基于“有故無殞”思想的雷公藤腎毒性研究*

張　琴，歐陽林旗，胡煒航，左亞杰，李健和

（1.中南大學湘雅二醫院藥學部，湖南 長沙　410011；　2.湖南省中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心，湖南 長沙　410000）

基于“有故無殞”思想的雷公藤腎毒性研究*

張琴1，2，歐陽林旗2，胡煒航2，左亞杰2，李健和1

（1.中南大學湘雅二醫院藥學部，湖南 長沙410011；2.湖南省中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心，湖南 長沙410000）

目的 研究雷公藤對正常和腎小管S1段損傷急性腎功能衰竭模型大鼠腎毒性的差異。方法 觀察雷公藤提取物（TWHF）對生理和病理狀態大鼠的一般生長狀態、腎臟臟器指數、血清生化指標的影響，并通過病理切片觀察大鼠腎臟組織損傷情況。結果 TWHF呈劑量依賴增高的正常大鼠血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（CREA）、血清高K+和低Na+水平，與其一般生長狀態、臟器指數和腎功能損傷病理檢查結果相符；低劑量TWHF在模型大鼠上表現出改善BUN、CREA、血清高K+和低Na+水平的腎功能保護作用，病理損傷程度也有一定減輕，但高劑量時反而加重模型組大鼠腎功能損傷。結論 雷公藤對正常大鼠有劑量相關的腎毒性，但在一定劑量范圍內對腎功能損傷病理狀態有保護作用，為雷公藤“有故無殞”的安全用藥提供了依據。

有故無殞；雷公藤；腎功能保護；腎臟毒性；毒性差異

雷公藤 Tripterygium wilfordii Hook.f.是衛矛科雷公藤屬雷公藤的干燥根及根莖，具有祛風除濕、活血化瘀、舒經通絡、消腫止痛、殺蟲止血、清熱解毒等功效［1］，臨床常用于治療各種原發性和繼發性腎炎，包括慢性腎小球腎炎、腎病綜合征、過敏性紫癜腎炎、狼瘡性腎炎等疾病，療效顯著［2-4］。但其腎毒性也明顯，已引起國內外研究者對其安全性的疑慮［1，5］。該藥的臨床應用與中醫《內經》中的“有故無殞”思想相吻合。雷公藤的主要毒性成分也是其主要藥效成分［6］，需要正確理解雷公藤的這種保護和損傷的“雙向作用”，認識其“量-效（毒）關系”，以指導臨床合理用藥。目前，對于雷公藤腎毒性的研究，多集中在其毒性成分、毒理機制及對以正常動物為研究對象的毒性評價［7］，未能較好地解釋其臨床應用中體現的“有故無殞”思想內涵。因此，雷公藤腎毒性評價不能僅限于在正常動物評價其毒性大小，更重要的是應在疾病模型動物上模擬臨床實際情況研究其合理用藥減毒的途徑和機制［8］。本研究中擬基于“有故無殞”思想，以正常和急性腎小管損傷大鼠為研究對象，從腎功能和腎組織形態等方面探討雷公藤提取物（TWHF）對正常和腎小管損傷急性腎功能衰竭大鼠的效／毒作用差異，客觀評價雷公藤的腎毒性和腎保護“雙向作用”，為科學評價雷公藤對腎臟的量-效／毒關系和指導臨床合理、安全用藥提供依據。

1　資料與方法

1.1儀器、動物與試藥

儀器：BS-300型全自動生化分析儀（邁瑞公司）；TDZ4-WS型臺式低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；TP1020型自動脫水機，RM2135型石蠟切片機，DM1000型光學顯微鏡（德國Leica公司）；CS-VI型攤片烤片機（湖北孝感宏業醫用儀器有限公司）；Tissue-Tek TEL組織包埋機（日本Sakura公司）；隔水式電熱恒溫培養箱（上海市躍進醫療器械廠）；微波爐（TCL有限公司）；MiniSee圖像采集系統。

動物：雄性SD大鼠80只，SPF級，6～8周齡，體質量（180±30）g，購于長沙市天勤生物技術公司，動物合格證號為SCXK（湘）2015-0003。分籠飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心，自由進食及飲水，實驗室溫度（22±2）℃，相對濕度60%～80%，人工光照約12 h明暗周期，定期消毒。

