抑制醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增加的作用，其中皂苷組分三個劑量組的抑制作用呈劑量依賴性；在角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹模型中，牛膝甾酮組分和皂苷組分各劑量在相應時間點上都可以有效降低角叉菜膠所致的大鼠足趾腫脹率，以牛膝甾酮組分高劑量和皂苷組分高、中劑量組的抑制效果最佳。結論：牛膝甾酮組分和皂苷組分都具有一定的抗炎作用，是牛膝藥材發揮抗炎作用的藥效物質基礎。

牛膝；甾酮；皂苷；抗炎

牛膝為我國傳統中藥，是中醫臨床的常用藥，始載于《神農本草經》，陶弘景釋名為“其莖有節似牛膝”，即藥名相形之義。牛膝主產于河南，并且在河南有著悠久的種植歷史，目前河南是牛膝的道地藥材產區。牛膝性平，其味酸、苦，歸肝、腎經，具有強筋骨，補肝腎，活血通經，利尿通淋，引血(火)下行等功效。生用可活血祛瘀，熟用可補肝腎、強筋骨[1-2]。通過化學成分研究發現，牛膝中含有大量的甾酮類和皂苷類化合物[3-10]，這兩類化合物具有多種藥理作用[11-15]。前期研究結果發現，牛膝補腎壯骨有效部位既能夠治療骨質疏松，又能夠促進開放性骨折的愈合，同時還能對骨折所引起的炎癥反應起到一定的抑制作用[16]。為了進一步闡述牛膝補腎壯骨有效部位中甾酮類和皂苷類化合物在抗炎方面所發揮的作用，本實驗在牛膝補腎壯骨有效部位化學成分已拆分的基礎上[17-18]，對牛膝甾酮組分和牛膝皂苷組分進行了抗炎活性的研究，考察牛膝各組分能否對由骨折引起的急性炎癥發揮抗炎作用。

1 材料

1.1 動物

昆明種小白鼠，雄性，體質量(20±2)g，合格證號：SYXK黑2013003，由黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心提供。SD大白鼠，雄性，體質量(200±20)g，合格證號：SYXK黑2013003，由黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心提供。

1.2 試劑和儀器

牛膝各拆分組分(黑龍江中醫藥大學藥學院中藥化學研究室自行制備)；依文思藍(美國Amresco公司)；醋酸地塞米松片(哈藥集團三精制藥有限公司)；生理鹽水(哈爾濱三聯藥業有限公司)；碘伏(德州益家康消毒有限公司)；角叉菜膠(美國Sigma-Aldrich 公司)；721型紫外分光光度計(上海光學儀器廠)；毛細管放大裝置(黑龍江中醫藥大學藥學院中藥化學教研室自行制備)；TGL-16型離心機(上海醫療器械廠)；精密天平(BL-P系列美國Setra電子公司)。

2 方法

2.1 牛膝各拆分組分對醋酸所致毛細血管通透性的影響

2.1.1 實驗分組及給藥方法

取昆明種小鼠80只，體質量(20±2)g，雄性，隨機分為8組，每組10只，分別為空白對照組、地塞米松陽性對照藥組(6 mg/kg)、牛膝甾體高劑量組(51 mg/kg)、中劑量組(26 mg/kg)、低劑量組(13 mg/kg)，牛膝皂苷高劑量組(75 mg/kg)、中劑量組(37 mg/kg)、低劑量組(19 mg/kg)。各組均連續灌胃給藥7天，每天1次，空白對照組給予同體積蒸餾水。

2.1.2 實驗方法與觀測指標

各組均連續灌胃給藥7天，末次給藥2 h后，各鼠尾靜脈注射0.5%伊文思藍生理鹽水溶液，按0.1 ml/10 g給藥，并立即腹腔注射0.6%醋酸。致炎后20 min脫椎處死小鼠，打開腹腔，用6 ml的生理鹽水分多次沖洗小鼠腹腔，吸出洗滌液后加生理鹽水至10 ml，3500 rpm離心15 min取上清，用比色法于590 nm波長處測定OD值，以生理鹽水溶液調零讀取吸光度A值，以A值表示伊文思藍含量。

0.5%伊文思藍的配制：精確稱取伊文思藍0.125 g，用生理鹽水溶解，定容至25 ml容量瓶，得到0.5%伊文思藍生理鹽水溶液。

2.2 牛膝各拆分組分對角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹的影響

2.2.1 實驗分組及給藥方法

取健康SD大鼠80只，體質量(200±20)g，雄性，隨機分為8組，每組10只，分別為空白對照組、陽性藥醋酸地塞米松(4.2 mg/kg)組、牛膝甾體高劑量組(36 mg/kg)、中劑量組(18 mg/kg)、低劑量組(9 mg/kg)，牛膝皂苷高劑量組(52 mg/kg)、中劑量組(26 mg/kg)、低劑量組(13 mg/kg)。各組均連續灌胃給藥7天，每天1次，空白對照組給予同體積蒸餾水。

2.2.2 實驗方法與觀測指標

采用容積測量法，末次給藥后在每只大鼠右后支踝關節處用苦味素畫一條清晰橫線，先測出各組大鼠正常的足趾體積。末次給藥 30 min 后，將大鼠右后肢拉直，自足趾中部皮下注射1%角叉菜膠，0.05 ml/爪，誘發足趾炎性腫脹。并在致炎后1 h、2 h、4 h、6 h分別測定各鼠右足趾體積(ml)，計算各組不同時間的足趾腫脹率并比較各組腫脹率的差異。

