雙柱串聯(lián)反相高效液相色譜測(cè)定蘋果醋中的有機(jī)酸

熊賢平,高紅波,羅培余,李煒炤,郭新光,吳 暉,鐘其頂,宋全厚

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640;2.天地壹號(hào)飲料股份有限公司,廣東江門 529000；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京 100015)

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雙柱串聯(lián)反相高效液相色譜測(cè)定蘋果醋中的有機(jī)酸

熊賢平1,2,高紅波3,羅培余2,李煒炤2,郭新光3,吳 暉1,*,鐘其頂3,宋全厚3

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640;2.天地壹號(hào)飲料股份有限公司,廣東江門 529000；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京 100015)

建立了雙柱串聯(lián)高效液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定蘋果醋中6種有機(jī)酸的測(cè)定方法。樣品用水稀釋后采用雙C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)進(jìn)行色譜分離,流動(dòng)相為0.01 mol/L的磷酸氫二銨溶液(pH2.7),流速1.0 mL/min,在紫外檢測(cè)器波長為210 nm處進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:在優(yōu)化色譜條件下,6種有機(jī)酸在線性范圍內(nèi)相關(guān)性良好,相關(guān)系數(shù)R2≥0.999,各添加水平回收率在92.82%～102.12%之間,方法的精密度均小于5.0%,方法的檢出限在0.1～0.7 mg/L范圍。本方操作簡單、準(zhǔn)確,適合于分析蘋果醋中有機(jī)酸的含量。

高效液相色譜,雙柱串聯(lián),蘋果醋,有機(jī)酸

蘋果汁或蘋果濃縮汁為原料,發(fā)酵成蘋果酒,然后接入醋酸菌再發(fā)酵成蘋果醋。蘋果醋優(yōu)于傳統(tǒng)食醋,兼有水果和食醋的營養(yǎng)保健功能,集營養(yǎng)、保健、食療等功能為一體[1-5]。有機(jī)酸作為蘋果醋的重要質(zhì)量組分之一,其有機(jī)酸的種類、含量和比例,與釀造使用蘋果(汁)的品種、產(chǎn)地、釀造工藝條件、貯藏條件等密切相關(guān),并且影響著蘋果醋的口感,國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 30884-2014《蘋果醋飲料》[6]對(duì)有機(jī)酸的含量有明確的規(guī)定,因此準(zhǔn)確測(cè)定果醋中有機(jī)酸的種類和含量,對(duì)于優(yōu)化蘋果醋發(fā)酵工藝、提高蘋果醋的品質(zhì)具有十分重要的意義。目前,有機(jī)酸的分析測(cè)定方法主要包括定高效液相色譜法[7-14]、離子色譜法[15-18]、氣相色譜法和氣相質(zhì)譜[19-21]等,其中,氣相色譜法測(cè)定有機(jī)酸(除乙酸外)一般需要酯化衍生反應(yīng)一系列過程,操作繁瑣、耗時(shí);離子色譜法具有樣品處理簡單、選擇性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn),但是儀器成本較高普及程度低,且企業(yè)日常大批量樣品的檢測(cè)中,其增加了操作步驟和方法的測(cè)定費(fèi)用;目前高效液相色譜法具有分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),是食品中有機(jī)酸測(cè)定普遍采用的方法。

本文參考國標(biāo)方法,采用不同的C18色譜柱和雙C18柱串聯(lián)測(cè)定蘋果醋有機(jī)酸蘋果醋,詳細(xì)對(duì)比研究蘋果醋樣品直接稀釋后測(cè)定的干擾情況,探索雙柱串聯(lián)測(cè)定果醋中有機(jī)酸的快速方法。

表1 不同色譜柱測(cè)定結(jié)果比較Table 1 Comparison the results of Organic acids using different columns

注:“ND”表示“未檢出”;“-”表示存在干擾。1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品:代表性蘋果醋樣品和樣品1～13號(hào)(1、2，5～13號(hào)為釀造食醋，3、4號(hào)為配制食醋) 均購于超市和網(wǎng)絡(luò)銷售平臺(tái);試劑:酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸等純度均≥99% 購于Sigma-Alrich;磷酸氫二銨、磷酸等均為分析純?cè)噭?購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水 為二次蒸餾水。

島津高效液相色譜儀LC-15C型號(hào),色譜柱1:XBP C18(250 mm×4.6 mm×5 μm,天津艾杰爾);色譜柱2:Atlantis T3 C18(250 mm×4.6 mm×5 μm,Waters);配紫外檢測(cè)器;pH計(jì) PB-10型,賽多利斯;純水系統(tǒng) Spring-RIO型,廈門銳思捷科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制:準(zhǔn)確稱取酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸各0.100 g,乙酸1.000 g,用水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

1.2.2 樣品的前處理 蘋果醋樣品用水稀釋2～10倍,0.45 μm微孔濾膜過濾,濾液供測(cè)定,當(dāng)乙酸含量超出線性范圍時(shí),可以進(jìn)一步增加稀釋倍數(shù),使其含量在線性范圍內(nèi)后測(cè)定。

