肺結核潛伏期和活動期患者外周血miR-29a和IFN-γ水平變化*

詹 燏 劉水逸 吳唐維 石麗峰 劉怡雯 張紅梅 汪 慧 盧忠心

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肺結核潛伏期和活動期患者外周血miR-29a和IFN-γ水平變化*

詹 燏 劉水逸 吳唐維 石麗峰 劉怡雯 張紅梅 汪 慧 盧忠心

目的：分析肺結核(TB)潛伏期和活動期患者血漿miR-29a、γ干擾素(IFN-γ)mRNA和血清IFN-γ水平變化及其相關性。方法：選擇活動期TB患者(活動期TB組)27例、潛伏期TB患者(潛伏期TB組)22例及非TB患者(對照組)30例；采用逆轉錄熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測各組血漿miR-29a水平和單個核細胞IFN-γ mRNA水平，采用ELISA檢測各組血清IFN-γ水平；比較各指標水平組間差異，分析兩結核組miR-29a與IFN-γ mRNA的相關性。結果：活動期TB組miR-29a顯著高于潛伏期TB組和對照組(P<0.01)；與對照組比較，潛伏期TB組和活動期TB組單個核細胞IFN-γ mRNA水平和血清IFN-γ水平均降低(P<0.01)，活動期TB組較潛伏期TB組更低(P<0.05)。活動期TB組和潛伏期TB組血漿miR-29a水平與單個核細胞IFN-γ mRNA水平均呈顯著負相關(r分別為-0.697、-0.559，P<0.05)。結論：miR-29a可通過調控靶基因IFN-γ mRNA表達，參與TB的發生發展。

活動性肺結核；潛伏感染；miR-29a；干擾素-γ

結核病(Tuberculosis，TB)是結核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病，其發病率近年有增加趨勢，新發病例主要由潛伏性結核感染者(Latent Tuberculosis Infection，LTBI)進展而來。miRNA是一類高度保守的單鏈小分子RNA，通過轉錄后水平調控mRNA參與細胞發育、分化、增殖、凋亡，DNA甲基化，DNA修復及抗炎反應和促炎反應等病理生理活動，與人類多種疾病相關[1]。與之高度同源的miR-29a參與免疫反應，可通過抑制靶基因干擾素-γ(IFN-γ)的產生，下調機體對結核分枝桿菌的免疫應答，從而有利于結核分枝桿菌感染[2]，被認為是TB發生的重要機制和診斷標志[3]。本文檢測分析miR-29a及其靶基因IFN-γ mRNA在活動期TB和潛伏期TB患者外周血水平差異以及兩者的相關性，進一步佐證miR-29a對TB發生發展的重要作用。

1 資料與方法

1.1 對象與分組

選擇2013-09—2014-11本院呼吸科首次診斷的活動期TB患者27例(活動期TB組)，年齡18—67歲，平均(37.90±10.20)歲，其中男14例，女13例；潛伏期TB患者22例(潛伏期TB組)，年齡20—71歲，平均(38.15±10.31)歲，其中男12例，女10例。活動期TB的診斷依據國家衛生部《肺結核診斷標準(WS288-2008)》[4]；潛伏期TB的診斷標準為僅結核菌IFN-γ釋放試驗陽性，無結核癥狀，胸部X光正常[5]。另選同期因咳嗽、咳痰、胸痛、咯血等癥狀來本院呼吸科就診，經以下試驗和檢查排除結核菌感染者作為對照組：結核菌素試驗(PPD)陰性或硬結小于15mm，結核菌IFN-γ釋放試驗陰性，胸部X光正常，共30例，男16例，女14例，年齡21—64歲，平均(37.5±9.85)歲。所有入選者均排除腫瘤、自身免疫性疾病和糖尿病等。各組性別(χ2=1.221)、年齡(F=2.78)分布差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 檢測試劑和儀器

