正交優(yōu)選苦紫洗劑提取工藝研究

范世忠，郭華，曾倩，談靜，袁強華

·炮制制劑·

正交優(yōu)選苦紫洗劑提取工藝研究

范世忠1，郭華2，曾倩1，談靜1，袁強華1

目的：優(yōu)選苦紫洗劑的提取工藝。方法：采用L9(34)正交試驗，以羥基萘醌類總色素含量為評價指標,以乙醇用量、浸泡時間和浸泡次數(shù)為考察因素,篩選紫草的醇提工藝條件；以氧化苦參堿和苦參堿總含量及干膏收率為評價指標,以加水倍數(shù)、提取時間和煎煮次數(shù)為考察因素,篩選苦紫洗劑的水提工藝條件。結(jié)果：優(yōu)選醇提工藝為加10倍量95%乙醇,浸泡2次,每次12 h；優(yōu)選水提工藝為加8倍量水,提取3次,每次1 h。結(jié)論：優(yōu)選得到的提取工藝穩(wěn)定、合理、可行。

苦紫洗劑；羥基萘醌總色素；氧化苦參堿；苦參堿；提取工藝

苦紫洗劑為成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院的在研醫(yī)院制劑，該方由苦參、紫草等藥味組成，為婦科用于治療老年性陰道炎疾病的經(jīng)驗方,在臨床應用多年，療效確切，具有清熱解毒，燥濕止癢，補益肝腎的功效。根據(jù)處方藥味的主要藥效成分的理化性質(zhì)，以羥基萘醌總色素含量為評價指標，考察紫草醇提工藝；以苦參堿和氧化苦參堿總量及干膏收率為評價指標考察其余藥味與醇提后藥渣的水提工藝，通過正交試驗優(yōu)選提取工藝，為本制劑的開發(fā)研究提供工藝條件參數(shù)。

1 儀器與試藥

島津UV-210A紫外分光光度儀（日本島津公司）；HP-1100型高效液相色譜儀（G1322A 在線真空脫氣裝置、G1311A 四元梯度泵、G1313A 標準自動進樣器、G1316A 柱溫箱、G1315A DAD 檢測器、Agilent ChemStation B03.01工作站,美國安捷倫（惠普）公司),電子分析天平（SARTΟRIUS ，Bp211D）。

左旋紫草素對照品（批號：110769-200405），苦參堿對照品（批號：110805-200508），氧化苦參堿對照品（批號：110780-200506），均由中國食品藥品檢定研究院提供；紫草、苦參等飲片由四川新荷花中藥飲片股份有限公司提供；乙腈、甲醇、乙醇為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑為分析純。

2 醇提工藝研究

紫草萘醌類成分為紫草的主要有效成分，性質(zhì)極不穩(wěn)定，受溫度影響較大，根據(jù)藥效成分的理化性質(zhì)及預試實驗結(jié)果，參考相關文獻[1]，針對羥基萘醌類總色素的不穩(wěn)定性，為合理有效地進行紫草有效部位的提取與制備，經(jīng)過預試，確定紫草用95%乙醇常溫浸提，以左旋紫草素為對照品計算羥基萘醌總色素含量，對紫草的提取條件進行篩選。

2.1 羥基萘醌總色素含量測定

2.1.1 測定方法 采用紫外-可見分光光度法，檢測波長：516 nm。

2.1.2 線性范圍的考察 精密 量 取 左 旋 紫 草 素 對 照 品溶 液(0.06 mg．mL-1)1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置10 mL 量 瓶 中 ，用 乙 醇 定 容 至刻度；以95%乙醇 為 空 白 對 照，分別于516 nm處測 定 吸 光 度，以左旋紫草素含量（mg）為橫坐標，吸 收 度 為 縱 坐標 進 行 線 性 回 歸計算，得 回 歸 方程：Y＝2.2799 X＋0.0078（r＝0.9999）。結(jié)果：左 旋 紫 草 素 含量在0.006～0.030 mg．mL-1范圍內(nèi)吸 收 度 線 性 關 系良好。

2.1.3 樣品含量測定 分別精密吸取正交試驗各樣品溶液2.0 mL置50 mL容量瓶中，加95%乙醇定容，搖勻即得。以95%乙醇為空白參比，于516 nm處測定吸光度，據(jù)標準曲線回歸方程計算出正交試驗各紫草樣品中羥基萘醌總色素的含量。

