黃柏中多種生物堿測定的NIR模型的建立

吳珊珊，胡麟，龔曉猛，李夢琪，吳文輝，李文兵，胡昌江

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黃柏中多種生物堿測定的NIR模型的建立

吳珊珊1，胡麟1，龔曉猛1，李夢琪1，吳文輝1，李文兵2，胡昌江1

目的：建立黃柏中3個成分（木蘭花堿、黃柏堿、小檗堿）測定的NIR模型。方法：以高效液相測定的黃柏生物堿含量值作為參照，運用近紅外漫反射光譜采集49批不同產地樣品的近紅外漫反射光譜，采用偏最小二乘算法( PLS) 建立校正模型，比較不同的預處理方法及不同的波段對建模的影響。結果：以MSC+2D2為預處理方法，建立的小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿模型交互驗證均方根誤差（RMSEC）分別為0.0453、0.0335 、0.0396，相關系數（R2）分別為0.9995、0.9760、0.9306。結論：建立的NIR模型穩定準確可靠，適用于生產中快速在線檢測。

近紅外光譜；黃柏；PLS；生物堿

黃柏是“三木藥材”之一，始載于《神農本草經》，列為上品。具有兩千多年的藥用歷史。性味苦、寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效[1]。鹽炙可引藥入腎，緩和苦燥之性，增強滋腎陰、瀉相火、退虛熱的作用；酒炙后可降低苦寒之性，免傷脾陽，并借酒升騰之力，引藥上行，清血分濕熱。[2]黃柏中主要成分有小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿、巴馬汀、藥根堿等生物堿類，其中含量最高的為小檗堿[3,4]。目前，黃柏質量控制的方法主要是通過運用相應的對照品進行黃柏藥材中不同成分的含量測定以及運用指紋圖譜方法控制黃柏的整體質量。需要經過復雜的樣品制備和預處理，分析時間長。近紅外(near infrared, NIR) 光譜分析是近年來快速發展的一種分析技術，適合于復雜天然產物的定性和定量分析。與傳統分析技術相比，近紅外光譜分析技術被測樣品用量小、無破壞、無污染，具有高效、快速、成本低和綠色的特點。[5～8]因此，近紅外光譜在中草藥及其產品的定量定性兩方面都得到應用。因其快速簡便，在藥廠中也廣泛應用于藥材中間產物和成品的質量控制。在定性分析中，常用于中藥材真偽、產地的鑒別及相似、相近藥材的區分和鑒定。定量分析中主要用于有效成分含量的測定。[9～11]本實驗以黃柏為研究對象，以高效液相作為參比方法，采集黃柏粉末近紅外光譜圖，采用偏最小二乘法建立定量校正模型，實現對黃柏中幾種生物堿含量的快速、簡便、準確測定。

1 儀器與材料

Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀（配有Thermo Result信號采集軟件，TQ Analyst數據處理軟件，積分球漫反射采樣系統），Agilent 1200 高效液相系統，FE20梅特勒-托利多pH 計，Sartorius BP211D 電子分析天平，KQ-300E 超聲儀（40 kW），乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。木蘭花堿（Must-12022901）、鹽酸黃柏堿（Must-12021407）、和鹽酸小檗堿（Must-111212110）均購自成都曼思特生物制品檢定所，HPLC（峰面積歸一化法）純度為98%。

49批黃柏購自四川、貴州、湖南、湖北等地藥材市場和飲片公司，經本校生藥室教研室盧先明老師鑒定為黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮。

2 實驗方法

2.1 近紅外光譜的采集

樣品過4號篩，裝入樣品杯中，采集方式為積分球（旋轉樣品），掃描范圍10 000～4 000 cm-1，掃描64 次，增益2X，分辨率8 cm-1，empty 門衰減。每份樣品重復掃描3 次， 計算平均光譜， 每次掃描前都要對樣品進行混勻。圖1為49批黃柏樣品的近紅外光譜疊加圖。

圖1 不同產地黃柏近紅外原始光譜圖

2.2 HPLC含量測定[12]

2.2.1 HPLC測定生物堿含量條件 同時利用高效液相色譜法測定各批次黃柏粉末中木蘭花堿、黃柏堿和小檗堿的含量。其測定條件為流動相A：乙腈-0.05 mol．L-1磷酸二氫鉀（KH2PΟ4）（45∶55）（每100 mL 中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉，調節pH值至4.8），流動相B：乙腈-0.05 mol．L-1KH2PΟ4（55∶45）（每100 mL 中加入0.4 g 十二烷基硫酸鈉，調節pH值至4.5），梯度洗脫程序0～12 min，0 B， 12～18 min， 0～100% B ， 18～40 min，100 %B， 40～42 min，100～0% B，42～48 min 0% B。流速 1 mL．min-1，檢測波長280 nm。

2.2.2 樣品含量測定 對49份樣品進行HPLC含量測定，每份樣品平行測量2次，計算平均值。樣品中木蘭花堿、小檗堿、黃柏堿的含量范圍分別為0.10～1.01%、1.22～9.53%、0.19～0.90%。

