高壓氧對阿爾茨海默病模型小鼠認知功能的影響

呂裕霞，李 卉，閆賦琴，冉 敏，李 嚴

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高壓氧對阿爾茨海默病模型小鼠認知功能的影響

呂裕霞1，李 卉2，閆賦琴1，冉 敏3，李 嚴4

目的 探討應用高壓氧對阿爾茨海默病模型小鼠認知功能的影響及相關機制，為治療阿爾茨海默病提供參考。方法 將36只KM雄性小鼠隨機分成正常對照組、阿爾茨海默病模型組和造模后高壓氧處理組。用D-半乳糖(120 mg/kg)和亞硝酸鈉(90 mg/kg)制作阿爾茨海默病小鼠模型，利用Morris水迷宮試驗進行認知功能檢測，并檢測小鼠海馬中的SOD、GSH-Px活性及 MDA含量。結果 與正常對照組小鼠相比較，阿爾茨海默病模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長、跨越平臺次數明顯減少(P< 0.01)；與高壓氧處理前組相比，高壓氧處理后組小鼠的逃避潛伏期縮短、跨越平臺次數增多，均存在著統計學差異(P<0.01)。與正常對照組小鼠相比較，阿爾茨海默病模型組小鼠海馬中SOD和GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.01)；與高壓氧處理前相比，高壓氧處理后，阿爾茨海默病模型小鼠海馬SOD和GSH-Px活性顯著升高，MDA含量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。結論 高壓氧治療可以改善阿爾茨海默病小鼠認知功能，其機制可能與高壓氧治療可以顯著提高機體抗自由基損傷能力有關。

高壓氧； 阿爾茨海默病； 認知功能； 氧化應激

阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一種進展性的神經系統退行性疾病[1]，主要表現為失語、失用、失認，以及人格和行為改變等[2]。該病起病緩慢或隱匿，多見于65歲以上老人[3]。據統計，2011年我國AD患者數為800萬，已成為繼心臟病、腫瘤、腦卒中后第四位引起成人死亡的原因[4]。隨著社會老齡化的發展，老年人口占比越來越大，預計2040年我國阿爾茨海默病患者將達到2200萬，到時阿爾茨海默病必將成為一個不容忽視的公共衛生和社會問題[5]。現代醫學認為，淀粉樣肽假說是AD發病機制的最主要的學說[6]。此外，越來越多的證據表明，氧化應激和自由基損害與AD發病極其密切[7]。因此，本研究擬通過在建立AD小鼠模型基礎上，應用高壓氧干預，探討高壓氧對AD小鼠的療效，并深入討論缺氧在AD發病機制中的作用，為AD的治療提供臨床參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 D-半乳糖(由國藥集團化學試劑有限公司提供，批號：F20090420)；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase , GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)試劑盒(由南京建成生物工程有限公司提供)。實驗動物高壓氧艙(煙臺宏遠G2-Y900-002型)，Morris水迷宮系統、U-2800紫外分光光度計、酶標儀、9Thermo離心機、電子天平、恒溫水浴箱、低溫冰箱。

1.2 實驗動物和分組 日齡60～90 d雄性KM鼠36只，由本單位實驗動物中心提供，體質量30～36 g。適應性飼養1周后，按隨機數字表法隨機分為：正常對照組、阿爾茨海默病模型組和造模后高壓氧處理組，每組12只。

1.3 建立動物模型 36只小鼠自由飲水，控制喂食量[4～5 g/(d·只)]，隨機分為3組，即正常對照組不給以任何藥物，正常飼養。阿爾茨海默病模型組和造模后高壓氧處理組共24只，參照羅煥敏方法[8]，按120 mg/kg D-半乳糖和90 mg/kg亞硝酸腹腔注射建立癡呆模型組，1次/d，持續注射60 d。造模40 d后，所有小鼠進行水迷宮及跳臺實驗，造模小鼠成績與正常對照組相比若有明顯差異，則判定為造模成功，最終24只小鼠全部造模成功。

1.4 高壓氧治療 把AD模型小鼠每日早上9：00放入動物高壓氧實驗艙，先用純氧逐漸加壓到0.18 MPa(1.8 ATA)，再慢慢減壓，用純氧洗艙3次后，再加壓到0.25 MPa(2.5 ATA)，吸氧60 min，經20 min勻速減壓出艙；1次/d，10次為一個療程，中間間隔5 d，再進行第2個療程[9]。

