米曲霉β-半乳糖苷酶系的克隆表達與酶學特性分析

董自星,賈 超,王 君,路福平,王正祥,,*

(1.天津科技大學化工與材料學院生物化工系,天津 300457;2.天津科技大學生物工程學院與工業發酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457)

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米曲霉β-半乳糖苷酶系的克隆表達與酶學特性分析

董自星1,賈 超2,王 君2,路福平2,王正祥1,2,*

(1.天津科技大學化工與材料學院生物化工系,天津 300457;2.天津科技大學生物工程學院與工業發酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457)

本研究通過對米曲霉的3個β-半乳糖苷酶基因O158、AO及O76進行了克隆與表達,成功構建了相應的重組菌GS115(pPIC-O158)、GS115(pPIC-AO)和GS115(pPIC-O76),并獲得相應的重組酶。進一步分析發現,重組酶O158、AO和O76的最適作用pH分別為4.0、5.5和7.0;最適作用溫度均為50 ℃;在pH5.0～7.5之間或30～40 ℃均較為穩定。Mn2+對重組酶O158、AO和O76有明顯的激活作用,而Fe2+、Cu2+和Zn2+則強烈抑制它們的酶活。O158、AO和O76只對乳糖具有水解與轉苷活性,而且AO對乳糖的親和力和催化效率均高于O158和O76。此外,在所試米曲霉菌種中不存在參照基因組中的β-半乳糖苷酶基因O42。本文系統地對米曲霉的3個β-半乳糖苷酶進行了異源表達及酶學性質的研究,為其大規模生產及工業化應用奠定了基礎。

米曲霉,β-半乳糖苷酶,分子克隆,酶學性質

Cloning,expression and biochemical characterization ofβ-galactosidases fromAspergillusoryzae

DONG Zi-xing1,JIA Chao2,WANG Jun2,LU Fu-ping2,WANG Zheng-xiang1,2,*

(1.Department of Biochemical Engineering,College of Chemical Engineering and Materials Science,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,

β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase,EC 3.2.1.23),是能水解多糖、寡糖或次級代謝產物中的β-半乳糖苷鍵的一類酶,可將乳制品中的乳糖水解為半乳糖和葡萄糖,用于治療乳糖不耐受癥。某些β-半乳糖苷酶還能催化轉糖基反應[1],可生產半乳糖化的產品(galactosylated products)[2]。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

*注:下劃線部分為限制性酶切位點。此外,β-半乳糖苷酶在基因工程、醫藥、分析檢測和環境保護等領域都有著廣泛的應用[2-3]。

β-半乳糖苷酶的來源非常廣泛,但目前工業上常用的β-半乳糖苷酶主要由克魯維酵母、曲霉和青霉等發酵制得[3]?？唆斁S酵母可以產生大量的β-半乳糖苷酶,但它們均為中性的胞內酶,較難應用于酸性的工業環境;黑曲霉和多色青霉等所產的β-半乳糖苷酶為嗜酸胞外酶,但其產量遠低于酵母菌,限制了其在工業上的應用[4]。研究表明,米曲霉具有合成與分泌β-半乳糖苷酶的酶活特征,且其產生的β-半乳糖苷酶具有較高的轉糖基活性[5]。米曲霉也成為了工業上β-半乳糖苷酶的主要生產菌株[6]。針對米曲霉來源的β-半乳糖苷酶,目前的研究主要集中在異源表達[7]、酶學特征解析[7-8]、轉糖基反應[9]和固定化[10]等方面。

研究顯示,單一生物體往往具有多個β-半乳糖苷酶,而且這些酶之間存在性質與功能的差異[11]。本課題組之前對黑曲霉β-半乳糖苷酶家族的研究也揭示了這一特征,但米曲霉菌種中是否也具有與黑曲霉相似的β-半乳糖苷酶家族尚未見文獻報道。本研究將米曲霉來源的4個β-半乳糖苷酶進行了克隆表達,并系統研究了其生化特征的異同點,以期為實現其大規模工業化生產與應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株Pichia pastoris GS115以及質粒pPIC9K Invitrogen公司。大腸桿菌(EscherichiacoliJM109)和米曲霉(AspergillusoryzaeCICIM F1005F) 本實驗保藏。大腸桿菌用LB培養基進行培養;米曲霉采用CD培養基進行培養;畢赤酵母及其重組菌的培養基及其培養方法按照Invitrogen的畢赤酵母操作手冊進行。

