六味地黃湯及其“一補一瀉”藥對對腎陰虛模型小鼠HPT軸的影響

戴冰，楊夢琳，張嘉妮，李玉星，歐陽林旗，肖子曾*，鄧桂明，楊磊

(1.湖南中醫藥大學附屬第一醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

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實 驗 研 究

六味地黃湯及其“一補一瀉”藥對對腎陰虛模型小鼠HPT軸的影響

戴冰1，楊夢琳2，張嘉妮1，李玉星1，歐陽林旗1，肖子曾2*，鄧桂明1，楊磊1

(1.湖南中醫藥大學附屬第一醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

目的：觀察六味地黃湯及三個“一補一瀉”藥對對腎陰虛模型小鼠下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸的影響。方法：將小鼠隨機分為空白組、模型組和給藥組(六味地黃湯組、山茱萸-丹皮組、熟地-澤瀉組、山藥-茯苓組)共6個試驗組；連續9天分別灌胃給予以上對應藥物；第5～9天，除空白組灌胃蒸餾水外，其他各組按50 mg/kg每天灌胃氫化可的松注射液，制備小鼠腎陰虛模型，測定體質量，環磷酸腺苷(cAMP)、環磷酸鳥苷(cGMP)、甲狀腺激素(TSH)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)含量，觀察甲狀腺組織形態學改變。結果：腎陰虛模型小鼠體質量降低，血漿cAMP含量、血清TSH、T3、T4含量升高；六味地黃湯及其山茱萸-丹皮藥對降低HPT軸中垂體分泌的TSH含量、下調腎上腺分泌的T3、T4含量，修復受損甲狀腺組織。結論：六味地黃湯改善腎陰虛證的作用機制可能與降低HPT中垂體分泌的TSH、下調腎上腺分泌的T3、T4，修復受損甲狀腺組織有關。其中山茱萸-丹皮藥對是全方改善腎陰虛證的主要藥效物質。

六味地黃湯；補瀉藥對；腎陰虛模型；下丘腦-垂體-甲狀腺軸

六味地黃湯出自宋代醫家錢乙《小兒藥證直訣·卷下》， 由熟地、山茱萸、山藥、澤瀉、丹皮、茯苓組成，熟地、山茱萸、山藥合用，補腎、肝、脾之不足即“三補”，澤瀉、丹皮、茯苓合用，瀉腎、肝、脾之有余即“三瀉”；其中“一補一瀉”藥對：澤瀉甘寒泄腎濕濁，與熟地合用，防其滋膩太過；丹皮辛苦清泄肝火與山茱萸合用，可制山茱萸之溫澀；茯苓甘淡淡滲脾濕，與山藥合用，助山藥之健運，使該方具有滋補而不留邪，降泄而不傷正的滋補腎陰功效[1-3]。但目前對六味地黃湯作用機制及其配伍原理的研究多以整方及拆方“三補”“三瀉”為主線開展，由于腎陰虛患者通常表現為神經內分泌調節系統中的HPT軸功能紊亂[4]，因此從HPT軸入手來探究整方及拆方“一補一瀉”藥對改善腎陰虛證的作用機制很有必要，這對揭示該方的配伍原理具有一定的科學意義。

1 試驗材料與儀器

1.1 動物

清潔級昆明小鼠60只，雌雄各半，體質量(20±2)g，購自湖南斯萊克景達試驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2013-0004；飼養于湖南中醫藥大學試驗動物中心。

1.2 藥物

按六味地黃湯(熟地黃24 g，山茱萸12 g，山藥12 g，牡丹皮9 g，澤瀉9 g，茯苓9 g)稱取原藥材2劑，飲片均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科。再按六味地黃湯中各藥對的比例分別稱取山茱萸-丹皮藥對、熟地黃-澤瀉藥對、山藥-茯苓藥對，各2劑，各組藥材均加6倍量水，浸泡30 min后，煎煮2次，每次30 min，合并2次藥液后旋轉蒸發儀濃縮，均得最終濃度為1.5 g/ml的濃縮液。