1.5 指標的檢測

1.5.1 認知功能測試 采用Morris水迷宮進行定位航行實驗和空間探索實驗，檢測3組小鼠的認知能力，記錄逃避潛伏期和120 s內小鼠通過虛擬平臺的次數[10]。

1.5.2 檢測SOD、GSH-Px活性及MDA含量 所有行為學測試完成后，處死小鼠，取出小鼠腦組織，分離海馬組織，按照試劑盒說明書測定SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.6 統計學處理 所有數據均采用SPSS 17.0軟件進行處理，各組之間的差異選用單因素方差分析法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮測試結果 與正常對照組小鼠相比較，阿爾茨海默病模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長、跨越平臺次數顯著減少(P<0.01)；與高壓氧處理前相比，高壓氧處理后，小鼠的逃避潛伏期縮短、跨越平臺次數增多，均存在著統計學差異(P<0.01，表1)。

組別平均逃避潛伏期(s)穿越平臺次數正常對照組35.61±2.82②5.83±1.28②阿爾茨海默病模型組52.82±3.56①2.85±0.54①高壓氧處理組(前)50.71±3.28①2.72±0.62①高壓氧處理組(后)41.12±4.17②③5.57±1.41②

注： 與正常對照組比較，①P<0.01； 與高壓氧處理前比較，②P<0.01；與阿爾茨海默病模型組比較，③P<0.01

2.2 SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的檢測 如表2 所示，與正常對照組小鼠相比較，阿爾茨海默病模型組小鼠海馬中SOD、GSH-Px活性明顯降低，MDA含量明顯升高(P<0.01)；與處理前相比，高壓氧處理后，阿爾茨海默病模型組小鼠海馬SOD、GSH-Px活性明顯升高，MDA含量明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.01，表2)。

表2 各組小鼠SOD、GSH-Px活性和MDA含量變化比較 (n=12；

注：與正常對照組比較，①P<0.01； 與高壓氧處理前比較，②P<0.01；與阿爾茨海默病模型組比較, ③P<0.01

3 討 論

老年人由于機體組織再生性細胞減少和體內自由基增加等原因造成機體各組織、器官發生退行性病變，醫學上把這一過程稱為衰老。AD是老年人群中的一種常見病和多發病。有資料表明，5%～15%的老年人有不同程度的阿爾茨海默病癥狀[11]。到目前為止，AD的發病機制尚不完全清楚，但氧化應激作為研究AD發病機制的一個靶點已成為研究的熱點[7]。由于AD發病因素涉及很多方面，單純的藥物治療很難取得很好的效果。由于AD患者腦血流量及耗氧量明顯低于正常同齡人，國外有研究證實，試用高壓氧吸入療法，取得了較好效果[12]。

本研究利用D-半乳糖(120 mg/kg)和亞硝酸鈉(90 mg/k)聯合制作AD小鼠模型。D-半乳糖可造成亞急性衰老模型，并會引起神經元發生一系列退行性改變，包括神經元數目減少，腦組織中SOD和GSH-Px活性下降，MDA水平升高，學習記憶能力下降等。隨后，筆者給阿爾茨海默病模型小鼠吸入0.25 MPa(2.5 ATA)高壓氧，1/d，每次60 min，10次為一個療程，中間間隔5 d，再進行第2個療程，治療前后進行認知能力測驗[9]。結果顯示，與正常對照組小鼠相比較，阿爾茨海默病模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長、跨越平臺次數明顯減少(P<0.01)；與高壓氧處理前相比，高壓氧處理后組小鼠的逃避潛伏期縮短、跨越平臺次數增多，均存在著統計學差異(P<0.01)。有文獻[13]報道，高壓氧可以提高腦組織內含氧量，抑制由于乳酸堆積引起的細胞毒性及細胞部位的炎癥反應，同時促進腦組織內自由基的清除，從而起到抑制腦細胞凋亡的作用。因此，用高壓氧治療，可使AD模型小鼠在適度的擴血管同時，高倍地提高血氧濃度，增加血液與組織間氧分壓差，使外周血液中能量物質充分氧化，提供足夠能量，腦組織含氧量大大提高，明顯改善腦細胞功能狀態，改善AD患者認知能力[14]。