試藥：雷公藤（湖南省松齡堂中藥飲片有限公司，批號為SL16041501），經湖南中醫藥大學張志國教授鑒定為衛矛科雷公藤屬雷公藤 Tripterygium wilfordii Hook.f.的根及根莖。雷公藤提取物（取一定量雷公藤，加6倍量90%乙醇，加熱蒸餾提取3次，每次1 h；取醇提殘渣，加10倍量水，加熱提取1 h；合并濾液，冷凍干燥制成粉末，保存備用）。重鉻酸鉀（北京嘉世玉禾化工技術研究院，批號為S50744）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，上海山浦化工有限公司，批號為20121222）；水合氯醛（上海滬試化工有限公司，批號為20151217）。

1.2方法

分組：參考文獻和臨床常用劑量等比設定4個TWHF劑量組（每1 kg含3.13，6.25，13.5，27.0 g生藥）。大鼠預養1周后，按體質量隨機分為10組，每組8只，即空白組（N），模型組（M），空白組+1倍劑量TWHF組（ND1），空白組+2倍劑量TWHF組（ND2），空白組+4倍劑量TWHF組（ND3），空白組+8倍劑量TWHF組（ND4），模型組+1倍劑量TWHF組（MD1），模型組+2倍劑量TWHF組（MD2），模型組+4倍劑量TWHF組（MD3），模型組+8倍劑量TWHF組（MD4）。

造模：重鉻酸鉀溶于去離子水中，造模劑量為20 mg／（kg·d），模型組于給藥第4天皮下注射1次，造腎小管S1段損傷的急性腎功能衰竭模型。

給藥：將TWHF溶于5%的CMC-Na溶液，按擬訂劑量灌胃給藥，空白組灌以同體積的5%CMC-Na溶液，每天給藥1次，持續7 d。

常規指標觀察：給藥后，觀察大鼠毛色、飲食及行為活動等一般狀況，分別于給藥前及給藥后第1，3，5，7天稱大鼠體質量，并在給藥前、造模后、處死前將大鼠放于代謝籠中，接取尿液，記錄24 h尿量。

腎組織器官臟器系數：記錄大鼠死亡數量，將大鼠解剖后，摘取兩腎，用濾紙吸干，稱取質量。臟器系數=器官濕質量／體質量×100%。

生化指標測定：試驗第8天，取大鼠股動脈血，室溫放置2 h后離心（3 000 r／min）10 min，得血清樣本，進行生化檢測，檢測內容主要有血清尿素氮（BUN），血清肌酐（CREA），Ca2+，Na+，K+，Cl-。

腎臟病理組織形態學檢查：試驗結束后處死動物，解剖后用冰生理鹽水洗血跡，濾紙吸盡表面水分，精確稱質量，將摘取的一側腎臟立即固定于10%福爾馬林常規脫水，石蠟包埋，切片，HE常規染色，并于光鏡下觀察組織病理變化情況。

1.3統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行分析。各組定量檢測數據以X±s表示，兩組間比較采用 t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多組間比較采用 LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠一般情況變化

各健康動物中，空白組大鼠精神狀態良好，行動靈活，毛發光澤，大小便正常；給予TWHF后，大鼠出現精神不振，被毛臟亂，偶見稀便。給藥期間，各組健康大鼠體質量總體呈增長趨勢，但隨著給藥時間的延長，體質量呈現較緩慢的增長狀態，高劑量（4倍、8倍劑量）組大鼠體質量增長抑制趨勢高于低劑量組及空白組，詳見表1。隨著給藥時間的延長和劑量的增大，有不同程度的尿量減少，呈劑量相關性，高劑量組嚴重者尿液顏色加深，呈紅棕色。試驗過程中，8倍劑量組大鼠死亡1只。詳見表2。

模型組大鼠以重鉻酸鉀造腎小管S1段損傷的急性腎功能衰竭模型，造模后大鼠表現出毛色無光澤，眼神黯淡，萎靡少動，飲食量減少。造模前，大鼠體質量整體水平呈增長趨勢；造模后，體重增長緩慢甚至下降；與模型組比較，給藥1倍和2倍劑量TWHF后，大鼠體質量稍有增長，而4倍和8倍劑量組體重增長抑制作用明顯，詳見表1。與空白組比較，模型組大鼠尿量減少明顯，1倍和2倍劑量組尿量減少較高劑量組緩慢，高劑量組隨著給藥時間的延長，其尿量進一步下降，各組大鼠尿液出現紅棕色，甚至血尿，部分動物出現死亡現象，尤以高劑量明顯，4倍和8倍劑量大鼠各死亡2只，詳見表2。