腫脹率(%)=(腫脹后容積-腫脹前容積)/腫脹前容積×100%

3 結果

3.1 對醋酸所致毛細血管通透性的影響 見表1。

表1 牛膝各拆分組分對醋酸所致小鼠毛細血管通透性的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

實驗結果見表1。同空白組比較，牛膝甾酮高劑量組、牛膝皂苷高劑量組、牛膝皂苷中劑量組的吸光度值與空白組比較有顯著性差異，差異極顯著(P<0.01)，牛膝皂苷低劑量組與空白組比較，具有顯著性差異(P<0.05)。說明牛膝皂苷高、中、低三個劑量組都有不同程度的抑制醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增加的作用，牛膝甾酮高劑量組有抑制醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增加的作用。結果表明牛膝甾酮和皂苷組分都具有一定的抑制炎癥因子滲出的作用，其中牛膝皂苷組分的抗炎作用優于甾酮組分。

3.2 對角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹的影響

實驗結果見表2。與空白對照組相比，牛膝皂苷高、中劑量、甾酮高劑量組和陽性藥醋酸地塞米松組可明顯降低角叉菜膠致炎后1、2、4、6 h大鼠足腫脹率，具有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)，抗炎作用較強。牛膝皂苷中劑量組在個別時間點抗炎作用優于皂苷高劑量組，說明牛膝皂苷組分的抗炎作用與劑量無依賴性關系。兩組分組間比較,牛膝皂苷組分在急性抗炎作用上優于甾酮組分。

表2 牛膝各拆分組分對角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

骨折部位均伴生炎癥反應，炎癥反應是機體最基本的抗損傷反應。對于開放性骨折而言，炎癥會延緩骨折的早期愈合，因為傷口處會發生滲出性炎癥，這就會在局部形成紅、腫、熱、痛的現象，使得局部血流受阻，并使組織缺氧缺血。本實驗采用了非特異性炎癥模型中的毛細血管通透性增強模型和足跖腫脹模型，來模擬骨折發生后的炎癥滲出和局部腫脹，考察了牛膝甾酮組分和牛膝皂苷組分的抗炎作用。毛細血管通透性增強模型是以冰醋酸為致炎物質，進行腹腔注射，給予藥物干預作用后，收集染料部位，進行紫外測定[19]。實驗結果表明，牛膝皂苷各劑量組和牛膝甾酮高劑量組均具有抑制醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增加的作用。足跖腫脹模型是以足跖腫脹的體積差異程度作為抗炎活性的評價指標，在大鼠足跖部位皮下注射角叉菜膠作為致炎物質，比較給予藥物干預前后足跖腫脹體積差異的程度[20]。實驗結果顯示，牛膝皂苷高、中劑量組和牛膝甾酮高劑量組可明顯減輕角叉菜膠致炎后各時間點大鼠足跖腫脹程度，降低腫脹率。通過以上的實驗結果證明，牛膝甾酮和皂苷組分對于炎癥滲出和炎癥引發的局部腫脹都具有較好的抑制作用。可見在骨折發生時，牛膝各拆分組分能夠降低骨折局部毛細血管的通透性，減少炎癥物質滲出，抑制骨折局部腫脹，從而促進血管重建，加速局部血運障礙的恢復。

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Anti-inflammatory Effect of Split Fractions of Radix Achyranthis Bidentatae

YANG Liu,YAN Mei-ling,WU Li-hong,JIANG Hai,SHU Zun-peng,YANG Da-yu,YANG Bing-you,WANG Qiu-hong,KUANG Hai-xue*

(KeyLaboratoryofChineseMateria,MedicaMinistryofEducation，HeilongjiangKeyLaboratoryofTCMPharmacidynamicMaterialBases，HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150040，China)

Objective: To research the anti-inflammatory effect of split fractions of Radix Achyranthis Bidentatae. Methods: The models of celiac inflammation effusion mice caused by acetic acid and rats’ foot swelling caused by carageen glue were established to observe the anti-inflammatory effect of split fractions of Radix Achyranthis Bidentatae. Results:Phytosterones components in high-dose group and tritepene saponins components in three dose groups could inhibit blood capillary permeability of abdominal cavity in the model of celiac inflammation effusion mice caused by acetic acid. In three dose groups the tritepene saponins components showed an anti-inflammatory effect in a dose-dependent manner. Phytosterones components in high-dose group and tritepene saponins components in high and middle dose groups could inhibit the rats’ foot swelling caused by carageen glue. Conclusion: There is an obviously anti-inflammatory effect of split fractions of Radix Achyranthis Bidentatae.

Radix Achyranthis Bidentatae; Phytosterones; Tritepene saponins; Anti-inflammation

黑龍江中醫藥大學優秀創新人才支持計劃(2012)；黑龍江省博士后基金項目(No.LBH-Z10020)；黑龍江中醫藥大學博士創新基金項目(No.2013bs04)；黑龍江省自然科學基金面上項目(No.H201324)；高等學校博士學科點專項科研基金新教師類項目(No.20132327120003)

楊柳(1982-)，女，副教授，主要研究方向：中藥、天然藥物藥效物質基礎及藥動學研究。

匡海學*(1955-)，男，教授，博士研究生導師，主要研究方向：中藥及天然藥物藥效物質基礎、中藥性味理論研究。

2016-01-10

R285.5

A

1002-2406(2016)06-0008-03

修回日期：2016-02-05