RNA提取試劑盒(AM1556，批號：00324879)、miR逆轉錄試劑盒(批號：1302109)、miR-29a逆轉錄引物(批號：P131202-006 H04)、miR-29a PCR引物(批號：P130319-004 G02)、內參miR-39逆轉錄引物(批號：P130402-000 H01)、內參miR-39 PCR引物(批號：130806-000 A12)均購自美國ABI公司；Trizol 試劑(批號：80802)購自美國Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒(批號：50115)購自北京康為公司；逆轉錄試劑盒購自日本TOYOBO公司(批號：255600)；人淋巴細胞分離液購自天津美德太平洋科技有限公司(批號：171403D)；IFN-γ ELISA檢測試劑盒購于美國R&D公司(批號：886154)；IFN-γ和內參β-actin引物均由武漢生工合成。各種引物序列見表1。StepOnePlus熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；EnSpire全波長多功能酶標儀為美國PerkinElmer公司產品。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 逆轉錄熒光定量PCR檢測血漿miR-29a水平：采集三組對象清晨空腹外周靜脈血3ml于EDTA抗凝管中，4h內以相對離心力2 000g離心20min，取血漿儲存于-80℃冰箱備檢。檢測前取凍存血漿，按AM1556試劑盒說明書步驟提取總RNA(A260/A280為1.8-2.0)后進行逆轉錄。逆轉錄體系為20μl：1μl總RNA，4μl 5×Reaction Mix反應混合物，2μl 10×SuperScript Enzyme Mix酶混合物，用焦炭酸二乙酯(DEPC)水補足至20μl；反應條件：37℃ 60min，95℃ 5min。然后按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR，反應體系20μl：10μl EXPRESS SYBR Green ERTMqPCR Super Mix反應混合物,0.4μl 10μmol/L miR-29a引物或內參miR-39引物，0.4μl 10μmol/L通用熒光定量PCR引物，0.04μl ROX參比染料，2μl cDNA和7.16μl DEPC處理水，混勻，離心，每個樣本設3個復孔；反應條件：50℃預孵育2min，95℃預變性2min，95℃變性15s，60℃退火延伸1min，40個循環擴增。60℃延伸時采集熒光信號。反應結束后直接得到樣本的域值循環數，每個樣本均計算平均值，通過平均值計算相對表達量。miR-29a的相對表達量=2-△CT，△CT=CT(miR-29a)-CT(miR-39)。

1.3.2 逆轉錄熒光定量PCR檢測外周血單個核細胞IFN-γ mRNA水平：采集三組對象清晨空腹肘靜脈血3ml于EDTA抗凝管中，4h內以相對離心力2 000g離心20min，棄上清，用淋巴細胞分離液按常規操作提取單個核細胞儲存于-80℃冰箱備檢。檢測前取凍存單個核細胞，按Trizol試劑說明書步驟提取單個核細胞的總RNA(A260/A280為1.8-2.0)后進行逆轉錄PCR，反應體系15μl：1μl RNA，1.2μl逆轉錄引物，5×逆轉錄緩沖液3μl，逆轉錄酶0.75μl，DEPC水補足至15μl；混勻、離心；反應條件：37℃ 15min，98℃ 5min。最后依照熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR，反應體系20μl：4μl逆轉錄產物，IFN-γ上、下游引物各1μl或β-actin上、下游引物各1μl，10μl EXPRESS SYBR Green ERTMqPCR Super Mix反應混合物，雙蒸水補足至20μl，混勻，離心；每個樣本設3個復孔；反應條件：95℃預變性10min，95℃ 5s，60℃ 1min，40個循環擴增；72℃延伸10min。反應結束后直接得到樣本的域值循環數，每個樣本均計算平均值，通過平均值計算相對表達量。IFN-γ mRNA的相對表達量=2-△CT，△CT=CT(IFN-γ)-CT(β-actin)。

表1 引物序列

1.3.3 ELISA檢測血清IFN-γ水平：采集三組對象清晨空腹外周靜脈血3ml置于非抗凝管中，混勻后離心(3 000r/min)5min，取血清檢測IFN-γ含量。嚴格按照IFN-γ試劑盒說明書操作，于酶標儀450nm測吸光度，建立標準曲線，計算各樣本含量。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 各組血漿miR-29a水平比較

各組血漿miR-29a水平差異有統計學意義(P<0.01)；活動期TB組miR-29a顯著高于潛伏期TB組和對照組(t=4.726、4.064，P<0.01)，潛伏期TB組和對照組之間差異無統計學意義(t=1.851，P>0.05)。見表2。

