海藻酮糖測定方法的探討

黃忠華，梁 智

（廣西輕工業科學技術研究院，廣西 南寧 530031）

海藻酮糖測定方法的探討

黃忠華，梁 智

（廣西輕工業科學技術研究院，廣西 南寧 530031）

文章采用高壓液相色譜法（HPLC）測定海藻酮糖的含量，通過分析比對兩個廠家的液相色譜系統和四種不同廠家和類型的液相色譜柱測定結果的差異，最終確定用Waters公司氨基型碳水化合物分析專用柱來測定溶液中海藻酮糖的含量，流動相為乙腈：水=（4∶1），示差折光檢測器。

海藻酮糖；液相色譜

蔗糖、異麥芽酮糖和海藻酮糖是同分異構體，根據查到的國內外所有文獻［1-10］的報道，蔗糖在蔗糖異構酶的催化作用下，會專一的生成異麥芽酮糖和海藻酮糖，不同微生物來源的酶，生成異麥芽酮糖和海藻酮糖的比例不一樣，這也符合酶的專一性的特征，此外還有因蔗糖水解產生的果糖、葡萄糖等其他微量組分。海藻酮糖和異麥芽酮糖作為蔗糖的同分異構體，結構上的細微差異使得兩者性質和用途既相似又有所區別，如甜度，前者為蔗糖的52%，后者為蔗糖的70%；溶解度，25℃時，異麥芽酮糖的溶解度為25%左右，而海藻酮糖的溶解度遠遠大于此，因此至今未有晶體產品問世。正因為海藻酮糖除了具備異麥芽酮糖非致齲齒性、不引起血糖升高等一樣的性質外，還具有溶解度高，吸濕性好等優勢，更利于在高糖度的食品、保健品和化妝品中發揮作用。目前，蔗糖、異麥芽酮糖都有標準品和檢測方法，但是海藻酮糖沒有標準品，本課題組通過電話咨詢如Sigma公司等標準品供應商，也委托專業的試劑藥品經銷商采購，經多方努力依然無法得到海藻酮糖標準品或者含量很高的對照品，因此，本文就是針對海藻酮糖的測定方法進行研究與探索。

1 實驗

1.1 材料

異麥芽酮糖母液：廣西科學院生物所。

異麥芽酮糖：廣西維科特生物技術有限公司。果糖、葡萄糖、蔗糖、異麥芽酮糖、乙腈（分析純）：市售。

1.2 主要儀器設備

液相色譜系統：美國安捷倫1100，GPC色譜分析工作站，配示差檢測器，大連依利特S1201自動進樣器；美國Waters液相色譜系統，威瑪龍色譜分析工作站，配示差檢測器，515泵，大連依利特S3101自動進樣器；色譜柱：Waters公司氨基型碳水化合物分析專用柱、大連依利特氨基柱、伯樂Ca2+型糖分析柱、廣州菲羅門Ca2+型糖分析柱。

1.3 異麥芽酮糖母液的預處理

異麥芽酮糖母液一般錘度為50°Bx左右，先用高純水稀釋至30°Bx左右，添加2.0%～3.0%活性炭，在60～70℃條件下保溫攪拌30～60分鐘，過濾，取濾液過陰陽離子混合交換樹脂，使電導率將至10ms/cm以下，備用。

1.4 樣品溶液的配置

樣品溶液的配置：液相色譜測定前，將預處理后的異麥芽酮糖母液、蔗糖、葡萄糖、果糖、異麥芽酮糖用高純水稀釋至1°Bx（即1.0%）左右，經0.22um水系微孔濾膜過濾。

1.5 色譜條件及分析方法

方法一：色譜柱：伯樂Ca2+型糖分析柱、廣州菲羅門Ca2+型糖分析柱，流動相：高純水，柱溫80～85℃，進樣濃度1.0%，進樣量20ul，流速：1.0ml/min。

方法二：Waters公司氨基型碳水化合物分析專用柱、大連依利特氨基柱，流動相：乙腈：水=4:1，柱溫30℃，進樣濃度1.0%，進樣量20ul，流速：1.0ml/min。

具體見表1。

表1 兩種不同液相色譜檢測方法操作參數比較

1.6 結果分析與討論

本項目開展之前，我院承擔了“果葡糖漿分離”、“甘露醇和山梨醇的分離”、“木糖和L-阿拉伯糖的分離”等多個科研項目的研究，均采用方法一（色譜柱：Ca2+型糖分析柱；洗脫劑：高純水；柱溫：80～85℃；流速：0.6mL/min；示差檢測器：40℃；進樣濃度：約1%；進樣量：20ul）對物料進行液相色譜分析檢測，均獲得成功，分離效果非常好，在此基礎上，本項目的前期研究階段（模擬移動床連續分離之前的實驗）一直沿用方法一，采用面積歸一化法，對異麥芽酮糖母液進行分析測試，液相分析圖譜如下。