LA Taq DNA聚合酶、限制性內切酶等 寶生物工程(大連)有限公司;T4DNA連接酶、質粒小量提取試劑盒和小量DNA產物純化回收試劑盒等 Thermo公司提供;RNA抽提試劑盒(High Pure RNA Isolation Kit)以及cDNA 合成試劑盒(Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit) Roche公司產品;胰蛋白胨(Tryptone)和酵母抽提物(Yeast Extract) 英國OXOID公司;G418、生物素(D-Biotin)和無氨基酵母氮源(YNB) 北京索萊寶生物科技有限公司;鄰-硝基酚-D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG) 上海生物工程有限公司,其它試劑均為國產分析純。

PTC-200型PCR儀 MJ Research Inc.;凝膠成像儀 美國SYNGENE公司;Gene Pulser Xcell電轉儀 美國BIO-RAD公司;恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿有限公司;SBA 40-C生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所;Agilent HP 1100高效液相色譜儀 美國惠普公司。

1.2 米曲霉β-半乳糖苷酶系的克隆與表達

1.2.1 畢赤酵母工程菌的構建 米曲霉總RNA的提取與cDNA的制備按照試劑盒說明書進行?；驍U增過程所采用的4對寡核苷酸引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其核苷酸序列匯總于表1。PCR產物純化、質粒、酶切、連接以及電轉化等采用實驗室常規方法進行[12]。

1.2.2 重組酶的誘導表達與制備 將構建成功的畢赤酵母重組菌GS115(pPIC-O158)、GS115(pPIC-AO)和GS115(pPIC-O76)在YPD平板上進行純化,挑取單菌落接種于YPD液體培養基中,30 ℃、220 r/min振蕩培養至對數生長期(OD600=2～6,約18～20 h)。按1%接種量接入25 mL BMGY培養基中,30 ℃、220 r/min振蕩培養至對數生長期(OD600=2～6,約16～18 h)。室溫下5000 r/min離心5 min回收酵母細胞,棄上清,將細胞重懸于50 mL BMMY培養基中至OD600=1.0,30 ℃繼續培養并開始誘導。每隔24 h補加0.5%的甲醇以維持誘導,同時取樣進行酶活測定。發酵結束后,12000 r/min離心10 min收集發酵上清液,即為粗酶液,保存到新的離心管中,-20 ℃保存備用。

1.3 重組β-半乳糖苷酶的酶活測定與酶學特征分析

1.3.1β-半乳糖苷酶的酶活測定 將發酵上清用0.05 mol/L pH5.0醋酸緩沖液稀釋,稱取0.2 g乳糖加入1 mL酶液,即反應體系中含有20%的乳糖,在50 ℃水浴中反應12 h。反應結束后,在沸水中滅活20 min,再通過生物傳感儀檢測葡萄糖的含量。β-半乳糖苷酶的活性定義為:在pH5.0、50 ℃下1 h分解乳糖生成1 mmol/L葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

1.3.2 最適pH和pH穩定性的測定 將酶用不同pH的緩沖液稀釋,以酶活最高者為100%,以相對酶活力對pH作圖;將酶用不同pH的緩沖液稀釋,25 ℃保溫1 h后,測定各自的酶活力,以最適pH下測得的酶活力為100%,以殘余酶活力對pH作圖,繪制pH穩定性曲線。所用緩沖液為:0.05 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH3.0～6.5)和0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH7.0～9.0)。

1.3.3 最適反應溫度和熱穩定性的測定 將反應體系分別置于30～80 ℃水浴進行酶促反應以測定其酶活力,以酶活最高者為100%,以相對酶活對溫度作圖;分別將酶液置于30～80 ℃水浴1 h后,立即置于冰上,測定殘余酶活力,以未水浴處理過的酶活為100%,以殘余酶活力對溫度作圖。

表2 米曲霉β-半乳糖苷酶基本特征Table 2 The properties of β-galactosidases from A. oryzae

1.3.4 不同金屬離子和化學試劑對酶活的影響 在β-半乳糖苷酶與其底物進行反應的體系中,加入終濃度為10 mmol/L的不同的金屬離子或化學試劑,分別測定加入不同金屬離子或化學試劑后各反應體系中β-半乳糖苷酶的相對酶活,以不加金屬離子和化學試劑的反應體系的酶活定義為100%。

