凝結芽孢桿菌Liu-g1產中性蛋白酶的發酵培養基及條件優化

張營營,郭 茜,熊利霞,張紅星,謝遠紅,劉 慧,*,梁新貝,連正興

(1.北京農學院食品科學與工程學院,微生態制劑關鍵技術開發北京市工程實驗室,食品質量與安全北京實驗室,農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,北京 102206;2.中國農業大學動物科技學院,北京 100094)

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凝結芽孢桿菌Liu-g1產中性蛋白酶的發酵培養基及條件優化

張營營1,郭 茜1,熊利霞1,張紅星1,謝遠紅1,劉 慧1,*,梁新貝1,連正興2

(1.北京農學院食品科學與工程學院,微生態制劑關鍵技術開發北京市工程實驗室,食品質量與安全北京實驗室,農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,北京 102206;2.中國農業大學動物科技學院,北京 100094)

為提高一株產中性蛋白酶凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)Liu-g1發酵液中蛋白酶活力,采用單因素和正交實驗研究不同培養基配方和不同發酵條件對凝結芽孢桿菌Liu-g1產中性蛋白酶活力的影響。結果表明:發酵培養基最優配方為大豆粕1%、玉米淀粉4%、碳酸鈣0.6%;在初始pH7.5,裝液量30 mL/250 mL,發酵溫度45 ℃,發酵時間72 h優化條件下發酵液中蛋白酶活力最高,可達243.874 U/mL,為優化前的5.8倍。

凝結芽孢桿菌,中性蛋白酶活力,發酵,優化

凝結芽孢桿菌具有乳酸菌產乳酸和芽孢桿菌耐高溫、抗逆性強、穩定性好的儲存特性,以及具有豐富的胞外酶系統,作為一種獨特的新型芽孢益生菌,被國內外學者研究并應用于醫藥、食品、保健、畜牧和水產品養殖等行業[1-5]。匡群等[6]研究發現投喂凝結芽孢桿菌后的團頭魴魚的生長率和蛋白質利用率均顯著提高,料肉比和腸道大腸桿菌數量顯著降低;曾麗莉等人[7]研究顯示飼料中添加適量的凝結芽孢桿菌可明顯改善櫻桃谷肉鴨的生長性能和生化指標;林麗花等人[8]在飼糧中添加200 mg/kg凝結芽孢桿菌菌粉(1×109CFU/g)可顯著提高黃羽肉雞日增重、胸肌率和成活率,顯著降低了全期肉雞的料肉比。諸多動物實驗中凝結芽孢桿菌體現出提高日增重、降低料肉比的效果,在很大程度上得益于其分泌的豐富胞外酶。凝結芽孢桿菌進入機體定植于腸道后,一方面產生大量蛋白酶[9]、脂肪酶[10]等,促進畜禽對營養物質的消化吸收;另一方面菌株代謝產生的氨基酸、維生素、短鏈脂肪酸、促生長因子等可供動物機體利用[11],從而促進畜禽的生長。雖然凝結芽孢桿菌在優化發酵條件以獲得大量菌體或芽孢方面研究頗多,但是在優化發酵條件以提高中性蛋白酶活力方面研究甚少。本文利用篩選自傳統干酪的凝結芽孢桿菌Liu-g1,采用單因素和正交實驗研究不同培養基配方和不同發酵條件對菌株Liu-g1產中性蛋白酶活力的影響,優化凝結芽孢桿菌Liu-g1產中性蛋白酶的發酵條件,為工業化生產中性蛋白酶奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)Liu-g1:篩選于傳統干酪,經前期實驗鑒定為產中性蛋白酶的菌株。保藏地址:中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

基礎培養基[12]:葡萄糖1%、蛋白胨1%、氯化鈉0.4%,pH7.0。

干酪素、L-酪氨酸 國藥集團化學試劑北京有限公司;福林試劑 Sigma試劑公司;其它發酵培養基試劑均為分析純 北京陸橋技術責任有限公司。

BS224S型精密電子天平 德國賽多利斯集團;MLS-3750型全自動高壓蒸汽滅菌鍋 日本SANYO公司;BCN-1360B型無菌超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;2100型可見光分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠;雷磁PHS-3B型pH計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化及擴培 凝結芽孢桿菌Liu-g1以2%的接種量移種于裝有10 mL基礎培養基的試管中,于37 ℃在轉速為150 r/min的搖床培養48 h。如此活化培養2代,得到活化菌種。將活化菌液以2%接種量移種于基礎培養基中(50 mL/250 mL),培養條件同上,得到擴大培養液[13]。