2.2大鼠腎臟臟器指數

正常大鼠給予不同劑量TWHF后，與空白組相比，給藥組腎臟臟器指數均有所增高，高劑量組（4倍和8倍劑量）的差異有統計學意義（P＜0.05）。重鉻酸鉀造模后，與空白組大鼠相比，腎臟臟器指數顯著升高（P＜0.01）；給予不同劑量TWHF后，與模型組相比，1倍和2倍劑量組腎臟臟器指數有下降趨勢，但未達到顯著性，4倍和8倍劑量組腎臟臟器指數進一步升高。

2.3大鼠腎臟功能生化指標

表1　各組大鼠給藥前后體質量變化情況（n=8）

表2　各組大鼠給藥后腎臟臟器指數與24 h尿量變化情況（n=8）

表3　TWHF對健康及腎損傷模型大鼠腎功能指標的影響（X±s）

不同試驗組大鼠腎臟生化指標變化見表3。正常大鼠給予不同劑量TWHF后，與空白組相比，2，4，8倍劑量組大鼠BUN和CREA水平顯著增高，且呈一定的量-效關系；8倍劑量組大鼠K+濃度增高，4倍和8倍劑量組大鼠Na+濃度降低；Ca2+和Cl-濃度無明顯變化。重鉻酸鉀造模后，與空白組大鼠相比，模型組大鼠BUN，CREA水平和K+濃度顯著增高，Ca2+和Na+濃度明顯降低；模型組大鼠給予不同劑量TWHF后，1倍劑量組大鼠BUN，CREA水平和K+濃度降低，Na+濃度升高；2倍劑量組大鼠K+濃度降低，BUN和CREA水平顯著降低，Ca2+濃度顯著升高；4倍和8倍劑量組大鼠BUN，CREA水平和K+，Ca2+濃度進一步增高，Na+濃度明顯降低。提示雷公藤在正常大鼠表現出劑量相關性的腎功能損傷，在腎小管S1段損傷的急性腎功能衰竭模型大鼠，低劑量表現出保護作用，高劑量表現出加重腎功能損傷作用。

2.4大鼠腎臟組織病理形態學

空白組大鼠腎臟組織結構基本正常，無明顯病理變化；重鉻酸鉀造模后，模型組大鼠腎臟組織結構鏡下可見腎小管細胞明顯水腫，細胞顆粒樣變性，腎小管壞死，腎小球囊性擴張，部分系膜基質增生，腎小管內水腫，液體潴留，較多管型等病理改變。與空白組比較，不同TWHF劑量組腎組織有不同程度的腎小管細胞水腫，腎小管細胞顆粒樣變性，腎小球囊性擴張、系膜基質增生，嚴重者出現間質改變和腎小管壞死，呈一定劑量相關性。與模型組比較，1倍和2倍劑量組腎臟組織損傷有一定程度減輕，4倍和8倍劑量組腎功能損傷進一步加重，嚴重者腎間質少量鈣化，皮質區腎小球壞死、鈣化，近皮質區域腎小球、腎小管壞死嚴重，髓質水腫。詳見圖1。可見，雷公藤對正常大鼠表現出腎功能損傷，低劑量在模型大鼠表現出保護作用，高劑量表現出損傷作用。

圖1　TWHF對健康和腎功能損傷模型大鼠腎臟組織HE染色結果的影響（×200）

3　?　討論

雷公藤并非傳統劇毒藥物，其不同部位短期給藥產生的腎臟毒性不明顯，但長期使用雷公藤治療慢性疾病，特別是在長期或大量用于腎臟相關疾病治療時，其潛在腎毒性不容忽視［9］。本研究中在較大劑量范圍考察了雷公藤毒效關系，從大鼠給藥后的一般狀況、臟器指數、血液生化指標和腎臟病理組織改變結果可以看出，在正常生理狀態下與腎功能損傷病理狀態下的大鼠，給予不同劑量TWHF所表現出來的毒性結果存在差異。正常大鼠給予TWHF后，隨著劑量的增加，大鼠體質量增長抑制，高劑量組腎臟臟器指數增加，與腎功能損傷有關的BUN，CREA，血清高K+和低Na+狀態呈劑量相關的增高趨勢，腎臟病理切片顯示最高劑量組MD4大鼠出現嚴重的腎小球、腎間質改變和腎小管壞死。模型組大鼠體質量增長明顯抑制，甚至出現體質量減輕，腎臟臟器指數顯著增加，而雷公藤作用于模型組大鼠，在較低劑量（1倍和2倍劑量TWHF）表現出改善BUN，CREA水平和血清高K+、低Na+狀態的保護作用，腎臟組織病理損傷程度也有一定減輕，但高劑量時反而加重了模型組大鼠的腎功能損傷。提示在使用對癥、劑量恰當的情況下，雷公藤可安全用于腎臟相關疾病的治療。

