小干擾RNA沉默HIF-1α基因表達對對人鼻咽癌細胞系CNE1凋亡的影響

詹建東，邱前輝，張水興，陳少華，蘇小妹廣東省人民醫院//廣東省醫學科學院耳鼻喉頭頸外科，放射科，廣東 廣州 50080

基礎研究

小干擾RNA沉默HIF-1α基因表達對對人鼻咽癌細胞系CNE1凋亡的影響

詹建東1，邱前輝1，張水興2，陳少華1，蘇小妹1
廣東省人民醫院//廣東省醫學科學院1耳鼻喉頭頸外科，2放射科，廣東 廣州 510080

目的 探討CNE1對人鼻咽癌細胞系CNE1凋亡的影響。方法 利用陽離子脂質體LipofectamineTM2000將HIF-1αsiRNA轉染入CNE13細胞中。WB法測定CNE1細胞內HIF-1α的表達。流式細胞儀及Hochest熒光染色測定細胞凋亡率的變化。WB法測定CNE1細胞內BCL-2的表達。結果 干擾HIF-1α能有效地促進CNE1細胞的凋亡，同時可下調BCL-2的表達。結論體外實驗初步證明HIF-1α基因在人鼻咽癌細胞系CNE1凋亡方面扮演重要角色，可通過下調BCL-2的表達來誘導凋亡。

HIF-1α；凋亡；CNE1

實體腫瘤增大到約1～2 mm3時，內部會出現乏氧的微環境，此時惡性腫瘤細胞將產生一系列生物學行為的變化來適應低氧狀態。缺氧誘導因子-lα（HIF-1α）通過調節腫瘤細胞能量代謝、凋亡、血管生成、侵襲轉移等使腫瘤細胞適應缺氧微環境，促使腫瘤進展［1-2］。HIF-lα在這些過程中起著中心介導作用，在多種腫瘤細胞中降低HIF-lα的表達可能有抗腫瘤的作用［3-8］。已有研究表明，HIF-lα在鼻咽癌組織中高表達，并與鼻咽癌的病理特征和腫瘤血管生成密切相關［9］。而HIF-lα與鼻咽癌增殖凋亡有無關系尚未有文獻報道。本研究通過小干擾RNA（siRNA）沉默人鼻咽癌細胞系CNE1的HIF-lα基因，檢測細胞凋亡的變化及凋亡相關蛋白表達情況，觀察沉默HIF-lα基因對人鼻咽癌細胞系CNE1細胞生物學行為的影響。

1　材料與方法

1.1細胞培養

人類鼻咽癌細胞系CNE1（采購于美國標準生物品收藏中心），胎牛血清（采購于杭州四季清公司），DMEM培養基（采購于美國Gibco）。

1.2主要試劑

CCK8試劑盒（采購于碧云天生物技術公），雙染熒光標記凋亡檢測試劑盒（采購于羅氏公司），碘化丙啶與膜聯蛋白-V（Annexin V-PI）。

1.3實驗方法

1.3.1RNA的干擾 HIF-1αsiRNA與陰性對照siRNA通過上海吉瑪公司設計與合成，篩選出的有效HIF-lα-siRNA靶向HIF-lαmRNA的位點為792-812，正義鏈為5'-GUGAUGAAAGAAUUACCGAAUTT-3'，NC-siRNA片段正義鏈序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'。Opti-MEM從美國Gibco購買，脂質體轉染試劑盒從廣州英偉創津有限公司購買。轉染前的24 h人鼻咽癌細胞CNE1按1×105/孔接種到培養板內，37℃培養過1夜。具體轉染操作步驟按轉染的操作手冊進行，轉染6 h以后將更換低血清（0.5%）DMEM培養液進一步培養，轉染后48 h消化濃集細胞。

1.3.2WesternBlot測試HIF-1α蛋白質的表達 收集空白對照組、陰性對照組與轉染HIF-lα-siRNA 48 h的CNE1細胞1×105，用PBS液清洗2遍，將溶解于裂解緩沖液，Triton-X-100 0.5 mL，NaCL 0.438 g，pH8.0的HCL 2.5 mL，1 mol/LTris，加蒸餾水到50 mL。使用時，將0.87 mL裂解液加入1.74/LPMSF50 μL，提取總蛋白質。BCA法測定各種樣品種總蛋白質的濃度，并調節至濃度一致。樣品加10%SDS-PAGE（濃縮膠80V；分離膠120 V）大約2.5 h，恒流200 mA 2 h轉印在PVDF膜。封閉液（pH 7.6，0.05%Tween 20，5%脫脂奶粉）室溫封閉2 h后，于一抗（稀釋比例1:500）孵育4℃過夜。二抗體（稀釋比例1:2000）孵育2 h。用TBS洗滌3次，通過超敏發光液顯光，經X感光片感光并顯影定影。內參蛋白為GAPDH。

1.3.3AnnexinV-PI雙染流式細胞儀檢測凋亡細胞收集轉染后48 h的細胞，PBS清洗以后，用預冷75%乙醇固定過夜，離心去除上清，PBS清洗以后加Rnase溶液，放置室溫避光保存，加入0.06 L的PI，置室溫避光30 min，用流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.3.4Hochest熒光染色將對數生長期細胞接種在6孔板，藥物作用48 h用PBS洗滌3次，5 min/次，加入多聚甲醛溶液室溫固定30 min，用PBS洗滌3次，5 min/次，加入hochest33342溶液，在37℃下孵育15 min，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并攝像，正常的細胞核會呈現出彌散均勻的淡藍色熒光，凋亡的細胞核則會呈現致密濃染的強藍色熒光。