1.2.2 單因素實驗確定發酵培養基配方

1.2.2.1 碳源的確定 將基礎培養基中的碳源分別由1%葡萄糖、蔗糖、纖維素、可溶性淀粉、玉米淀粉、麥芽糖替代,將擴培菌液以2%接種量移種于基礎培養基中(50 mL/250 mL),于150 r/min的搖床37 ℃培養48 h,8000 r/min離心10 min,取上清測定發酵液中蛋白酶活力,根據酶活力大小分析確定較好的碳源。

1.2.2.2 氮源的確定 在確定較好碳源的基礎上,將基礎培養基中的氮源分別由1%花生麩皮、大豆粕、棉籽粕、玉米麩皮、小麥麩皮替代[14],以上述同樣條件發酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發酵液中蛋白酶活力,根據酶活力大小分析確定較好的氮源。

1.2.2.3 無機鹽的確定 在確定較好碳源和氮源的基礎上,將基礎培養基中的無機鹽分別由0.4%氯化鈉、氯化鈣、碳酸鈣、硫酸鎂、硫酸錳、K2HPO4∶KH2PO4=1∶1替代,以上述同樣條件發酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發酵液中蛋白酶活力,根據酶活力大小分析確定較好的無機鹽。

1.2.3 正交實驗優化發酵培養基配方 根據上述單因素多水平實驗結果,選擇質量分數分別為1%、2%、4%的大豆粕,1%、2%、4%的玉米淀粉,0.2%、0.4%、0.6%的碳酸鈣設計凝結芽孢桿菌Liu-g1產中性蛋白酶發酵培養基的三因素三水平[L9(34)]正交實驗,因素水平表見表1。以上述同樣條件發酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發酵液中蛋白酶活力,根據酶活力大小分析確定優化培養基配方。

表1 優化發酵培養基正交因素水平表Table 1 Orthogonal factors level table for the optimization of medium components for Bacillus coagulans Liu-g1

1.2.4 單因素實驗確定發酵條件

1.2.4.1 發酵裝液量的確定 采用經上述優化好的培養基配方,250 mL三角瓶中裝液量分別為30、40、50、60、70 mL,以上述同樣條件發酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發酵液中蛋白酶活力,根據酶活力大小分析確定較好裝液量。

1.2.4.2 發酵轉速的確定 采用上述較好發酵裝液量,轉速分別為140、160、180、200、220 r/min,以上述同樣條件發酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發酵液中蛋白酶活力,根據酶活力大小分析確定較好轉速。

1.2.4.3 發酵接種量的確定 采用上述較好發酵裝液量、轉速,接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%,以上述同樣條件發酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發酵液中蛋白酶活力,根據酶活力大小分析確定較好接種量。

1.2.4.4 發酵pH的確定 采用上述較好發酵裝液量、轉速、接種量,初始培養基pH分別調節為6.5、7、7.5(自然)、8,以上述同樣條件發酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發酵液中蛋白酶活力,根據酶活力大小分析確定較好pH。

1.2.4.5 發酵時間的確定 采用上述較好發酵裝液量、轉速、接種量、初始pH7,發酵時間分別為12、24、36、48、60 h,以上述同樣條件發酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發酵液中蛋白酶活力,根據酶活力大小分析確定較好發酵時間。

1.2.4.6 發酵溫度的確定 采用上述較好發酵裝液量、轉速、接種量、初始pH7、發酵時間48 h,發酵溫度分別為37、41、45、50、55 ℃,以上述同樣條件發酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發酵液中蛋白酶活力,根據酶活力大小分析確定較好發酵溫度。

1.2.5 正交實驗優化發酵條件 根據上述單因素多水平實驗結果,選擇6.5、7、7.5初始培養基pH,30、45、60 mL裝液量,37、41、45 ℃發酵溫度,48、60、72 h發酵時間設計四因素三水平[L9(34)]正交實驗,以上述同樣條件發酵后8000 r/min離心10 min,取上清測定發酵液中蛋白酶活力,根據酶活力大小分析確定優化發酵條件。正交因素水平表如下:

表2 優化發酵條件正交因素水平表Table 2 Orthogonal factors level table for the optimization of fermentation conditions for Bacillus coagulans Liu-g1

1.2.6 蛋白酶活力測定 參照國家標準GB/T23527—2009《蛋白酶制劑》,采用福林-酚法測定中性蛋白酶活力[15]。

1.2.7 數據處理方法 使用SPSS 22.0軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗確定發酵培養基配方