1.3 主要試劑

氫化可的松注射液(安陽九州藥業有限責任公司，批號140820001A)；碘[125I]促甲狀腺激素(TSH)放射免疫分析藥盒(批號150820)、碘[125I]三碘甲狀腺原氨酸(T3)放射免疫分析藥盒(批號150820)、碘[125I]甲狀腺素(T4)放射免疫分析藥盒(批號150820)(北京北方生物技術研究所)；環磷酸腺苷(cAMP)、環磷酸鳥苷(cGMP)酶聯免疫分析試劑盒(R&D systems)。

1.4 主要儀器

RE-52A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；羅氏全自動生化儀(型號：Modular DPP)；小型冷凍離心機(型號：centrifuge 5415R)；Shandon325型石蠟切片機(英國 Shandon公司)；Motic B5顯微攝像系統(麥克奧迪實業集團公司)。

2 試驗方法

2.1 分組

取昆明小鼠60只，雌雄各半，適應性喂養7天后，隨機分成空白組、模型組、六味地黃湯組、山茱萸-丹皮組、熟地-澤瀉組、山藥-茯苓組，每組10只小鼠。

2.2 給藥

分組后第2天開始，連續9天，各組分別灌胃給予蒸餾水、蒸餾水、六味地黃湯藥液9.75 g/(kg·d)、山茱萸-丹皮藥液2.73 g/(kg·d)、熟地-澤瀉藥液4.29 g/(kg·d)、山藥-茯苓藥液2.73 g/(kg·d)；給藥劑量按照人與小鼠等效劑量系數折算法算出。

2.3 造模

第6～9天除空白組灌胃蒸餾水外，其他各組均每天下午15:00灌胃氫化可的松注射液為50 mg/kg。

2.4 標本采集與處理

末次給藥后禁食24 h，于試驗第10天摘眼球采血，分離血清及血漿；取血后立即摘取甲狀腺，放置于裝有10%甲醛的凍存管中保存待測。

2.5 指標檢測

2.5.1 癥狀觀察、體質量測定

從試驗開始，每日觀察并記錄小鼠癥狀，于造模前、后各測量小鼠體質量1次，并記錄。將死亡小鼠剔除試驗。

2.5.2 cAMP、cGMP含量測定

小鼠摘眼球采血(采血管中加入肝素鈉)，血樣放置30 min后，3500 r/min離心15 min，取上清按試劑盒說明進行檢測。

2.5.3 TSH、T3、T4含量測定

小鼠摘眼球采血(普通采血管)，血樣放置30 min后，3500 r/min離心15 min，取上清按試劑盒說明進行檢測。

2.5.4 甲狀腺組織形態學觀察

各組小鼠甲狀腺用10%甲醛固定，經過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與貼片后，用蘇木素-伊紅(HE)染色后，常規顯微鏡下觀察各組織形態結構的變化。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 對腎陰虛模型小鼠癥狀、體質量的影響

與空白組比較，模型組體質量有顯著性差異(P<0.01)，并出現煩躁、易激惹、拱背扎堆、毛發枯槁易脫落、大便干結、飲食增多等癥狀，隨著給藥時間延長，上述癥狀逐漸加重。六味地黃湯組、山茱萸-丹皮組能減緩腎陰虛模型小鼠體質量下降的趨勢，且能改善模型小鼠腎陰虛癥狀：小鼠表現較溫順、毛發有光澤、大便無干結，少拱背扎堆現象。熟地-澤瀉組、山藥-茯苓組不能減緩腎陰虛模型小鼠體質量下降的趨勢，且不能改善模型小鼠腎陰虛癥狀：小鼠煩躁、易激惹、拱背扎堆、毛發枯槁、易脫落。結果見圖1。