1.4統計學方法

結果用均數±標準差表述，采用獨立樣本t檢驗比較兩組間的差別。由SPSS l3.0軟件進行統計分析，顯著性水平是P＜0.05。

2　結果

2.1轉染后HIF-1α基因蛋白表達情況

使用HIF-1αsiRNA轉染CNE1細胞在24 h時HIF-1α基因蛋白未受到顯著影響，48、72 h后表達量明顯降低。HIF-1αsiRNA組表現明顯時間依賴性，隨著觀察時間的延長，后一個觀察時間點都較前一個觀察時間點細胞中HIF-1α表達量出現明顯下降。

2.2流式細胞術檢測CNE1細胞的凋亡

研究干擾HIF-1α對細胞凋亡的影響，使用流式細胞術檢測細胞凋亡率。經獨立樣本t檢驗分析的結果表明，通過血清饑餓48 h，干擾組的凋亡率為38.8%；血清血清饑餓72 h，凋亡率為60.1%。相應對照組分別為5.6%、10.2%（P＜0.05）。這些數據提示干擾HIF-1α將使CNE1細胞對血清饑餓誘導凋亡變得更加敏感。

2.3活細胞染色結果

使用Hochest 33258熒光染料對活細胞染色，通過波長365 nm的熒光顯微鏡進行觀察，發現對照組細胞核邊界清晰，呈均勻淡藍色的圓形或橢圓形。經血清饑餓48 h后都能觀察到細胞具有典型凋亡特征，細胞核邊界清晰，呈亮藍色的半月形、馬蹄形，凋亡細胞染色質的邊集、核濃縮或聚集；有的細胞核甚至有3個或以上的熒光碎塊。各組分別隨機計數200個細胞，轉染組凋亡細胞為56.2%，對照組凋亡細胞為12.5%。

2.4轉染后HIF-1α基因蛋白對凋亡相關基因的影響

為進一步研究HIF-1α對CNE1細胞凋亡分子的機制，我們在不同時間段檢測HIF-1α的凋亡相關蛋白Bcl2的變化情況。結果顯示干擾HIF-1α后Bcl2表達下降，且呈時間依賴性。

3　討論

本實驗用經證實有效的人工化學合成的HIF-lα-siRNA轉染CEN1細胞可以沉默HIF-lα基因的表達，轉染CNE1細胞在48 h，72 h后HIF-lα表達量明顯降低。從而為研究HIF-lα與鼻咽癌的關系提供了合適的模型。

HIF-1α是1992年由Semenza等最先在缺氧誘導的細胞核抽提物中發現的轉錄因子，廣泛存在于哺乳動物和人體內［10］。近年來研究在大多數人類正常組織細胞中未檢測到HIF-1α蛋白的表達，但在許多腫瘤細胞中卻存在，且與預后密切相關［11-14］。HIF-1α表達與肺癌T分期、有無頸淋巴結轉移和臨床分期相關表達可能在腫瘤發生發展中發揮重要作用［15］。HIF-1α在正常食管黏膜細胞不會表達，而食管鱗癌細胞的陽性表達率為61.7%，且其陽性表達率隨食管癌腫瘤體積呈正相關，隨組織分化程度降低而增高［16］。HIF-1α在鼻咽癌組織中的表達顯著高于鼻咽慢性炎性組織，與T分期、臨床分期和有無頸淋巴結轉移相關［17］。HIF-lα在細胞凋亡中的調控作用存在著兩個不同方面的影響：一方面是抗凋亡作用，HIF-lα可增加無氧代謝、糖酵解和一些凋亡前基因的表達，同時還能與人端粒末端逆轉錄酶（hTERT）基因相互作用，誘導活化hTERT，增加端粒酶的活性，延長端粒；另一方面是促凋亡作用，HIF-lα能阻斷P53降解與穩定P53、上調Bcl-2家族促凋亡基因BNIP3等途徑。本研究通過沉默鼻咽癌中HIF-lα的表達來檢查細胞凋亡的情況。在本研究中，我們觀察到：干擾組CNE1細胞在轉染HIF-lα-siRNA后48、72 h，凋亡率高于對照組，提示沉默HIF-lα基因能誘導CNE1細胞凋亡，發揮抗腫瘤效應。

為了進一步研究沉默HIF-lα基因誘導CNE1細胞凋亡的機制。在本研究中，我們觀察到干擾組Bcl-2的表達下降，且呈時間依賴性，干擾48 h后開始顯著下降。有證據表明BCL-2必須與其它蛋白如Bax形成異二聚體才能發揮其生理作用。BCL-2還可以和抑癌基因p53相互作用，間接調控程序性細胞死亡［18］。因此，我們的研究發現，HIF-lα在人鼻咽癌細胞生長過程中起著重要作用。干擾HIF-lα的表達，可通過下調BCL-2的表達從而誘導細胞凋亡。

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2016-05-15

詹建東，E-mail:13503043816@139.com