2.1.1 碳源的確定 碳源即為微生物提供碳素來源的營養物質,主要生理功能是構成微生物細胞物質和代謝產物[16]。由圖1可見,以纖維素為碳源時發酵液有較高的蛋白酶活力,說明該菌能夠分泌纖維素酶;當玉米淀粉為碳源時蛋白酶活力極顯著(p<0.01)高于其他碳源,為181.552 U/mL。這是由于玉米淀粉為遲效碳源,有利于菌體在穩定期合成蛋白酶,而葡萄糖、蔗糖、麥芽糖為速效碳源,有利于菌體生長,但不利于代謝產物的合成。因此確定玉米淀粉為Liu-g1菌株發酵培養基碳源。

圖1 發酵培養基碳源對中性蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of carbon source on neutral proteinase activity

2.1.2 氮源的確定 氮源是組成微生物細胞中蛋白質和核酸的重要成分。由圖2可知,五種不同的有機氮源條件下,Liu-g1菌株產中性蛋白酶活力差異明顯。以玉米麩皮和小麥麩皮為氮源時產蛋白酶活力極低;以大豆粕為氮源時產蛋白酶活力極顯著(p<0.01)高于花生麩皮,達161.513 U/mL,棉籽粕次之,為125.949 U/mL。因此確定豆粕為Liu-g1菌株發酵培養基氮源。

圖2 發酵培養基氮源對中性蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on neutral proteinase activity

圖3 發酵培養基無機鹽對中性蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of inorganic salts on neutral proteinase activitty

2.2 正交實驗優化發酵培養基配方

由表3可見RA>RB>RC,即影響Liu-g1菌株發酵液中蛋白酶活力的因素主次順序依次為:碳源含量、氮源含量、無機鹽含量;由KA1>KA2>KA3,KB3>KB1>KB2,KC3>KC2>KC1可知,發酵培養基配方最優組合為A1B3C3,即碳源含量為1%,氮源含量為4%,無機鹽含量為0.6%,碳源∶氮源=1∶4。

表3 優化培養基條件[L9(34)]正交實驗結果Table 3 Orthogonal array design and results for the optimization of medium components for Bacillus coagulans Liu-g1

2.3 單因素實驗確定發酵條件

2.3.1 發酵裝液量的確定 由圖4可知,裝液量在30 mL/250 mL時發酵液蛋白酶活力最高,達到186.048 U/mL。發酵裝液量是發酵環境中溶氧量的間接體現,凝結芽孢桿菌為兼性厭氧菌,雖然缺氧乃至無氧條件下也可生存,但富氧環境有利于菌體的快速大量繁殖,足夠多的菌體富集因而能產生更多的蛋白酶。因此確定Liu-g1菌株發酵裝液量為30 mL/250 mL。

圖4 發酵裝液量對中性蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation volume on neutral proteinase activity

圖5 發酵轉速對中性蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of revolving speed on neutral proteinase activity

2.3.2 發酵轉速的確定 由圖5可知,發酵轉速對于發酵液中蛋白酶活力影響不大,轉速在140～220 r/min時發酵液蛋白酶活力先升高后降低,轉速在180 r/min時,發酵液蛋白酶活力最高。在一定范圍內,轉速的提高可以增加發酵液中溶氧量,從而促進菌體生長和蛋白酶累積;然而當轉速超過180 r/min時,過高轉速開始不利于菌體的穩定繁殖,從而降低發酵液中蛋白酶活力。由此確定Liu-g1菌株發酵轉速為180 r/min。

2.3.3 發酵接種量的確定 由圖6可見,隨發酵接種量的逐漸增加發酵液中蛋白酶活力呈現不規則跳躍,在接種量為5%時,發酵液蛋白酶活力最高,達143.869 U/mL。不同接種量水平對蛋白酶活力的影響差異不顯著。因此確定Liu-g1菌株發酵接種量為5%。

圖6 發酵接種量對中性蛋白酶活力的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on neutral proteinase activity

2.3.4 發酵pH的確定 pH通過影響菌體營養物質離子化程度、細胞膜電荷及膜滲透性,影響菌體對養分的吸收[17]。由圖7可知,初始pH在6.5～8.0時,發酵液中蛋白酶活力呈現先上升后下降趨勢,當pH為7.0時,發酵液中蛋白酶活力最高,達180.523 U/mL。因此確定Liu-g1菌株發酵液初始pH為7.0。