1.3.5β-半乳糖苷酶動力學參數的測定 在0.05 mol/L pH5.0緩沖體系中,加入不同濃度的乳糖底物。反應1 h后,用生物傳感儀測定葡萄糖含量,計算出不同底物濃度的反應速率。利用軟件Origin 8.0對數據進行擬合得到米氏方程,并計算出酶反應的Km、Vmax、kcat和kcat/Km。

1.4 底物特異性與反應產物分析

在1 mL酶促反應體系中,加入終濃度為20%(w/v)的不同的底物,并加入經適當稀釋的酶液。在50 ℃水浴鍋中反應12 h,將反應液經過適當稀釋,進行高壓液相色譜分析。色譜條件:流動相為乙腈∶水=65∶35(體積比)。色譜柱:TSK-GEL G3000PWXL-CP(7.8 mm×300 mm,7 μm)。柱溫25 ℃,流速:1.0 mL/min。檢測器:蒸發光散射檢測器,其漂移管的溫度為90 ℃,氣體流速:2.2 mL/min。進樣量:10 μL。低聚半乳糖標準品由本實驗室制備,使用前進行適當稀釋。

1.5 米曲霉基因組中β-半乳糖苷酶系的生物信息分析與比對

從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取不同來源的β-半乳糖苷酶的氨基酸序列。利用Clustal X2軟件對這些序列進行多序列比對,并通過軟件MEGA 4.0以鄰近法(Neighbour-joining)構建進化樹,分析它們親緣關系的遠近[13]。通過軟件BioEdit對米曲霉來源的β-半乳糖苷酶的氨基酸序列進行比對和分析。

2 結果與分析

2.1 米曲霉β-半乳糖苷酶的基因克隆與序列分析

依據A.oryzaeRIB40的基因組序列信息(EMBL BA000049～BA000056),采用BLAST等分析方法,獲得了4個可能編碼β-半乳糖苷酶的基因,分別重新命名為O158、AO、O76和O42(表2，其中在參照基因組中的β-半乳糖苷酶基因O42在所試米曲霉菌種中不存在)。進一步制備米曲霉cDNA,以此為模板PCR擴增β-半乳糖苷酶并成功克隆入pPIC9K,獲得重組質粒pPIC-O158、pPIC-AO和pPIC-O76。通過測序結果可知,O158的測序結果比原始序列多出75個核苷酸殘基(即25個氨基酸),且另有3個氨基酸不同;而AO和O76的測序結果與原始序列保持一致(表2)。

利用MEGA 4.0將不同來源的β-半乳糖苷酶的氨基酸序列進行比對和進化樹的構建,結果匯總于圖1。此進化樹反映了不同來源的β-半乳糖苷酶之間的遺傳距離。其中,3個米曲霉來源的β-半乳糖苷酶分屬3個不同組合,相對而言O158與AO的相似度高一些。進一步分析發現,O158、AO和O76分別與來源于A.niger、A.candidus以及A.flavusAF70的β-半乳糖苷酶具有較高相似度。

以AoAO的三維結構[14]為參照,通過氨基酸序列比對對AoO158和AoO76的保守區進行分析和比較,結果如圖2所示。AoO158與AoAO具有較高的序列相似度,且具有相似的結構域(Domain 1到6)。其中,第一個結構域(Asp40～Thr397)為催化功能區,具有(α/β)8桶狀結構。它們的保守區組成為:作為酸/堿催化劑的Glu200和作為親核劑的Glu298。而AoO76比AoAO和AoO158少了一個結構域(Domain 6),且其與AoAO中的Glu200和Glu298對應的氨基酸殘基分別為Pro196和Ala307。

2.2β-半乳糖苷酶的重組表達與重組酶的酶學特征

圖1 進化樹描述不同來源的β-半乳糖苷酶的遺傳距離Fig.1 Phylogenetic tree describing the genetic distances among β-galactosidases from different microorganisms注：米曲霉來源的β-半乳糖苷酶用黑體表示;采用Jones-Tay-Thornton(JTT)距離矩陣模型計算遺傳距離。