很多研究證實，中藥“有故無殞”的現象是客觀存在的，其思想的實質是研究中藥與特定證候或機體狀態之間的對應關系及其內在的變化規律［8，10-11］。現代研究對雷公藤腎毒性的研究多關注其物質基礎與作用機制對毒效關系的影響，而忽略了藥物對不同狀態機體產生的毒性差異。雷公藤多苷對正常和關節炎模型大鼠的肝功能生化指標的影響也存在差異，研究結果顯示，對模型大鼠的影響小于正常大鼠［12］。本研究結果證實，雷公藤腎毒性的量-效／毒關系具有類似規律，體現了“有故無殞”的思想。雷公藤引起腎毒性的成分為雷公藤多苷、雷公藤甲素［13］，而腎臟具有保護作用的成分主要為雷公藤多苷、雷公藤甲素、雷公藤內酯醇［14-15］。這種腎臟保護活性成分與腎毒性成分的重疊，是腎毒性差異的物質基礎，提示雷公藤存在明顯的藥效與毒性“雙向”作用，在臨床應用時劑量范圍的重要性不容忽視。

綜上所述，雷公藤對于腎臟組織損傷病理狀態有比正常生理狀態下較低的腎毒性，在一定劑量范圍內表現“有故無殞”，安全用于臨床治療的前提是“對癥”，把握不同病理狀態的量-效／毒差異。后續試驗將研究不同腎功能損傷病理狀態下的量-效／毒差異與特點，為雷公藤的安全、有效應用提供科學依據。

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Study on the Renal Toxicity ofTripterygium Wilfordii Hook.f.on the Basis of Symptom-Based Prescription Theory

Zhang Qin1，2，Ouyang Linqi2，Hu Weihang2，Zuo Yajie2，Li Jianhe1
（1.Department of Pharmacy，The Second Xiangya Hospital of Central South University，Changsha，Hunan，China410011；2.Preparation Center，The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan，China410000）

ObjectiveTo study the differences in the renal toxicity of Tripterygium wilfordii Hook.f.（TWHF）on normal and acute renal failure model rats with tubular S1 damaged.MethodsThe general growth status，organ／body coefficients and serum biochemical indexes were used to investigate the influence of the TWHF on physiological and pathological state.Pathological sections were prepared to observe the damage in renal tissue.ResultsTWHF increased BUN，CREA，and serum high K+and low Na+levels of normal rats in a dose dependent，which was consistent with its general growth state，organ／body coefficients，and kidney damage pathological examination results.Low doses of TWHF improved the state of BUN，CREA，serum high K+and low Na+levels，and reduced the renal pathological damage in a certain degree，which showed protection effect in model rats.However，high doses of TWHF aggravated kidney injury of model rats.ConclusionAlthough TWHF has dose related renal toxicity to normal rats，it also has a protective effect on kidney injury pathological status in certain dose range，which provided a basis for clinical safe application of TWHF based on symptom-based prescription theory.

symptom-based prescription theory；Tripterygium wilfordii Hook.f.；renal protection；renal toxicity；differences in toxicity

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2016）20-0025-05

*湖南省教育廳科學研究項目優秀青年基金項目，項目編號：14B132。

張琴（1981-），女，漢族，湖南長沙人，大學本科，主管藥師，研究方向為中藥制劑、中藥藥理學，（電話）0731-85600466（電子信箱）dboyzq1＠163.com；李健和，男，漢族，碩士研究生，副主任藥師，碩士研究生導師，研究方向為新藥開發，本文通訊作者，（電話）0731-85292093（電子信箱）lijianhexy＠126.com。

（2016-06-13；

2016-06-30）