利用分子標記輔助選擇培育抗稻瘟病粳稻新品系

楊永義+張華+宣寧

摘要：以華130B為稻瘟病抗性基因的供體、圣稻15為受體，通過回交轉育結合分子標記輔助選擇，選育出綜合性狀優良的Pi1單基因株系4個、Pi2單基因株系3個、Pi1和Pi2雙基因聚合系3個。稻瘟病田間抗性自然鑒定結果表明，單基因系抗級為3級，表現為中抗；雙基因聚合系抗級為1級，表現為高抗；而對照圣稻15抗級為7級，表現為高感。說明通過分子標記輔助選擇轉育Pi1和Pi2基因能顯著提高水稻稻瘟病抗性，同時表明雙基因聚合系抗性明顯好于單基因系。

關鍵詞：水稻；稻瘟病；分子標記輔助選擇；抗性鑒定

中圖分類號：S511.2+20.34 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）11-0018-04

Abstract Using Hua 130B as donor of rice blast resistance genes and Shengdao 15 as recipient， ten lines including four lines with Pi1 gene， three lines with Pi2 gene and three double gene-pyramided lines were developed by back-cross breeding with molecular marker-assisted selection， and these lines showed desirable agronomic traits in the field. The natural evaluation results of rice blast resistance in field showed that the disease resistance grade of single gene lines and double gene-pyramided lines were 3 and 1 respectively， showing high resistance. The resistance grade of Shengdao 15 was 7， so it was highly susceptible. This research indicated that breeding of Pi1 and Pi2 using molecular marker-assisted selection could significantly improve the resistance to rice blast， and it also showed that the resistance of double gene-pyramided lines was significantly better than that of single gene lines.

Keywords Rice； Rice blast； Molecular marker-assisted selection； Resistance identification

稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporche oryzae）引起的水稻生產上的重要病害之一，在世界范圍內都有不同程度的發生，嚴重的甚至顆粒無收[1]。在我國水稻產區，稻瘟病呈現逐年上升的趨勢，成為最主要的病害，給水稻生產造成巨大損失[2，3]。用化學農藥防治稻瘟病，不僅會使種植成本升高，還會造成農藥殘留和環境污染。培育和種植帶有稻瘟病廣譜抗性基因的水稻是防治稻瘟病最經濟有效的方法[4]。

近年來，水稻稻瘟病的研究越來越受到人們重視。目前已鑒定出68個稻瘟病基因座上的83個主效基因，其中23個稻瘟病基因已被克隆[5]。Pi1和Pi2是兩個稻瘟病抗性廣譜基因，對我國不同稻瘟病菌生理小種具有廣譜抗性，已被應用于水稻育種中[6-8]。劉士平等（2003）[9]對Pi1、Pi2和Pi3基因進行聚合和接種鑒定，大大提高了水稻品種對稻瘟病的抗性。柳武革等[6]利用分子標記輔助選擇對Pi1和Pi2基因進行轉育和聚合，培育出5個純合的雙基因聚合系，綜合抗性達到高抗水平。胡杰等[8]利用分子標記輔助選擇將Pi1和Pi2聚合到保持系97B中，在田間自然發病條件下，雙基因聚合系穗頸瘟的抗性為1級，表現為高抗。陳紅旗等[7]將Pi1、Pi2和Pi3聚合到保持系金23B中，育成的改良系大大提高了對稻瘟病的抗性。隨著研究的深入，越來越多的稻瘟病抗性基因被挖掘、定位和克隆，加上成熟的分子標記輔助選擇體系，為稻瘟病抗性基因的利用提供了強有力的技術支撐。拓寬稻瘟病抗性基因資源，提高黃淮區水稻品種對稻瘟病的抗性，是黃淮區水稻生產中亟待解決的問題。

本研究利用攜帶抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的華130B為供體親本，以黃淮區主栽品種圣稻15為受體親本，通過回交轉育和分子標記輔助選擇技術，以期培育出綜合性狀優良、抗稻瘟病的粳稻新品系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

