SA、MeJA和ACC處理對甘藍型油菜葉角質層蠟質組分、結構及滲透性的影響

李 帥 趙秋棱 彭 陽 徐 熠 李加納 倪 郁

西南大學農學與生物科技學院, 重慶 400715

SA、MeJA和ACC處理對甘藍型油菜葉角質層蠟質組分、結構及滲透性的影響

李 帥 趙秋棱 彭 陽 徐 熠 李加納 倪 郁*

西南大學農學與生物科技學院, 重慶 400715

角質層蠟質與植物適應逆境脅迫有關。本研究以甘藍型油菜中雙11為試材, 在五葉期分別對其進行200 μmol L-1水楊酸(SA)溶液、1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC)溶液以及100 μmol L-1茉莉酸甲酯(MeJA)溶液澆灌處理, 分析油菜葉角質層蠟質組分含量、結構以及角質層滲透性的變化。結果表明, MeJA處理7 d后, 烷類、二級醇類、酮類、醛類含量以及蠟質總量與對照相比均顯著增加, 而處理14 d后, 所有蠟質組分含量及蠟質總量與對照相比均顯著減少; SA與ACC處理早期對葉片蠟質沉積無顯著影響(SA處理14 d后, 一級醇類、醛類及未知組分含量顯著減少)。SA、MeJA和ACC處理21 d后均顯著誘導油菜葉片角質層蠟質的沉積, 蠟質組分中烷類、酮類、醛類顯著增加, 其中C29烷、C29酮、C30醛是被SA、MeJA和ACC誘導的主要蠟質組分, 暗示烷類、酮類、醛類可能與這些信號分子介導的抗(耐)性反應密切相關。掃描電鏡結果顯示, SA處理減少葉表皮蠟質桿狀結構, 且部分區域熔融; MeJA與ACC處理增加油菜葉表皮蠟質的晶體結構密度。角質層蠟質的沉積與結構變化降低角質層滲透性, 減緩葉片的水分散失, 其中 C29烷的特異性增加可能是造成葉片失水率降低的主要原因。

甘藍型油菜; 角質層蠟質; 水楊酸(SA); 茉莉酸甲酯(MeJA); 乙烯(ETH)

植物在發育過程中經常會遭受各種生物和非生物脅迫, 對于抵抗和適應這些逆境脅迫, 植物進化中形成了一套復雜的防御網絡。植物激素在這個防御網絡中起到了十分重要的作用, 當遇到逆境脅迫時, 植物體內的激素水平會發生變化以啟動和調節某些與逆境適應相關的生理生化過程來誘導抗(耐)逆性的形成。植物角質層是植物與外界環境的第一接觸面, 是植物應對生物和非生物逆境的重要屏障,其中的角質層蠟質是由堆積在角質層最外面有獨特三維結構的表皮蠟質和填充于角質中的內部蠟質組成, 具有多種生理和生態學功能。環境因素如水分脅迫、NaCl、紫外線輻射、低溫、病害脅迫等會導致植物蠟質含量和結構的改變[1-4]。角質層蠟質的沉積也受植物激素的調控。例如, 乙烯(ETH)能夠誘導柑桔表皮蠟質含量的增加及結構變化, 阻止Penicillium digitatum入侵[5]。ETH合成受抑制時, 延遲了蘋果表皮中特定蠟質組分的合成[6]。脫落酸(ABA)誘導了獨行菜葉片中大于 C26的脂肪族物質含量的增加, 其耐旱性隨之增強[7]。水分脅迫下, ABA通過上調轉錄因子MYB96的表達而促進擬南芥幾個蠟質合成基因的表達, 最終促進了蠟質的積累[8]。這些結果表明, 植物激素作為信號分子可能通過介導角質層蠟質的沉積而影響植物對逆境脅迫的響應。