圖1 果糖和葡萄糖液相圖譜

圖2 木糖和L-阿拉伯糖液相圖譜

圖3 甘露醇和山梨醇液相圖譜

圖4 異麥芽酮糖母液液相色譜圖

由以上液相色譜分析圖可見，異麥芽酮糖和海藻酮糖在Ca2+型糖分析柱上的出峰時間很接近，前者為9.915分鐘，后者為11.173分鐘，兩者只相差1.258分鐘，而且蔗糖、葡萄糖的出峰時間也為9分鐘附近，有時候出現了多峰重疊的現象，說明兩者在Ca2+型糖分析柱上雖然可以分離，但是難以達到像果糖—葡萄糖（圖1），木糖—L-阿拉伯糖（圖2），甘露醇—山梨醇（圖3）那樣完美分離，由此可以預見，本項目的分離難度系數很大。

中試實驗開展之后，一些科研人員認為采用方法一對海藻酮糖進行檢測，出現有些峰重疊的現象，會影響測試結果，根據文獻［4］，環民霞，林璐等在《淀粉與淀粉糖》2007年第4期發表的文章《利用Erwinia rhapontici NX-4菌株高效制備新型甜味劑異麥芽酮糖》所述，采用氨基型分析柱，乙腈：水=80：20為洗脫劑，流速0.8Ml/min，示差檢測器40℃，進樣量20ul，檢測結果如下。

圖5 文獻報道海藻酮糖液相色譜測試圖

同時參照異麥芽酮糖企業標準（QB 1581-1992）和相關文獻資料［1-10］，在中試試驗階段采用方法二對產品進行分析，兩種分析方法及液相色譜分析結果如下。

圖6 采用方法一用廣州菲羅門Ca2+型糖柱對異麥芽酮糖母液測試液相色譜圖

圖7 采用方法一用伯樂Ca2+型糖柱對異麥芽酮糖母液測試液相色譜圖

圖8 采用方法二用大連依利特氨基型氨基柱對異麥芽酮糖母液測試液相色譜圖

圖9 采用方法二用Waters氨基型碳水化合物分析柱對異麥芽酮糖母液測試液相色譜圖

表2 方法一液相結果

表3 方法二液相結果

由以上圖表可見，異麥芽酮糖和海藻酮糖在方法一（即Ca2+型糖分析柱）上的出峰時間很接近，而方法二（即氨基型氨基柱）上，甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖等其他組分在20分鐘前就已經出峰，而異麥芽酮糖的出峰時間為23.45分鐘，海藻酮糖的出峰時間為26.15分鐘，兩者相差2.7分鐘，可見，方法二更適合用于檢測海藻酮糖的含量。同時發現美國伯樂和廣州菲羅門的Ca2+型糖分析柱的檢測結果沒有顯著差異，但是Waters公司的氨基型碳水化合物分析柱比大連依利特的NH2+型氨基柱的峰形、分離效果和重現性要好得多，因此采用方法二，Waters公司的氨基型碳水化合物分析柱，通過面積歸一化法對本項目中試分離實驗及結果進行海藻酮糖的定性和定量分析檢測。

分別按乙腈含量80%、75%配置流動相，以Waters公司的氨基型碳水化合物分析柱為色譜柱，按照方法二的檢測方法對異麥芽酮糖母液進行檢測，結果如下。

圖10 采用方法二按80%乙腈測試異麥芽酮糖母液液相色譜圖

圖11 采用方法二按75%乙腈測試異麥芽酮糖母液液相色譜圖

由以上圖可見，采用乙腈含量80%的分離效果比75%的要好一點，因此，本項目的后期實驗均采用乙腈含量80%（即乙腈：水=4:1），Waters公司的氨基型碳水化合物分析柱為色譜柱，按照方法二的檢測方法對異麥芽酮糖溶液進行檢測。

［1］ QB 1581-1992食品添加劑-異麥芽酮糖，中華人民共和國輕工行業標準［J］，1993年4月.

［2］ 林璐，李莎等.生物催化生產異麥芽酮糖的研究進展，食品與發酵工業［J］，2007年第6期，91-94.

［3］ 薛蓓，梁甲元.海藻酮糖的研究進展，食品與發酵工業［J］，2012第11期，127-130.

［4］ 環民霞，林璐等.利用Erwinia rhapontici NX-4菌株高效制備新型甜味劑異麥芽酮糖，淀粉與淀粉糖［J］，2007年第4期，22-24.

［5］ 唐文竹，陳放等.蔗糖異構酶催化生產異麥芽酮糖研究進展，微生物學通報［J］，2012年第9期1314-1322.

［6］ 李莎，徐虹.微生物來源蔗糖異構酶的研究進展及應用，化工進展［J］，2011年第6期，1326-1331.

［7］ 甘賓賓，蔣世瓊.高效液相色譜法測定帕拉金糖，廣西化工［J］，2001年第3期，40-41.

［8］ 沃爾夫岡·瓦赫等.含海藻酮糖的組合物，其制備及其用途，PCT中國專利申請號：201080023895.0.

［9］ 韋宇拓，梁甲元等.一種純化海藻酮糖的方法，中國專利申請號：201310428359.1.

［10］李丕武，王瑞明等.從異麥芽酮糖母液分離異麥芽糖和海藻酮糖的方法，中國申請號：201410284332.7.

TS249．9

B

2095-820X（2016）01-07

2016-01-06

2013年廣西科學研究與技術開發計劃項目，制糖業共性關鍵技術研發與示范重大專項，合同編號：桂科重：1348002-6，計劃類別：重大專項。

黃忠華（1982-），男，廣西田陽人，大學本科，工程師，從事糖類及其深加工與應用的研究，Email：18777162820@126.com。