圖1 六味地黃湯及其“補瀉”藥對對模型小鼠體質量的影響

3.2 對腎陰虛模型小鼠血漿cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影響

與空白組比較，模型組血漿cAMP含量、cGMP含量、cAMP/cGMP比值均有顯著性差異(P<0.01)；與模型組比較，六味地黃丸組、山茱萸-丹皮組的血漿cAMP含量、cAMP/cGMP比值均有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)；六味地黃丸組血漿cGMP含量亦有顯著性差異(P<0.05)，熟地-澤瀉組、山藥-茯苓組血漿cAMP含量、cGMP含量、cAMP/cGMP比值無顯著性差異(P>0.05)。結果提示,六味地黃湯、山茱萸-丹皮藥對能抑制腎陰虛模型小鼠血漿cAMP含量、cAMP/cGMP比值上升的趨勢，六味地黃湯還能抑制血漿cGMP含量下降的趨勢，使其血漿cAMP、cGMP含量，cAMP/cGMP比值基本恢復到正常水平。結果見表1。

3.3 對腎陰虛模型小鼠血清TSH、T3、T4含量的影響

與空白組比較，模型組血清TSH、T3、T4含量有顯著性差異(P<0.01)；與模型組比較，六味地黃湯組、山茱萸-丹皮組血清TSH、T3、T4含量有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，熟地-澤瀉組、山藥-茯苓組血清TSH、T3、T4含量無顯著性差異(P>0.05)。結果提示,六味地黃湯、山茱萸-丹皮藥對能減緩腎陰虛模型小鼠血清TSH、T3、T4含量上升的趨勢，且能使其血清TSH、T3、T4含量基本恢復到正常水平；熟地-澤瀉藥對、山藥-茯苓藥對不能減緩腎陰虛模型小鼠血清TSH、T3、T4含量上升的趨勢。結果見表2。

表1 六味地黃湯及其“補瀉”藥對對模型小鼠cAMP、cGMP含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與六味地黃湯組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與山茱萸-丹皮組比較，%P<0.05，%%P<0.01。

表2 六味地黃湯及其“補瀉”藥對對模型小鼠TSH、T3、T4含量的影響

注：與空白組比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比，#P<0.05，##P<0.01；與六味地黃湯組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與山茱萸-丹皮組比較，%P<0.05，%%P<0.01。

3.4 對腎陰虛模型小鼠甲狀腺組織形態學的影響

空白組甲狀腺濾泡大小基本一致，呈圓形或橢圓形，內部充滿紅染膠質，膠質染色均勻，濾泡間無水腫，上皮細胞無增生。腎陰虛模型組甲狀腺濾泡大小不一，少數濾泡膠質稀薄甚至缺失，濾泡壁上皮細胞明顯增生；六味地黃湯組、山茱萸-丹皮組甲狀腺濾泡大小正常，濾泡壁上皮細胞完整，內部充滿紅染膠質，膠質染色均勻，基本無稀薄或缺失。熟地-澤瀉組、山藥-茯苓組甲狀腺濾泡上皮細胞有增生，大部分濾泡膠質稀薄，濾泡間有水腫。結果提示,腎陰虛模型小鼠甲狀腺組織均受損，六味地黃湯、山茱萸-丹皮藥對能修復腎陰虛模型小鼠受損甲狀腺組織，熟地-澤瀉藥對、山藥-茯苓藥對不能修復腎陰虛模型小鼠受損甲狀腺組織。結果見圖2。

圖2 六味地黃湯及其“補瀉”藥對對模型小鼠甲狀腺組織形態學的影響

4 討論

目前常用的腎陰虛模型造模方法有(促)腎上腺皮質激素法、甲狀腺素法、甲狀腺素聯用利血平法、條件反射結扎腎動脈法、熱性中藥法等，其中(促)腎上腺皮質激素法是運用較早，應用最為廣泛，且較為公認造模方法，本實驗即采用該方法給予小鼠大劑量，短時間灌胃氫化可的松造模。考慮到中藥起效較緩慢，而該實驗造模時間又短，為了使藥物有足夠的時間發揮其療效，本實驗中除空白組與模型組外，其余各組小鼠均預防性給藥。本研究發現,模型組小鼠出現體質量下降、煩躁、易激惹、拱背扎堆、毛發枯槁易脫落、大便干結、飲食增多等癥狀，且cAMP升高，與夏炳江[5]、王萍[6]等報道的腎陰虛模型表現基本一致，提示腎陰虛模型造模成功；而六味地黃湯、山茱萸-丹皮藥對可改善腎陰虛證。