ETH是一種重要的植物激素, 在植物對生物脅迫和非生物脅迫的耐受性和抗性中發揮重要作用。水楊酸(SA)與茉莉酸類物質(JAs)是廣泛存在于高等植物體內的一種新型植物生長調節物質, 在調節植物生長發育、光合特性、抗逆反應中起著重要的作用。本研究分析了SA、茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯合成促進劑 1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC)處理對油菜葉角質層蠟質組分含量、結構以及角質層滲透性的影響, 初步揭示了這些信號分子與植物角質層蠟質沉積的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜中雙11, 由西南大學油菜工程中心提供。采用盆栽, 每盆(7 cm × 8 cm)裝土0.2 kg [草炭土與弱酸性黃壤1∶1 (w/w)], 移栽1株幼苗, 于網室種植, 常規管理, 保證土壤相對含水量不低于60%。待幼苗長出5片真葉時進行激素處理。

1.2 激素處理

用1%的MS溶液分別配制濃度為200 μmol L-1的SA溶液、ACC溶液以及100 μmol L-1的MeJA溶液。當幼苗長至 5片真葉時, 分別取上述溶液澆灌于土壤中, 每2 d一次, 每次澆灌20 mL。對照用1%的MS溶液澆灌。在激素處理的7、14和21 d后分別取其葉片分析蠟質組分含量; 在處理21 d后取葉片以掃描電鏡觀察蠟質結構及檢測角質層滲透性。

1.3 葉角質層蠟質的提取與組分分析

采集植株自上而下第 2片展開葉片, 置含 30 mL氯仿的培養皿浸提30 s, 氯仿中預先加入已知濃度的 C16烷作為內標。用氮吹儀蒸干浸提液, 再于80℃下用100 μL的BSTFA衍生1 h, 將BSTFA在氮吹儀中蒸干后, 將產物溶于100 μL正己烷中。用氣相色譜儀(福立 9790II, 浙江)分析測定蠟質組分及含量。具體程序及參數設置參考倪郁等[2]方法。根據FID的峰面積對蠟質定量, 同時利用GC-MS (島津 GC2010MS, 日本)鑒定蠟質組分, 參考內標正十六烷計算各蠟質組分的實際含量。用單位葉面積的微克數(μg cm-2)表示蠟質含量。利用數字化掃描儀(EPSON V750)和WinFOLIA葉片專業圖像分析軟件(Regent Instrument Inc., Canada)測定并記錄葉面積。每處理4個重復。

1.4 葉角質層蠟質結構的掃描電鏡觀察

采集植株自上而下第 3片展開葉片, 干燥后從距中間葉脈0.1 cm處剪取樣品, 用碳導電膠布固定在載物臺上, 再將樣品放入金屬離子濺射儀(E1010, Hitachi)內噴鍍導電膜, 材料鍍金后于掃描電子顯微鏡(S3000-N, Hitachi)下觀察形態。每處理4個重復。

1.5 角質層水分損失的測定

參考 Kosma等[1]方法, 將各處理材料于黑暗環境中培養6 h, 以使氣孔關閉, 采集植株葉片于蒸餾水中黑暗處理1 h, 稱其重量, 作為葉片飽和重量。然后將葉片放入20℃的培養箱(黑暗), 每15 min取出葉片稱重一次。150 min后將葉片取出放在70℃的烘箱中干燥24 h, 稱其干重。水分損失率 = (飽和重量 - 每個時間點的重量)/葉片含水量, 葉片含水量 = 飽和重量 - 干重。每處理8個重復。

2 結果與分析

2.1 甘藍型油菜葉角質層蠟質含量

表1表明, SA處理7 d后, 角質層各蠟質組分含量與蠟質總量均與對照無顯著差異; 處理 14 d后,一級醇類、醛類及未知組分含量顯著減少, 其中蠟質優勢組分C24酸、C28醛、C30醛含量顯著降低,但蠟質總量無顯著變化; 處理21 d后, 烷類、酮類、醛類含量以及蠟質總量均比對照顯著增加, 其中蠟質優勢組分C29烷、C29酮、C24酸、C28醛、C30醛含量增加顯著(圖1)。