本研究顯示，對AD型小鼠采用高壓氧治療一段時間后，小鼠學習認知能力能得到改善的同時，AD小鼠模型內SOD和GSH-Px活性增高，以及MDA含量下降。AD的發生與腦組織中SOD和GSH-Px活性下降，MDA水平升高以及腦組織的持續缺氧相關，AD模型小鼠體內產生的過量自由基加劇了腦組織脂質過氧化，產生過量的MDA，使腦中MDA水平增加，細胞的合成能力降低，使SOD和GSH-Px活性顯著下降。這一結果提示高壓氧可以改善AD小鼠認知功能，其作用機制很可能是影響腦組織中的SOD和GSH-Px活性及MDA的含量，從而起到抑制氧自由基的生成、保護腦細胞的作用。早期研究證實，SOD、GSH-Px和MDA是衡量機體抗氧化能力三種主要指標[15]。SOD是參與自由基清除的重要酶，主要作用是參與催化產生超氧自由基，清除并阻斷自由基的產生[16]。GSH-Px清除氧自由基則是通過歧化作用，從而保護細胞免受氧化損傷[17]。MDA是氧自由基破壞細胞后的產物，它的存在可以使生物膜壞死，同時抑制SOD的活性，造成自由基的大量產生，從而加重了氧化應激[18]。目前為止，腦組織SOD和GSH-Px活性和MDA含量影響AD模型小鼠認知功能及相關發病機制還未完全闡明，很多研究認為與腦內乙酰膽堿脂酶活性降低有關，此外某些炎性反應、缺血、缺氧等因素加速了AD模型小鼠的神經元變性與死亡，使腦細胞及血管內有異常淀粉樣蛋白沉淀，最終導致腦功能發生障礙。

綜上所述，本研究結果證實，經過高壓氧處理的AD模型小鼠認知功能得到明顯改善，提高了AD模型小鼠海馬中SOD和GSH-Px活性，降低了海馬MDA水平，表明高壓氧可能通過清除AD模型鼠體內自由基發揮改善認知功能作用。但由于AD的發病機制復雜，AD動物模型建立不一定能完全模擬AD患者發病的病理生理過程和臨床表現；此外，如何把握高壓氧的最佳治療時機、高壓氧劑量的選擇，以及需要配合的輔助治療等因素都值得考慮。因此，如何利用高壓氧治療臨床AD患者以及治療后的療效評價仍需進一步研究。

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(2016-07-15收稿 2016-10-20修回)

(責任編輯 梁秋野)

Effects of hyperbaric oxygen on cognitive function in mice with Alzheimer’s

LV Yuxia1，LI Hui2,YAN Fuqin1,RAN Min3，and LI Yan4.1.Procurement Center Office，2.Department of Nutriology,3.Department of Neurology,4.Department of Hyperbaric Oxygenation,General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force,Beijing 100039,China

Objective To investigate the effect of hyperbaric oxygen on cognitive functions of mice with Alzheimer’s and related mechanisms in order to contribute to the treatment of Alzheimer’s disease.Methods 36 KM mice were randomly divided into three groups: normal control group, dementia model group, and hyperbaric oxygen treatment group. D-galactose(120 mg/kg)and sodium nitrite (90 mg/kg)were used to establish a mouse model of Alzheimer’s. The cognitive functions of mice were determined by Morris water maze, the mice’s hippocampus SOD and GSH-Px activity. The MDA level was also determined.Results Compared with the normal control group, the escape latency of the dementia model mice were prolonged, but the times of spanning the platform were significantly reduced (P<0.01). After hyperbaric oxygen treatment, escape latency was shortened while the times of spanning the platform increased. The difference was of statistical significance (P<0.01). Compared with the control group, the hippocampus SOD and GSH-Px activity in dementia model group were significantly reduced, but the MDA level was significantly increased (P<0.01). Afterhyperbaric oxygen treatment, the hippocampus SOD and GSH-Px activity of dementia model mice were significantly increased while the MDA level was significantly reduced. There were significant differences (P<0.01).Conclusions Hyperbaric oxygen therapy can improve cognitive functions in mice with Alzheimer’s, which is possibly because hyperbaric oxygen can significantly improve the body’s ability to combat free radical damage.

hyperbaric oxygen; Alzheimer disease; cognitive function; oxidative stress

呂裕霞，碩士，主治醫師。

100039 北京，武警總醫院：1.采購中心，2.營養科，3.脊髓空洞科護士站，4.高壓氧治療科

李 嚴，E-mail:lvyuxia7118@163.com

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