1.2.3 色譜條件 單柱法色譜條件:參考文獻(xiàn)[13]。雙柱法串聯(lián)色譜條件:色譜柱2雙柱串聯(lián),流動(dòng)相、流速、檢測(cè)波長和柱溫等條件參見參考文獻(xiàn)[13]。

1.2.4 樣品測(cè)定 準(zhǔn)確吸取一定量的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用水逐級(jí)稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,用0.45 μm的濾膜過濾后,按照色譜條件進(jìn)行測(cè)定,以各有機(jī)酸的峰面積為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線;將樣品待測(cè)液按照色譜條件測(cè)定,根據(jù)各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間,與待測(cè)樣品中組分保留時(shí)間進(jìn)行比較定性,由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得待測(cè)液中各有機(jī)酸的濃度,結(jié)合樣品稀釋倍數(shù)得到樣品中各有機(jī)酸的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化和方法間比較與誤差分析

參考國標(biāo)[13-14]對(duì)XBP C18、Atlantis T3 C18單柱和雙柱Atlantis T3 C18色譜條件進(jìn)行優(yōu)化,選擇符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 30884-2014飲料用蘋果醋的代表性樣品[6],采用相同的樣品處理方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線、分別用方法中的單色譜柱條件、雙柱色譜條件測(cè)定有機(jī)酸含量,并結(jié)合樣品測(cè)定結(jié)果和各對(duì)應(yīng)的色譜圖進(jìn)行方法比較和誤差分析,有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1(A、C、E),代表性蘋果醋樣品色譜圖見圖1(B、D、F),不同色譜條件測(cè)定結(jié)果見表1。

由表1中蘋果醋的測(cè)定結(jié)果,結(jié)合樣品對(duì)應(yīng)的色譜圖分析可以看出:6種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品都能達(dá)到良好的分離,見圖1(A、C和E);樣品直接稀釋后采用不同色譜柱(XBP C18、Atlantis T3 C18)各有機(jī)酸的分離效果不同,有的組分存在較大的干擾,如圖1B中的琥珀酸和圖1D中的酒石酸明顯存在雜質(zhì)干擾峰;乙酸、檸檬酸和乳酸:雙柱和不同的單C18色譜柱法測(cè)定結(jié)果基本一致;琥珀酸:單柱T3 C18和雙柱串聯(lián)法的測(cè)定結(jié)果一致,XBP C18的琥珀酸色譜峰包含雜質(zhì)峰,因此測(cè)定結(jié)果約是其它兩個(gè)結(jié)果的10倍;蘋果酸:XBP C18和雙柱串聯(lián)法測(cè)定結(jié)果一致,單T3 C18的測(cè)定結(jié)果比其它兩個(gè)測(cè)定結(jié)果高出約50%,說明圖1D中蘋果酸色譜峰中包含雜質(zhì)干擾;酒石酸:單T3 C18的酒石酸存在干擾,色譜積分存在困難,另外兩個(gè)測(cè)定結(jié)果基本一致。

以上不同色譜柱測(cè)定結(jié)果和色譜圖分析比較可以看出:相對(duì)單C18色譜柱,雙柱C18色譜柱中各有機(jī)酸分離度得到很大提高,與干擾組分得到有效分離,測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。

2.2 雙柱串聯(lián)法方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限 將不同濃度的有機(jī)酸混標(biāo),按照實(shí)驗(yàn)方法中雙柱法串聯(lián)色譜條件測(cè)定,以各有機(jī)酸的質(zhì)量濃度x(mg/L)對(duì)其峰面積y求得線性回歸方程,各有機(jī)酸在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999;以信噪比(S/N)為3測(cè)得各有機(jī)酸的最低檢出限在0.1～0.7 mg/L范圍,結(jié)果見表2。

圖1 不同色譜柱的測(cè)定機(jī)酸混標(biāo)和蘋果醋液相色譜圖 Fig.1 Different columns-HPLC and chromatograms of organic acids standards mixtures and in apple vinegar注:1-酒石酸;2-蘋果酸;3-乳酸;4-乙酸;5-檸檬酸;6-琥珀酸,A -有機(jī)酸混標(biāo)色譜柱1,B -蘋果醋色譜柱1,C -有機(jī)酸混標(biāo)色譜柱2,D-蘋果醋色譜柱2,E-有機(jī)酸混標(biāo)雙色譜柱,F -蘋果醋雙色譜柱。

表2 6種有機(jī)酸的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear range,calibration curves,correlation coefficients,and limit of detection of six organic acids

注:y-峰面積;x-濃度(mg/L)。

表3 方法的精密度實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 3 Results of precision experiments(n=6)

2.2.2 方法精密度考察 平行取同一樣品六份,在按照實(shí)驗(yàn)方法處理后,注入液相色譜儀測(cè)定,由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品含量,計(jì)算方法的精密度。如表3所示,有機(jī)酸的RSD值在0.22%～4.23%之間,表明本文建立的HPLC測(cè)定有機(jī)酸含量的方法精密度良好。

2.2.3 加標(biāo)回收率 取蘋果醋分別加入三個(gè)不同濃度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定樣品的回收率,由表4可見,各有機(jī)酸的加標(biāo)回收率為92.82%～102.12%,表明本方法有機(jī)酸回收率高、準(zhǔn)確性好。