MeJA處理7 d后, 烷類、二級醇類、酮類、醛類含量以及蠟質總量均比對照顯著增加, 其中蠟質優勢組分C29烷、C31烷、C29二級醇、C29酮、C28醛、C30醛含量增加顯著(表 1和圖 1); MeJA處理14 d后, 所有蠟質組分含量及蠟質總量均比對照顯著減少; 而在處理 21 d后, 烷類、酮類、酸類、醛類含量以及蠟質總量顯著增加, 其中蠟質優勢組分C29烷、C29酮、C20酸、C30醛含量增加顯著。

ACC處理7 d、14 d后, 角質層各蠟質組分與蠟質總量與對照相比均無顯著變化(表1和圖1); 處理21 d后, 烷類、酮類、醛類以及蠟質總量均比對照顯著增加, 其中蠟質優勢組分C29烷、C29酮、C24酸、C28醛、C30醛增加顯著。

2.2 油菜葉表皮蠟質結構

甘藍型油菜中雙11葉表皮蠟質結構類型以桿狀、顆粒狀(小型片狀)為主(圖2)。SA處理(21 d)后,葉片表皮蠟質桿狀結構減少, 部分區域熔融, 晶體結構邊界不清晰。MeJA與ACC處理(21 d)后, 葉表皮蠟質的晶體結構密度增加, ACC處理后桿狀結構長度增加(圖2)。

2.3 油菜葉角質層滲透性

SA、MeJA和ACC處理21 d后, 取油菜葉片測定其角質層水分損失率。如圖3所示, 與對照相比, 3種處理均使葉片水分損失速率降低, 在150 min時, SA、MeJA和ACC處理失水率與對照相比分別減少了33%、30%和35%, 表明3種處理均減緩了甘藍型油菜葉片的水分散失, 角質層滲透性降低。

表1 SA、MeJA和ACC對油菜葉角質層蠟質含量的影響Table 1 Effects of SA, MeJA, and ACC treatment on amounts of leaf cuticular wax in Brassica napus (μg cm-2)

圖1 SA、MeJA和ACC處理對油菜葉角質層蠟質主要組分含量的影響Fig. 1 Effects of SA, MeJA, and ACC treatments on contents of major individual leaf cuticular wax constituents in B. napus數據柱上*表示在P ＜ 0.05水平上差異顯著。Bars with asterisks are significantly different at P ＜ 0.05 according to Student’s t-test.

3 討論

3.1 甘藍型油菜葉角質層蠟質的組成

甘藍型油菜葉角質層蠟質主要由長鏈脂肪酸(C＞18)和由長鏈脂肪酸衍生而來的醛、一級醇、二級醇、烷、酮、酯等組成, 其中由蠟質脫羰途徑生成的C29烷、C29酮與C29二級醇是主要的蠟質組分。這與十字花科擬南芥(A. thaliana)、甘藍(B. oleracea)等角質層蠟質組成相似[9]。植物角質層蠟質的組分、含量等會隨著植物組織器官及發育時期的變化而改變。例如, 瑞士石松(Pinus cembra)的蠟質沉積隨著葉片的發育而減少[10]。本研究中, 雖然蠟質總量隨著葉片發育而減少, 但烷類、二級醇類、酮類、醛類等在蠟質總量中所占的比重隨葉片的發育而呈增加趨勢。

3.2 外源SA、MeJA和ACC誘導的蠟質組分變化提高了植株的抗(耐)逆性

圖2 SA、MeJA和ACC處理對油菜葉表皮蠟質晶體結構的影響Fig. 2 Effects of SA, MeJA, and ACC treatment on the crystalloid structures of leaf cuticular wax in B. napusA～B： 對照; C～D： SA處理; E～F： MeJA處理; G～H： ACC處理; A、C、E、G： 標尺=100 μm; B、D、F、H： 標尺=10 μm。A-B： control; C-D： SA; E-F： MeJA; G-H： ACC; A, C, E, and G：bar=100 μm; B, D, F, and H： bar=10 μm.