圖2 不同來源的β-半乳糖苷酶的氨基酸序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of β-galactosidases from different microorganisms注：保守的氨基酸、保守的替換和半保守的替換分別用星號、分號和點表示;圓矩形表示的是前蛋白序列;AoAO中的1～6個結構域依次用矩形、下劃線、淺灰色、灰色、深灰色和黑色表示;AoO158、AoAO、AoO76、AnBglA和AfBglA分別為A. oryzae O158、A. oryzae AO、A. oryzae O76、A. niger BglA以及A. flavus AF70 BglA。

將上述構建獲得的重組質粒pPIC-O158、pPIC-AO和pPIC-O76分別線性化后,轉化畢赤酵母GS115,獲得重組菌GS115(pPIC-O158)、GS115(pPIC-AO)和GS115(pPIC-O76)。采用搖瓶發酵實驗,在甲醇的誘導下進行酶液制備。發酵持續120 h,離心收集酶液并經凍干獲得重組β-半乳糖苷酶O158、AO和O76。通過酶活測定發現,這三個重酶的酶活分別為0.35,0.30 U/g和0.28 U/g。同步以pPIC9K質粒轉化畢赤酵母GS115獲得含有空白質粒的重組菌,其發酵液檢測不到β-半乳糖苷酶酶活。

2.2.1 重組酶的最適作用pH及pH穩定性 在不同pH反應條件下分析重組酶O158、AO和O76的酶活力,結果匯總于圖3A。O158、AO和O76的最適作用pH分別為4.0、5.5和7.0。O158具有相對寬泛的pH作用范圍(pH3.5～7.0),在該pH范圍內相對酶活在80%以上。而AO在pH低于5.5或高于6.0時,酶活會急劇下降;O76在pH低于6.5或高于7.5時,酶活也會急劇下降。因此,AO和O76的酶活力較O158更容易受pH的影響。

pH穩定性實驗的結果如圖3B所示。在25 ℃、不同pH的緩沖液中放置1 h后,O158、AO和O76殘留的酶活在80%以上的pH范圍分別為4.0～8.5、3.5～7.5和5.5～8.0。與AO和O76相比,O158在較寬泛的pH范圍內相對酶活穩定。

圖3 β-半乳糖苷酶的最適作用pH及pH穩定性Fig.3 pH optima and pH stability of β-galactosidases注：A：最適作用pH;B：pH穩定性。

2.2.2 重組β-半乳糖苷酶的最適作用溫度及熱穩定性 在不同溫度下測定β-半乳糖苷酶的酶活,結果匯總于圖4A。米曲霉來源的3種β-半乳糖苷酶O158、AO和O76的最適作用溫度均為50 ℃。當溫度低于50 ℃或者高于50 ℃時,酶活力會顯著下降,溫度變化對三者酶活力影響都較大。

重組酶的熱穩定性結果匯總于圖4B。在不同的溫度下孵育1 h后,重組酶O158、AO和O76殘留的酶活隨著溫度的上升顯著降低。

表4 重組β-半乳糖苷酶的動力學參數Table 4 Kinetic parameters of recombinant β-galactosidases

這三種酶殘留的酶活在80%以上的溫度范圍分別為30～50、30～40、30～40 ℃;殘留酶活小于40%的溫度范圍分別為60 ℃以上、70 ℃以上和70 ℃以上。此外,在30～50 ℃內,O158的穩定性優于AO和O76;而在60～80 ℃時,O158的穩定性低于AO和O76。

圖4 β-半乳糖苷酶的最適作用溫度及pH穩定性Fig.4 The optimal temperature and stability of β-galactosidases注：A：最適作用溫度;B：熱穩定性。

2.2.3 金屬離子和化學試劑對重組β-半乳糖苷酶活性的影響 在酶促反應中加入不同的金屬離子或化學試劑(終濃度10 mmol/L),研究其對O158、AO和O76酶活的影響,結果匯總于表3。只有Mn2+對三者的活性有明顯促進作用。Fe2+、Cu2+對三者的活性有明顯抑制作用,EDTA和Zn2+對三者的活性有輕微的抑制作用。Ca2+、K+對O158和O76有微弱的抑制作用,而對O76的酶活沒有影響。而Co2+、Na+對O158及O76沒有影響,但是對O76有輕微的抑制作用。此外,Mg2+對三者的活性均無影響。