表4 蘋果醋中各有機(jī)酸不同添加水平回收率(n=3)Table 4 Average recoveries of six organic acids spiked in apple vinegar(n=3)

表5 市售蘋果醋的有機(jī)酸測(cè)定結(jié)果Table 5 Results of six organic acids spiked in apple vinegar

注:“ND”表示“未檢出”。2.3 市銷蘋果醋有機(jī)酸含量調(diào)查評(píng)估

國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 30884-2014《蘋果醋飲料》對(duì)蘋果醋使用的原輔料、特征性有機(jī)酸進(jìn)行了規(guī)定,明確提出飲料用蘋果醋生產(chǎn)過程中不得使用糧食及副產(chǎn)品、糖類、酒精、有機(jī)酸及其他碳水化合物類輔料,飲料用蘋果醋中的有機(jī)酸除乙酸外,同時(shí)含有蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸等種類,其中蘋果酸含量不低于0.08%(總酸按4%計(jì)時(shí)),酒石酸、琥珀酸、檸檬酸應(yīng)全部檢出;乳酸的含量不高于0.05%[6]。

采用雙柱法測(cè)定市場上常見銷售不同廠家蘋果醋的有機(jī)酸含量,評(píng)估其是否符合飲料用蘋果醋要求,發(fā)現(xiàn)各廠家生產(chǎn)的蘋果醋中有機(jī)酸種類與含量明顯差異,樣品3、4號(hào)為配制食醋,其乙酸含量為2.5 g/100 mL左右,低于釀造食醋要求的最低限量3.5 g/100 mL[22]。樣品1、2,5～13號(hào)為釀造食醋,其中樣品2、5、6號(hào)在相同酸度的情況下蘋果酸含量比較低,蘋果酸低會(huì)使蘋果醋缺乏清爽口感;樣品1號(hào)缺乏酒石酸；樣品6號(hào)缺乏酒石酸、檸檬酸、琥珀酸等不揮發(fā)酸,而琥珀酸有鮮味,且檸檬酸、琥珀酸、檸檬酸等不揮發(fā)性酸在一定程度上可以緩沖乙酸的刺激性[23];另外樣品5、7號(hào)乳酸含量高于飲料用蘋果醋中規(guī)定乳酸含量不高于0.05%;因此只有樣品8號(hào)～13號(hào)符合飲料用蘋果醋對(duì)有機(jī)酸的要求,適用于蘋果醋飲料的生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用雙柱串聯(lián)高效液相色譜法-紫外檢測(cè)器建立了蘋果醋中有機(jī)酸的快速測(cè)定方法,對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,各添加水平回收率為92.82%～102.12%,方法的精密度均小于5.0%,該方法較傳統(tǒng)國標(biāo)方法,雙柱串聯(lián)極大提高了色譜柱柱效,樣品中有機(jī)酸與雜質(zhì)干擾組分得到有效的分離,方法的準(zhǔn)確度及回收率得到很大改善,同時(shí)相對(duì)固相萃取凈化方法,省去固相萃取的步驟,可大大減少了檢測(cè)工作量和試劑消耗,為蘋果醋中有機(jī)酸的測(cè)定提供了一種有效的途徑。

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Determination of the concentrations of organic acid in apple vinegar by high performance liquid chromatography with two coupled columns

XIONG Xian-ping1,2,GAO Hong-bo3,LUO Pei-yu2,LI Wei-zhao2,GUO Xin-guang3,WU Hui1,*,ZHONG Qi-ding3,SONG Quan-hou3

(1.School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.China National Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing100015,China;3.Tian Di No.1 Beverage Inc.,Jiangmen 529000,China)

Asensitivemethodforthedeterminationofsixorganicacidsinapplevinegarbyhigh-performanceliquidchromatographicwithtwocoupledcolumnswasestablished.Afterdilutedwithdistilledwater,thesampleswereanalyzedbytwocoupledC18columns(4.6mm×250mm×5μm).Themobilephaseforisocraticelutionwas0.01mol/L(NH4)2HPO4buffer(pH2.7),theflowaratewas1.0mL/min,andthedetectionwavelengthwas210nm.Thecorrelationcoefficientofsixorganicacidswasgreaterthan0.999inlinearrange.Theprecisionofthesixorganicacidswerelessthan5.0%.Therecoverieswereintherangeof92.82%～102.12%,andthelimitofdetectionwereintherangeof0.1～0.7mg/L.Themethodwasrapid,accurateandreliable,andcanbeusedtodetermineorganicacidinapplevinegar.

highperformanceliquidchromatography(HPLC);twocoupledcolumns;applevinegar;organicacid

2016-08-01

熊賢平(1970-)，男，碩士，研究生，主要從事食品生產(chǎn)、質(zhì)量安全與發(fā)酵技術(shù)研究，E-mail：xiongxp@tdyh.com.cn。

*通訊作者:吳暉(1967-)，男，博士，教授，主要從事食品安全研究，E-mail：fehwu@scut.edu.cn。

TS207.3

A

1002-0306(2016)21-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.049