攜帶抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的供體親本華130B，由華中農業大學作物遺傳改良重點實驗室何予卿教授提供，受體圣稻15由本實驗室保存。

1.2 雜交和選擇程序

以圣稻15作母本、華130B作父本雜交獲得F1代雜交種，然后以圣稻15作輪回親本連續回交3次，再自交3次獲得 BC3F4株系。在回交過程中從BC1F1開始用分子標記檢測抗稻瘟病基因Pi1和Pi2，選擇帶有目的基因且農藝性狀偏向圣稻15的單株作母本。在 BC3F4中選擇農藝性狀優良的株系進行Pi1和Pi2目的基因的檢測，選出純合穩定的株系。

1.3 Pi1、Pi2基因的分子標記檢測

Pi1基因的分子標記檢測是利用緊密連鎖的SSR標記RM144（RM144 F：5′-TGCCCTGGCGCAAATTTGATCC-3′；RM144R：5′-GCTAGAGGAGATCAGATGGTAGTGCATG-3′）和RM224（RM224F：5′-ATCGATCGATCTTCACGAGG-3′，RM224R：5′-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-3′）。Pi2基因的分子標記檢測是利用緊密連鎖的SSR標記PI31（PI31 F： 5′-ATCCAAACCCGTTGTTGCAC-3′，PI31 R： 5′-CGGCAATTGCCACGATGATA-3′）。

20 μL PCR反應體系包括模板DNA 1 μL， 10 mmol/L dNTPs 0.15 μL，Taq酶1.5 U， 10×PCR buffer （with MgCl2） 2 μL，2 μmol/L引物1.5 μL，其余用ddH2O補齊。反應程序為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35個循環；72℃延伸5 min[10]。反應產物在6%聚丙烯酰胺上電泳，經硝酸銀甲醛溶液銀染[11]后觀察結果。

1.4 稻瘟病抗性鑒定

2015年在山東省濟寧市喻屯鎮陳莊農場稻瘟病重發區進行稻瘟病自然誘發試驗，對BC3F4代10個穩定株系進行鑒定，陽性對照為供體親本華130B，陰性對照為受體親本圣稻15，每份材料種植50株。不用任何農藥，田間從抽穗到成熟，一直有3～5 cm的水層，保持田間濕潤，易于稻瘟病的發生，于水稻成熟期進行田間稻瘟病發病情況調查。稻瘟病抗性評價標準參照楊仕華等[12]的方法。

2 結果與分析

2.1 Pi1和Pi2基因純合株系的獲得

首先，利用與Pi1和Pi2基因緊密連鎖的SSR標記RM144和PI31對抗性基因供體親本華130B和受體親本圣稻15進行多態性分析，發現RM144和PI31在供體和受體親本中有多態性。然后利用RM144和PI31進行分子標記輔助選擇。先利用RM144和PI31對F1植株進行擴增，選擇帶型為雜合帶的真雜種與圣稻15回交得到BC1F1。對BC1F1單株繼續進行分子標記鑒定，選擇帶有Pi1和Pi2基因的單株，用圣稻15作父本，繼續回交，得到BC2F1。在BC2F1繼續選擇陽性株進行回交，得到BC3F1。然后自交，對其BC3F2至BC3F4代，利用SSR標記對分離群體進行擴增（圖1、2，以BC3F2為例），選擇帶有Pi1和Pi2基因的單株，每代分單株收獲后按株系種植，成熟后選擇農藝性狀優良的單株。在BC3F4代獲得Pi1和Pi2基因純合的株系，其中獲得帶有Pi1基因的純合穩定株系8個、帶有Pi2基因的純合穩定株系9個、帶有Pi1和Pi2雙基因的純合穩定株系5個。根據農藝性狀表現，選出綜合性狀優良的Pi1單基因株系4個、Pi2單基因株系3個、Pi1和Pi2雙基因聚合系3個，進行稻瘟病田間抗性鑒定。