表3 金屬離子及化學試劑 對重組β-半乳糖苷酶活性的影響Table 3 Effect of metal ions and chemicals on enzymatic activity of recombinant β-galactosidases

2.2.4 米曲霉β-半乳糖苷酶動力學參數與比較 以不同濃度的乳糖為底物,其它條件保持不變,測定酶的反應速度。采用雙倒數作圖法(Lineweaver-Burk法),分別繪制O158、AO和O76水解乳糖的動力學曲線,求出其動力學參數(表4)。結果表明,O158、AO和O76的Km分別為5.48、5.27和6.21 mmol/L;Vmax分別為0.03、0.05和0.02 mmol/(L·s);kcat分別為16.5、27.5和6.2 1/s;kcat/Km分別為3.0、5.2和1.0 L/(mmol·s)。其中,AO的Km最小,Vmax、kcat以及kcat/Km均最大,說明AO對底物乳糖的親和力大于O158和O76,且具有更高的催化效率。

2.3 米曲霉β-半乳糖苷酶的底物特異性與催化特征分析

分別以乳糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、戊聚糖、低聚木糖及果膠為底物,分別在O158、AO和O76的最適反應pH(分別為4.0、5.5和7.0)和最適作用溫度(均為55 ℃)下反應12 h后取樣,采用高效液相色譜儀分析反應產物,結果匯總于表5。O158、AO和O76均對乳糖表現出水解與轉苷活性,對其它測試底物則未表現出任何活性。其中,O158、AO和O76對乳糖的水解率分別為27.4%、19.0%和51.1%;對乳糖的轉苷率分別為3.2%、3.1%和2.3%(圖5)。

表5 米曲霉β-半乳糖苷酶的底物作用特征Table 5 Substrate specificity of A. oryzae β-galactosidases

注:+:具有活性,-:沒有活性,/:沒有測定。

圖5 重組β-半乳糖苷酶作用于乳糖的產物分析Fig.5 HPLC profile of lactose catalyzed by recombinant β-galactosidases

3 結論與討論

米曲霉乳糖酶常被用于處理牛奶、酸奶和生產低聚半乳糖,是商業化乳糖酶制劑的主要來源之一[14]。但是,國內外還沒有系統研究米曲霉β-半乳糖苷酶酶系的酶學特征的報道。本研究對米曲霉的4個可能的β-半乳糖苷酶基因進行了分子克隆與表達、酶學性質等方面的研究,首次解析了它們之間的異同點。

米曲霉基因組中含有4個β-半乳糖苷酶開放閱讀框,其中3個基因O158、AO和O76已經被成功地克隆和表達。通過測序結果分析,O158的測序結果有差異,AO與O76的測序結果一致(表2)。然而,以米曲霉CICIM F1005F的cDNA和基因組DNA為模板均沒有將β-半乳糖苷酶基因O42擴增成功。氨基酸序列比對的結果顯示,AO和O158的活性中心均是Glu200(酸/堿催化劑)和Glu298(親和劑)(圖2)。它們的催化反應遵循兩步反應的雙替換機制(two-step double-displacement mechanism),包括糖基-酶復合物過渡態的形成和水解,每步反應均通過酸堿催化完成[15]。而O76 與AO中的Glu200和Glu298對應的氨基酸殘基分別為Pro196和Ala307,且比它們少了一個結構域。進一步通過BLAST分析發現,與O76氨基酸序列相似度較高(≧40%)的β-半乳糖苷酶都沒有相關研究報道,它可能是一種新的真菌β-半乳糖苷酶。

米曲霉來源的β-半乳糖苷酶最適作用pH較低,一般在2.5和5.5之間;最適作用溫度較高,通常為45～60 ℃[4]。本研究中的重組β-半乳糖苷酶O158、AO和O76的最適作用溫度均為50 ℃,在30～40 ℃有較高的熱穩定性。O158和AO的最適作用pH分別為4.0、5.5,pH穩定范圍分別為4.0～8.5和3.5～7.5。而O76最適pH為7.0,偏中性,與酵母和細菌β-半乳糖苷酶的最適反應pH接近;pH穩定范圍是5.0～8.0。這三種重組酶的最適作用pH以及pH穩定性差別較大,綜合了真菌和細菌類β-半乳糖苷酶的優勢。其中,AO的最適作用pH略高于已報道的最適反應pH(5.2),而最適作用溫度則低于文獻報道(60 ℃)[6],這可能是由于所用的底物不同造成的。除了O158,AO和O76的最適作用pH均高于A.oryzaeRT102以及A.oryzaeh26-10-7β-半乳糖苷酶的最適作用pH(分別為4.8和4.75)[16-17];這三種重組酶的最適作用溫度高于A. oryzae RT102β-半乳糖苷酶的最適作用溫度(46 ℃)[16],卻低于A.oryzaeh26-10-7β-半乳糖苷酶的最適作用溫度(60 ℃)[17]。