2.2 醇提正交試驗

選用正交試驗法，以95%乙醇為溶媒，對影響紫草醇提的主要因素：乙醇用量、浸泡時間、浸泡次數(shù)進行考察，根據(jù)預試結(jié)果選擇三個因素的水平，進行L9(34)正交試驗，篩選紫草醇提工藝條件。因素水平設計見表1。

表1 醇提正交設計因素水平

稱取紫草飲片100 g，按正交試驗設計表的條件進行常溫浸提試驗，提取液濾過，用95%乙醇定容至4000 mL。正交試驗結(jié)果見表2,方差分析見表3。

表2 正交試驗結(jié)果

9 3 3 2 1 40.86 K1 103.41 101.88 91.94 106.27 K2 107.52 110.74 116.07 108.71 K3 112.86 111.17 115.78 108.81 R 3.15 3.10 8.04 0.85

表3 方差分析結(jié)果

結(jié)果：由表2直觀分析結(jié)果可知，影響提取效果的因素順序為： C（浸泡次數(shù)）＞ B（浸泡時間）＞A（乙醇用量），最佳醇提工藝為：A3B3C2；由表3方差分析結(jié)果可知，C因素（浸泡次數(shù)）有顯著影響，B因素（浸泡時間）與A因素（乙醇用量）無顯著影響；為節(jié)約資源，降低工業(yè)化生產(chǎn)的成本，A因素取中間值A2, B2和B3相差很小，B因素取B2，因此優(yōu)選醇提工藝為A2B2C2，即加10倍量95%乙醇，常溫浸泡2次，每次12 h。

2.3 醇提驗證試驗

取紫草100 g，共三份，按照正交試驗優(yōu)選的提取工藝進行驗證試驗，結(jié)果穩(wěn)定，羥基萘醌總色素平均含量為38.82 mg/g，RSD＝2.06%。

3 水提工藝研究

3.1 氧化苦參堿和苦參堿的含量測定

3.1.1 色譜條件[2-7]色譜柱為C18(250×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH=7.5）(12∶5∶83)；流速1.0 mL．min-1；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm。

3.1.2 線性關系考察 精密吸取苦參堿(0.3704 mg．mL-1)和氧化苦參堿(0.2424 mg．mL-1)混合對照品溶液，按3.1.1項色譜條件分別進樣0.5 μL、1 μL、3 μL、5 μL、7 μL、10 μL，測定峰面積，以峰面積（Y）對進樣量（X）進行回歸，計算氧化苦參堿和苦參堿的回歸方程，氧化苦參堿回歸方程：Y＝822.83X＋12.121（r＝0.9999）；苦參堿回歸方程：Y＝1153.6X－5.1574（r＝0.9999）；結(jié)果表明，氧化苦參堿和苦參堿在0.1852～3.704 μg和0.1212～2.424 μg之間與峰面積呈良好線性關系。

3.1.3 樣品含量測定 分別精密吸取正交試驗樣品液各5.0 mL置25 mL容量瓶中，加無水乙醇20 mL，超聲處理10 min，放至室溫，用無水乙醇定容，搖勻，微孔濾膜濾過（0.45 μm），取續(xù)濾液作為供試品溶液。陰性對照液為處方缺苦參的提取液按上述方法制得，分別進樣對照品溶液、供試品溶液和陰性對照液各5 μL測定，陰性對照液色譜圖中無氧化苦參堿和苦參堿色譜峰，說明其它成分不干擾測定，見圖1。

圖1 苦紫洗劑中氧化苦參堿和苦參堿HPLC圖Ⅰ：樣品；Ⅱ：對照品；Ⅲ：陰性對照；A：氧化苦參堿；B：苦參堿Fig 1 HPLC of Oxymatrine and Matrine of Kuzi lotionⅠ：sample solution；Ⅱ： reference substance solution；Ⅲ：negative sample solution；A：Οxymatrine；B：Matrine

3.2 水提正交試驗

采用水煎煮提取的方法，影響水提的主要因素有加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)，根據(jù)預試結(jié)果選擇三個因素的水平，按L9(34)正交表進行正交試驗，因素水平見表4。

表4 水提正交設計因素水平

按處方比例稱取苦參等飲片與紫草殘渣共煎，按L9(34)正交表安排試驗提取，加水煎煮，濾過，合并濾液，濃縮至500 mL。按3.1.3項下方法測定各正交提取液中氧化苦參堿和苦參堿總含量；精密吸取各正交樣品液25.0 mL，分別置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算干膏率。以氧化苦參堿和苦參堿總含量（占70%）及干膏收率（占30%）兩項綜合加權(quán)評分為指標，考察各因素對提取工藝的影響。結(jié)果見表5、表6。