圖3 SA、MeJA和ACC處理對油菜葉角質層水分損失的影響Fig. 3 Water loss rates of isolated leaves from B. napus treated by SA, MeJA, and ACC

植物激素作為植物體內的痕量信號分子, 調節著植物體對環境的應答。近年來發現SA、JAs和ETH廣泛參與調控植物防御反應與植株形態發育相關的多種生物學過程, 從而影響著植物應對不良環境的能力[11-13]。本研究結果表明, 外源SA、MeJA和ACC處理能夠誘導油菜葉片角質層蠟質的沉積, 降低角質層滲透性, 而蠟質組分的變化可能是造成其水分散失減緩的主要原因。SA、MeJA、ACC處理21 d時, 油菜葉角質層中烷類、酮類、醛類顯著增加, 其中C29烷、C29酮、C30醛是被SA、MeJA、ACC誘導增加的主要蠟質組分, 暗示烷類、酮類、醛類可能與這些信號分子介導的抗(耐)性反應密切相關。Seo等[8]研究發現, 擬南芥角質層蠟質中烷類和醛類物質的增加提高了植株的抗旱能力。番茄ps突變體果實表皮蠟質中幾乎不含烷類和醛類, 而果實表面失水率比野生型快5～8倍[14]。乙烯信號的轉導最后以乙烯響應因子激活或抑制相關基因的表達, 參與防衛反應的誘導[15]。擬南芥乙烯響應類型的轉錄因子 WIN1/SHN1在轉基因植株中超表達時誘導蠟質脫羰基途徑產物(烷類、二級醇類、酮類)的特異性增加, 增強植株的耐旱性[16-17]。SA、MeJA和ACC誘導的油菜葉片角質層中烷類、醛類的增加也可能與生物脅迫抗性有關。菌核病菌侵染甘藍型油菜時,油菜葉表皮蠟質中醛類含量顯著增加[18]。Kosma等[19]研究認為 C21～C27烷類、醛類、C22和 C24脂肪酸及伯醇是小麥抗黑森癭蚊侵擾的重要成分。擬南芥表皮蠟質缺失突變體cer6和cer2中, SA信號途徑標志基因——病程相關蛋白 PR基因的表達顯著降低[20], 暗示植物抗性基因的轉錄水平與蠟質組分密切相關。

本研究中, 油菜葉片蠟質含量在 MeJA處理 7 d、21 d時均顯著增加, 而在處理中期(14 d)顯著減少,這可能與 MeJA對植物生長發育的復雜調控有關。茉莉酸類能夠調節植物生長發育的很多方面, 包括抑制幼苗葉片與主根的生長[21]、促進側根和根毛的產生[22]、誘導表皮毛的形成等[23]。葉片蠟質的沉積變化應該是一個受茉莉酸類調控的綜合效應, 可能與MeJA處理時間、濃度、植物發育階段等有關。

3.3 C29烷積累對植株抗(耐)旱性的貢獻

C29烷是甘藍型油菜含量最高的蠟質組分[24]。本研究中, SA、MeJA和ACC處理21 d后, C29烷含量與對照相比分別增加30%、50%和39%, 而葉片失水率在150 min時與對照相比分別減少33%、30%和35%, 說明C29烷的積累在SA、MeJA和ETH介導的植株抗旱性中可能承擔著重要作用。Weng等[25]發現, C29烷嚴重缺失的擬南芥lacs1、lacs2雙缺失突變體與野生型相比, 角質層滲透性高, 失水率快,對干旱更為敏感。負責烷類物質合成的 CER1在擬南芥中超表達促進了 C29烷的積累, 角質層滲透性降低, 增強了植株對干旱的耐受力[26]。蒺藜苜蓿乙烯響應類型轉錄因子 WXP1在擬南芥中超表達時,促進C29、C31和C33烷類的合成, WXP轉基因植株表現出耐旱性增強[27]。