本研究中的重組β-半乳糖苷酶O158、AO和O76的Km分別為5.48、5.27、6.21 mmol/L,遠高于A.oryzaeh26-10-7以及A.oryzaeβ-半乳糖苷酶對乳糖的Km值(分別為69.36 mmol/L[17]和50.0 mmol/L[18]),對天然底物乳糖表現出更高的底物親和力。但是,這三者的Km均高于MushroomsA.oryzae(Sigma)β-半乳糖苷酶的Km(1.6 mmol/L);它們的Vmax均低于該β-半乳糖苷酶的Vmax(62.8 μmol/(min·mg protein))[19]。

β-半乳糖苷酶一般具有水解和轉苷兩種活性[2]。近年來,利用β-半乳糖苷酶的轉苷活性生產具有特定生理功能的低聚糖已成為新的研究內容[20-21]。與其它研究報道相似,本研究所克隆與表達的3種β-半乳糖苷酶皆對其天然底物乳糖表現出水解和轉苷活性,對其它天然底物均沒有水解和轉苷活性。此外,雖然戊聚糖、低聚木糖及果膠中含有半乳糖苷鍵,但是O158、AO和O76對它們均不起作用(表3)。

本文通過現代生物信息學與分子克隆等技術對米曲霉來源的4個β-半乳糖苷酶在畢赤酵母中進行了克隆和表達,并系統地解析了其酶學性質。其中重組酶O158和AO的最適pH偏酸性,且對乳糖有較好的親和力和催化效率,適用于干酪和酸乳清等低pH的加工過程中。而偏中性的O76則可用于水解乳制品工業中的乳糖等。此外,它們對乳糖均具有較高的轉糖基活性,這為其用于合成具有特定生理功能的新物質提供了可能。

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College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China)

Inthisstudy,threegenes(O158,AOandO76)encodingβ-galactosidasesfromAspergillus oryzaewereclonedandexpressed.TherecombinantsGS115(pPIC-O158),GS115(pPIC-AO)andGS115(pPIC-O76)wereconstructedandtherecombinantenzymesweresubsequentlyobtained.FurtheranalysisshowedthatthepHoptimaofO158,AOandO76were4.0,5.5and7.0,respectively,andtheiroptimaltemperatureswereall50 ℃.TheserecombinantenzymeswerestableinthepHrangeof5.0～7.5orattemperaturesrangingfrom30to40 ℃.TheiractivitieswereenhancedbyMn2+,butsignificantlyinhibitedbyFe2+,Cu2+andZn2+.O158,AOandO76onlyexhibitedhydrolyticandtransgalactosylactivitiestowardlactose.TheaffinityandcatalyticefficiencyofAOtowardslactosewerehigherthanthoseofO158andO76.Besides,O42wasnotexistedintheteststrainalthoughitwaspredictedinthereferencegenomesequence.Theheterologousexpressionandbiochemicalpropertiesofthreeβ-galactosidasesfromA. oryzaewerecomprehensivelyinvestigatedinthisstudy,whichlaysasolidfoundationfortheirlarge-scaleproductionsandindustrialapplications.

Aspergillus oryzae;β-Galactosidase;Molecularcloning;Biochemicalproperties

2016-05-10

董自星(1986-)，男，博士，助理研究員，研究方向：酶工程與技術，E-mail:star1987.com@163.com。

*通訊作者:王正祥(1964-)，男，博士，教授，研究方向：工業微生物資源與開發、工業酶制劑的高效表達與分子改造,E-mail:zx.wang@tust.edu.cn。

TS201.3

A

1002-0306(2016)21-0172-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.025