2.3 模型的建立的方法

將49 份樣品的近紅外光譜與HPLC 值相關聯，輸入到TQ 8.0定量分析軟件中，隨機分為校正集和驗證集，要保證驗證集的含量范圍在校正集的含量范圍之內。采用偏最小二乘法(PLS) 建立定量分析模型，用驗證集驗證該模型，并以校正集決定系數(R2)、校正集均方差(RMSECV) 、預測均方差(RMSEP) 作為評價指標來優化模型性能。R2越大、RMSECV 越小， 表明模型結構越合理，RMSEP 越小，表明模型的預測性能和推廣能力越強。

2.4 光譜預處理方法的選擇

運用光譜分析軟件進行數據處理，比較主成分回歸法(PCR)和偏最小二乘法(PLS)的建模結果。結果表明PLS所建立的模型R2較大而RMSEC，表明所建模型適用性強、預測效果好，優于PCR法，故選定采用PLS法建立定量校正模型。

本實驗首先結合多元散射校正(MSC)以及標準正態變量轉換(SNV)兩種方法進行光譜預處理，同時進行數學處理，主要用導數和Norris平滑對NIR光譜進行預處理，用以消除光譜散射和基線飄移，導數光譜分別采取一階導數和二階導數處理。結果見表1。

表1 不同預處理方法對校正模型影響

2.5 波段的選擇

PLS全譜建模需要大量計算，同時易引入過多冗余信息，因此需對建模波段進行選擇，提高模型的準確性。本實驗以MSC+2D2為預處理方法，根據R2、RMSEC值作為指標選擇較優的波段。最終確定4342.91-5006.3,5804.68-7500,8000-10000為建模波段?？疾旖Y果見表2。

表2 光譜波段選取對PLS 模型影響

2.6 校正模型的建立及驗證

根據不同產地黃柏和黃柏樣品中的生物堿分布情況，從49份樣品中選擇34個樣品作為校正集，15個樣品作為驗證集。為使校正集樣品更具代表性，驗證集樣品的生物堿含量范圍應在校正集含量之內，結果見圖2。用樣品的校正集建立校正模型，再做交叉檢驗。最后用驗證集樣品對模型進行外部驗證。

圖2 小檗堿 (A)、黃柏堿 (B)、木蘭花堿 (C) 的校正集樣品預測值與測量值之間的相關圖

3 討論

本研究通過NIR 光譜法對黃柏主要生物堿進行含量測定，實驗考察PLS法和PCR法，結合多元散射校正(MSC) 以及標準正態變量轉換(SNV) 兩種方法進行光譜預處理，最終選擇用PLS法，MSC+2D2為預處理方法。該方法高效，快速，一個樣品只需1～2 min便可得出結果。同時，樣品預處理方法簡單，測定過程中對樣品無污染，為黃柏的快速評價和在線檢測提供了參考和依據。但本試驗樣品批次較少且不包括炮制品和和配方顆粒等飲片形式的樣品，因此要建立完全適合生產科研精度需要的相關分析模型，有待于進一步的研究分析。

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[5] 阮治綱,李彬.近紅外光譜分析技術的原理及在中藥材中的應用[J].藥物分析雜志,2011, 31(2):408.

[6] 周云,臧恒昌.近紅外分析技術在中藥鑒定及含量測定方面的研究進展[J].食品與藥品,2009, 11(1):72.

[7] 王亞敏,張卓勇,湯彥豐,等.近紅外光譜技術在中藥鑒別及分析中的應用[J]. 首都師范大學學報(自然科學版), 2004,

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[12] 吳珊珊,胡昌江,呂非非.一測多評法測定黃柏中5種生物堿[J].中成藥2014,36(1):130.

（責任編輯：胡慧玲）

Determination of alkaloid in Huangbo by near infrared diffuse reflectance spectroscopy

WU Shan-shan1, HU Lin1, GONG Xiao-meng1, LI Meng-qi1, WU Wen-hui1,LI Wen-bing2, HU Chang-jiang1//(1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan; 2. Neo-green Pharmaceutical Co.LTD, Chengdu 611930, Sichuan)

Objective: A near-infrared (NIR) quantitative method was developed for rapid determination of three components (magnoflorine, phellodendrine, and berberine) in Huangbo. Method: Using alkaloid contents measured by HPLC as reference, near infrared diffuse reflectance spectroscopy of 49 samples were collected. Then partial least square algorithm (PLS) was applied to establish a calibration model, and compare the influence of different pretreatment method and different wave on modeling. Result: Taking MSC +2 D2as pretreatment method, model correlation coefficient (R) for berberine, phellodendrine, magnoflorine were 0.9995, 0.9760 and 0.9306 with RMSEC of 0.0453, 0.0335 and 0.0396, respectively. Conclusion: The method is accurate and reliable, and can be applied for the rapid online detection.

Near infrared spectrum; Huangbo; partial least square algorithm; alkaloid

R282.6

A

1674-926X(2016)04-002-03

中醫藥行業科研專項（201007012-3-2）

成都中醫藥大學藥學院 成都 611137; 2.四川新綠色科技發展股份有限公司 成都 611930

吳珊珊（1989-），女，在讀博士研究生，主要從事中藥炮制機理研究

Tel:15802825791 Email:569222020@qq.com

胡昌江（1952-），男，教授，博士研究生導師，主要從事中藥炮制機理研究

Email:hhccjj@hotmail.com

2015-09-10