3.4 角質層蠟質結構

Oliveira等[28]認為角質層結構和蠟質組成是決定植物抗逆性的關鍵因素。ETH誘導的柑桔表皮蠟質結構的變化, 阻止了Penicillium digitatum入侵[5]。本研究掃描電鏡結果顯示, 甘藍型油菜中雙11葉表皮蠟質結構類型以桿狀、顆粒狀(小型片狀)為主。SA、MeJA和ACC處理不同程度地改變了油菜葉表皮蠟質結構。MeJA與ACC處理使油菜葉表皮蠟質的晶體結構密度增加, 這與蠟質含量分析的結果相一致。表皮蠟質層厚度的增加可降低植株失水率,提高其對干旱的耐受力[29]。SA處理后, 葉表皮蠟質桿狀結構減少, 且部分區域熔融(圖2)。植物角質層蠟質包含角質層內部蠟質與表皮蠟質, SA所誘導的葉片蠟質含量的增加可能主要是來自角質層內部蠟質的沉積。在對番茄蠟質研究中發現, 蠟質組成特別是內表皮蠟質起著主要的蒸騰屏障作用[30]。SA與MeJA、ACC所誘導的表皮蠟質結構的差異也可能與它們介導的不同抗逆信號途徑有關。一般而言, 在抗病反應中, 依賴于 SA的防衛反應主要針對活體營養型病原菌, 依賴于JA和ETH的防衛反應主要針對腐生營養型病原菌[31-32]。

4 結論

外源SA、MeJA及ACC處理能夠誘導甘藍型油菜中雙11葉片角質層蠟質的沉積, 降低角質層滲透性, 減緩葉片的水分散失, 其中 C29烷的特異性增加是造成葉片失水率降低的主要原因。蠟質組分中烷類、酮類以及醛類可能與SA、JA和ETH所介導的抗(耐)性反應密切相關。

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Effects of SA, MeJA, and ACC on Leaf Cuticular Wax Constituents, Structure and Permeability in Brassica napus

LI Shuai, ZHAO Qiu-Ling, PENG Yang, XU Yi, LI Jia-Na, and NI Yu*

College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China

Cuticular waxes are related to plant adaptation to environment stress. In the current study, Brassica napus cv. Zhongshuang 11 grown in the soil treated with adding solutions of SA (200 μmol L-1), MeJA (100 μmol L-1), and ACC (200 μmol L-1) wax, were sampled at the five-leaf stage to clarify the effects of SA, MeJA and ETH on adjusting plant cuticular wax deposition. The leaves were used to analyze the amounts of total cuticular wax and wax constituents, wax crystal structure, and cuticular permeability. The amounts of n-alkanes, secondary alcohols, ketones, aldehydes and total cuticular waxes increased significantly when compared with the control at seven days after MeJA treatment, whereas the amounts of all wax constituents and total cuticular waxes significantly decreased at 14 days after MeJA treatment. The application of SA and ACC had no significant influence on cuticular wax deposition at 7 and 14 days after treatments, except for an amount reduction of primary alcohol, aldehyde and unknown constituents for SA treatment at 14 days after treatment. At 21 days after SA, MeJA, and ACC application, the amounts of total cuticular wax, n-alkanes, ketones and aldehyde significantly increased. C29 n-alkane, C29 ketone, and C30 aldehyde were the main cuticular wax constituents induced by SA, MeJA, and ACC application, implying that n-alkane, ketone and aldehyde might be related to the resistance to stresses induced by these signal molecules. Scan electric microscope analysis indicted that the rod-shape structure of cuticular wax in leaf surface reduced and some rods melted under SA treatment. MeJA and ACC application increased the distribution density of wax crystalloids. The cuticular wax deposition and crystal structure altera-tion reduced the cuticular permeability and delayed the leaf water loss. The specific increase of C29 n-alkane might be the main reason for reducing leaf water loss in B. napus.

Brassica napus L; Cuticular wax; Salicylic acid; Methyl jasmonic acid; Ethylene

10.3724/SP.J.1006.2016.01827

本研究由中央高校基本科研業務費專項(XDJK2014B037), 重慶市基礎與前沿研究計劃項目(cstc2016jcyjA0170)和國家自然科學基金項目(31000122)資助。

This study was supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2014B037), the Chongqing Basic and Advanced Research Project (cstc2016jcyjA0170), and the National Natural Science Foundation of China (31000122).

*通訊作者(Corresponding author)： 倪郁, E-mail： nmniyu@126.com

聯系方式： E-mail： 1099908163@qq.com

稿日期)： 2016-03-29; Accepted(接受日期)： 2016-07-11; Published online(

日期)： 2016-08-01.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160801.1037.004.html