表5 正交試驗結(jié)果

表6 方差分析表

結(jié)果：由表5直觀分析結(jié)果可知，影響提取效果的因素順序為： C（提取次數(shù)）＞ B（提取時間）＞A（加水量），最佳水提工藝為：A3B2C3；由表6方差分析結(jié)果可知，C因素（提取次數(shù)）對提取效果有極顯著性影響，B因素（提取時間）對提取效果有顯著性影響，A因素（加水量）對提取效果無顯著性影響，為節(jié)約資源，降低工業(yè)化生產(chǎn)成本，將A3調(diào)整為A1，因此優(yōu)選水提工藝為A1B2C3，即加8倍量水，提取3次，每次1 h。

3.3 水提驗證試驗

按處方比例稱取飲片500 g，共三份，按照正交試驗優(yōu)選的工藝條件進行驗證實驗，結(jié)果：氧化苦參堿和苦參堿總含量平均值為18.32 mg/g，RSD＝2.10%；干膏收率平均值為28.35%，RSD＝2.07%，表明該水提工藝穩(wěn)定可行。

4 討論

（1）乙酰紫草醌、紫草醌、去氧紫草素等萘醌類色素為紫草的主要有效成分[8]。萘醌類成分極不穩(wěn)定，受溫度影響較大，目前報道多采用高濃度的乙醇提取，但提取方法不一，有回流法、浸漬法、滲漉法等，不同方法對成分的破壞影響差別較大[9-12]，預實驗發(fā)現(xiàn)紫草提取液加熱回流前后顏色發(fā)生改變，回流法得到的供試品溶液與飲片樣品、左旋紫草素對照品的紫外吸收圖譜不一致，其原因是在乙醇回流溫度下，萘醌類色素被破壞。前期實驗通過比較溫浸法（65 ℃）、滲漉、浸漬法、超聲法對羥基萘醌總色素含量的影響，4種提取方法得到的羥基萘醌總色素含量以滲漉法、溫浸法（65 ℃）最高，各方法差別不大，與文獻[12]報道基本一致。超聲提取與浸漬提取相比，雖提取時間短，但提取率略低且超聲提取對設備要求高, 能耗大，超聲過程影響因素不易控制；浸漬法提取略低于滲漉法，但綜合比較來看，浸漬法作為提取萘醌類成分初始提取方法，可以節(jié)約能源，對設備要求低，操作簡便，轉(zhuǎn)移率高，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)，故以95%乙醇為溶媒，采用常溫浸漬法對紫草進行提取。

（2）苦參加熱提取時，苦參堿和氧化苦參堿的含量存在動態(tài)變化[13-14]，鑒于此原因，在水提工藝研究時，含量測定以氧化苦參堿和苦參堿的總含量為指標。

（3）苦參為本處方的君藥，苦參堿和氧化苦參堿為本處方主要藥效成分，其含量的高低直接影響著藥效的發(fā)揮，因此水提工藝研究時給予苦參堿和氧化苦參堿的總含量70%的加權(quán)系數(shù)。

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(責任編輯：傅舒)

Study on extraction process of Kuzi lotion with orthogonal test/

FAN Shi-zhong1, GUO Hua2, ZENG Qian1, TAN Jing1, YUAN Qiang-hua1//( 1.Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, Sichuan;2. Dazhu County Food and Drug Insititute, Dazhou 635100, Sichuan)

Objective: To optimize extraction process of Kuzi lotion. Method: With L9(34) orthogonal test, the investigation factors influencing Zicao alcohol extraction conditions including alcohol volume, extraction time, extraction times were optimized with hydroxy naphthoquinone content as index. The investigation factors influencing water extraction conditions of Kuzi lotion including water volume, boiling times and extraction times were optimized with the contents of oxymatrine and matrine and dry extraction rate as indexes. Result: The optimal alcohol extraction conditions were as follows: reflux extracting 2 times with 10-fold 95% alcohol, 12 hours each time. The optimal water extraction conditions were as follows: extracting 3 times with 8-fold water, 1 hour each time. Conclusion: The optimum extraction process is reasonable, feasible and stable.

Kuzi lotion; hydroxy naphthoquinone; oxymatrine; matrine; extraction process

R 284.2

A

1674-926X(2016)04-005-04

成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院基金項目(2009-D-YY-44)

1.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川 成都 610072 2.大竹縣食品藥品檢驗所，四川 達州 635100

范世忠（1976－），男，本科，主管藥師，研究方向為藥劑學及藥事管理，

Tel:028-87783251 Email:fanshzh@126.com

2015-8-2