2.2 Pi1和Pi2單基因純合系及雙基因聚合系稻瘟病抗性鑒定

2015年在濟寧市喻屯鎮陳莊農場稻瘟病重發區對10個帶有單基因和雙基因的穩定純合株系進行稻瘟病抗性鑒定。結果表明，10個株系的抗病等級為1～3，表現為抗，其抗性與供體親本華130B在同一個水平上，而圣稻15表現為感，抗病等級為7（表1）。從表1可以看出，含不同抗性基因的材料對稻瘟病菌表現出不同的抗性，單基因系對稻瘟病菌的抗病等級為3級，雙基因系對稻瘟病的抗病等級為1級，兩基因累加系的抗性明顯強于單基因系。根據本研究，Pi1和Pi2轉育材料對山東稻瘟病菌群的抗性有明顯的提高，說明利用分子標記輔助選擇培育帶有Pi1和Pi2稻瘟病抗性基因的水稻材料可以有效提高水稻品種對稻瘟病的抗性。

3 討論

山東省生產上應用的水稻品種稻瘟病抗性不強，特別是一些近幾年生產上審定的品種，田間也表現高感稻瘟病，限制了其推廣應用。2015年參加山東省區試的水稻品種經稻瘟病菌接種鑒定，僅有一個品種抗病級別達到3級，其余都在5～9級。本研究以帶有Pi1和 Pi2的華130B為供體親本，通過回交轉育培育的帶有Pi1 和 Pi2的單基因系和雙基因系，抗性級別達到3級或3級以上，與對照品種圣稻15相比，稻瘟病抗性得到了明顯改良。下一步我們將利用這些材料進行進一步的轉育，培育農藝性狀優良的高抗稻瘟病水稻新品系。

參 考 文 獻：

[1] Dean R A，Talbot N J， Ebbole D J， et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea[J]. Nature， 2005， 434：980-986.

[2] 孫國昌，杜新法，陶榮祥，等.水稻稻瘟病防治研究進展和21世紀初研究設想[J]. 植物保護學報，2000，26（1）：33-35.

[3] 全國農業技術推廣中心.2012年全國農作物重大病蟲害呈重發態勢[J].農藥市場信息，2012（5）：49.

[4] Zhang Y X， Yang J Y， Shan Z L， et al. Substitution mapping of QTLs for blast resistance with SSSLs in rice （Oryza sativa L.） [J].Euphytica， 2012， 184（1）：141-150.

[5] 國家水稻數據中心. http：/ /www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm.

[6] 柳武革，王豐，金素娟，等. 利用分子標記輔助選擇聚合Pi-1和Pi-2基因改良兩系不育系的稻瘟病抗性[J]. 作物學報，2008，34（7）： 1128-1136.

[7] 陳紅旗，陳宗祥，倪深，等. 利用分子標記技術聚合3個稻瘟病基因改良金23B的稻瘟病抗性[J]. 中國水稻科學，2008， 22（1）：23-27.

[8] 胡杰，李信，吳昌軍，等. 利用分子標記輔助選擇改良雜交水稻的褐飛虱和稻瘟病抗性[J].分子植物育種，2010，6（8）：1180-1187.

[9] 劉士平，李信，汪朝陽，等.基因聚合對水稻稻瘟病的抗性影響[J]. 分子植物育種，2003，1（1）：22-26.

[10]Panaud O， Chen X， McCouch S R. Development of microsatellite markers and characterization of simple sequence length polymorphism （SSLP） in rice （Oryza sativa L.） [J]. Mol. Gen. Genet.， 1996， 252： 597-607.

[11]Li W T， Zeng R Z， Zhang Z M， et al. Mapping of S-b locus for F1 pollen sterility in cultivated rice using PCR based markers[J]. Acta Bot. Sinica， 2002， 44： 463-467.

[12]楊仕華，廖琴. 中國水稻品種試驗與審定[M]. 北京：中國農業科學技術出版社，2005：32-35.