圖7 發酵液pH對中性蛋白酶活力的影響Fig.7 Effect of initial pH on neutral proteinase activity

2.3.5 發酵時間的確定 由圖8可知,發酵時間為24 h和36 h時發酵液中蛋白酶活力極低,48 h時明顯升高,之后緩慢提高,發酵72 h的發酵液中蛋白酶活力極顯著(p<0.01)高于其他發酵時間組。這是由于發酵36 h之前Liu-g1菌株處于生長對數期,而菌體蛋白酶一般在穩定期合成。考慮發酵周期和成本因素,發酵時間選擇72 h。

圖8 發酵時間對中性蛋白酶活力的影響Fig.8 Effect of fermentation time on neutral proteinase activity

表5 發酵條件優化前后產中性蛋白酶活力對照Table 5 Comparison of neutral protease activity before and after optimization of fermentation conditions

2.3.6 發酵溫度的確定 發酵溫度對蛋白酶合成及其活力有較大影響。由圖9可知,溫度在35～45 ℃時,發酵液蛋白酶活力逐漸升高;當溫度為45 ℃時,發酵液蛋白酶活力最高,說明45 ℃為蛋白酶最適合成溫度;當高于45 ℃時發酵液蛋白酶活力逐漸降低,這緣于較高的溫度會導致蛋白酶活力降低。因此確定Liu-g1菌株發酵溫度為45 ℃。

圖9 發酵溫度對中性蛋白酶活力的影響Fig.9 Effect of fermentation temprature on neutral proteinase activity

2.4 正交實驗優化發酵條件

由表4可見RD>RC>RB>RA,即影響Liu-g1菌株發酵液中蛋白酶活力的因素主次順序依次為:發酵時間、裝液量、發酵溫度、初始pH;由KA3>KA2>KA1,KB1>KB2>KB3,KC3>KC2>KC1,KD3>KD2>KD1可知,發酵條件最優組合為A3B1C3D3,即初始pH7.5,裝液量30 mL/250 mL,發酵溫度45 ℃,發酵時間72 h。

表4 優化發酵條件L9(34)正交實驗結果Table 4 Orthogonal array design and results for the optimization of fermentation conditions for Bacillus coagulans Liu-g1

2.5 驗證實驗

由表5可知,對照組凝結芽孢桿菌Liu-g1蛋白酶活力為42.106 U/mL,優化發酵條件下Liu-g1菌株發酵液中蛋白酶活力可達243.874 U/mL,為優化前的5.8倍。

3 結論

本文通過單因素和正交實驗優化凝結芽孢桿菌Liu-g1產中性蛋白酶的發酵培養基配方為:大豆粕1%、玉米淀粉4%、碳酸鈣0.6%;優化發酵條件為:初始pH7.5,裝液量30 mL/250 mL,發酵溫度45 ℃,發酵時間72 h。在優化發酵條件下中蛋白酶活力可達243.874 U/mL,為優化前的5.8倍。

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Optimization of culture medium and fermentation conditions for neutral protease produced byBacilluscoagulansLiu-g1

ZHANG Ying-ying1,GUO Qian1,XIONG Li-xia1,ZHANG Hong-xing1,XIE Yuan-hong1,LIU Hui1,*,LIANG Xin-bei1,LIAN Zheng-xing2

(1.Food Science and Engineering College,Beijing University of Agriculture,Beijing Engineering Laboratory of Probiotics Key Technology Development,Food Quality and Safety Lab in Beijing,Harmful Microorganisms and Pesticide Safety Inspection of Agricultural Products and the Control of the Beijing Key Laboratory,Beijing 102206,China;2.College of Animal Science and Technology,China Agricultural University,Beijing 100094,China)

InordertoimprovetheactivityofneutralproteaseproducedbyBacillus coagulansLiu-g1,singlefactortestandorthogonaltestonBacillus coagulansLiu-g1proteaseactivitywerecarriedout.Theresultsshowedthattheoptimalculturemediumformulawas1%ofsoybeanpowder,4%ofcornstarchand0.6%ofcalciumcarbonate.TheresultsalsoindicatedthatthebestinitialpHwas7.5,fermentationvolumeof30mL/250mL,incubationtemperatureat45 ℃,fermentationtimefor72h.Theproteaseactivityreached243.874U/mLinsuchconditions,5.8timestheamountofinitialconditions.

Bacillus coagulans;neutralproteaseactivity;fermentation;optimization

2016-05-30

張營營(1990-)，女，碩士，研究方向：食品微生物，E-mail：18811300700@163.com。

*通訊作者:劉慧(1963-)，女，碩士，教授，研究方向：食品微生物與發酵，E-mail：mxdlh1963@163.com。

轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08008-005)；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養項目(CIT&TCD20140315)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)21-0150-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.021