HPT軸由下丘腦、垂體與甲狀腺組成的神經內分泌調節系統之一。該軸中TSH是由腺垂體合成分泌的一種直接調節甲狀腺形態和功能的關鍵激素，它既能維持甲狀腺濾泡細胞的生長發育，又能促進T3、T4的合成和分泌；甲狀腺合成分泌T3、T4，這兩種激素具有促進物質與能量代謝的作用。甲狀腺功能主要受下丘腦與垂體的調節，下丘腦釋放促甲狀腺激素釋放激素(TRH)，調節腺垂體分泌TSH，TSH進一步引起甲狀腺激素的釋放，血液甲狀腺激素濃度變化通過負反饋調節下丘腦TRH和垂體TSH的分泌，構成HPT軸的自發性控制環路。現代研究表明，腎陰虛患者HPT軸中TSH、T3、T4水平升高[7]。故六味地黃湯改善腎陰虛證的作用機制之一可能與降低垂體分泌的TSH水平，甲狀腺分泌的T3、T4水平，修復受損甲狀腺組織有關。

本研究中山茱萸-丹皮藥對改善腎陰虛證及其作用機制與六味地黃湯無差異，故山茱萸-丹皮藥對可能是全方改善腎陰虛證的主要藥效物質之一，但該藥對中有哪些藥效成分，它們是否通過HPT軸來改善腎陰虛證有待進一步研究。該實驗還發現熟地-澤瀉藥對、山藥-茯苓藥對不能改善腎陰虛證；但它們與山茱萸-丹皮配伍后即全方改善腎陰虛證作用最佳，這充分體現六味地黃湯在方中運用“一補一瀉”三對藥對補瀉并用，以補為主，以瀉為輔，共同支撐方劑表達良好的滋陰補腎的配伍特色。

[1] 楊林,孫靜,郝璐.六味地黃丸組方的臨床應用及研究[J].浙江中醫藥大學學報,2010,34(5):796-798.

[2] 梁華，朱明雪，孫燕佩,等.六味地黃丸、金匱腎氣丸的免疫調節作用研究進展[J].中醫藥學報，2012,40(2):97-99.

[3] 孫琳林，王書惠，盧林,等.左歸丸與六味地黃丸對衰老大鼠抗氧化能力及海馬區超微結構影響的比較研究[J].中醫藥學報，2012,40(3):140-143.

[4] 樊蔚虹,岳廣欣,任小巧,等.肝腎陰虛證大鼠下丘腦-垂體-甲狀腺軸的變化及中藥對其調節作用[J].中國中醫藥信息雜志,2001,8(10):21-23.

[5] 夏炳江,童培建,孫燕,等.骨質疏松腎陰虛型小鼠病證結合模型建立的試驗研究[J].中國中醫急癥,2013,22(7):1083-1086.

[6] 王萍,王喜軍.腎陰虛證動物模型研究概況[J].中醫藥信息,2013,30(4):123-125.

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湖南省教育廳重點項目(No.15A140)；康爾佳藥業集團糖尿病研究所支持項目；湖南省自然科學基金項目(No.13JJ3096)

戴冰(1964-)，女，博士，教授，主要研究方向：臨床中藥學。

肖子曾*,教授，主要研究方向：方劑的應用及療效機理研究。

2016-05-12

R285.5

A

1002-2406(2016)06-0019-04

修回日期：2016-06-10