2.2 各組外周血單個核細胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ水平比較

表2 各組血漿miR-29a水平比較

注：與對照組和潛伏期TB組比較，1)P<0.01

各組單個核細胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ水平差異均有統計學意義(P<0.01)。與對照組比較，潛伏期TB組和活動期TB組IFN-γ mRNA水平均降低(t=5.511、7.016，P<0.01)；活動期TB組較潛伏期TB組更低(t=2.202，P<0.05)。與對照組血清IFN-γ水平比較，潛伏期TB組和活動期TB組均降低(t=20.267、15.082，P<0.01)，活動期TB組較潛伏期TB組更低(t=6.736,P<0.01)。而且，IFN-γ mRNA水平和IFN-γ血清水平從對照組到活動期TB組的逐漸降低趨勢都具有良好一致性(r=0.582，P<0.01)。見表3。

表3 各組單個核細胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ水平比較

注：與對照組比較，1)P<0.01；與潛伏期TB組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.3 相關性分析

活動期TB組和潛伏期TB組血漿miR-29a水平與單個核細胞IFN-γ mRNA水平均呈顯著負相關(r=-0.697、-0.559，P<0.01)，見圖1。

圖1 活動期TB組(左)和潛伏期TB組(右)血漿miR-29a與單個核細胞IFN-γ mRNA水平的相關分析圖

3 討 論

結核分枝桿菌引起的TB是一種嚴重危害人類健康的慢性傳染性疾病，被我國列為重大傳染病之一。WHO 2012年報道，2011年全球新增TB 870萬，死亡110萬，其中中國新增患者90萬—110萬，占全球發病人數的14%，位居全球第二位[6]。新發TB病例主要由LTBI進展而來，其中5%—10%的LTBI進展為活動期肺結核[7]，表明人類對結核分枝桿菌易感，且結核分枝桿菌容易躲避宿主免疫系統攻擊，而在宿主體內長期潛伏，一旦機體免疫力下降，潛伏期人群即會進展為活動期TB。

miRNA是一類高度保守的單鏈小分子RNA，長度為18—25個核苷酸。成熟的miRNA可通過與靶mRNA的3’端非編碼區結合而抑制靶mRNA的翻譯或導致靶mRNA降解，發揮基因轉錄后的調節功能[8]。近年來研究證實，血液循環系統中miRNA廣泛而穩定地存在，并隨疾病的發生發展出現相應的特異性改變，成為疾病診斷的新型生物標志物[9-12]。已有研究表明，miR-29a在結核分枝桿菌感染不同時相有一定的表達差異，被認為是TB的診斷標志[13-15]。miR-29a可通過靶向IFN-γ，調控機體對結核分枝桿菌感染引起的免疫應答，從而對結核分枝桿菌感染發揮重要作用[2,16]。

本研究結果顯示，活動期TB患者血漿miR-29a水平比潛伏感染者及對照者顯著增高，與此同時，活動期TB患者和潛伏期TB患者單個核細胞IFN-γ mRNA水平明顯降低，提示人體感染結核分枝桿菌后，miR-29a可能負向調控機體對病原體的免疫應答，降低機體抵抗力，誘發TB。血清中IFN-γ水平此時也明顯降低，與IFN-γ mRNA表達下調呈良好一致性，因而檢測血清IFN-γ水平也能反映miR-29a變化及輔助診斷TB。IFN-γ mRNA是miR-29a作用的靶基因，活動期TB患者外周血miR-29a升高，靶向IFN-γ mRNA，降解增加，存量減少，使機體抗結核能力降低，從而有利于結核分枝桿菌的體內增殖，是miR-29a調控IFN-γ致TB發生發展的可能機制。

綜上所述，結核分枝桿菌感染可引起機體miR-29a表達上調，使其靶分子IFN-γ抗結核免疫作用下降，繼而促進TB的發生發展。臨床檢測外周血miR-29a及其靶基因水平在結核分枝桿菌感染過程中的動態變化，對進一步分析、探討miR-29a生物學作用和制定防治策略有重要意義。

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本文第一作者簡介：

詹 燏(1975-)，女，漢族，碩士，副主任技師，主要從事微生物檢驗工作

1 周 燁，向俊宇，侯 晉，等. 微小RNA作為疾病標志物的研究進展[J]. 中華檢驗醫學雜志, 2011,34(10):871-876.

2 Ma F, Xu S, Liu X, et al. The microRNA miR-29 controls innate and adaptive immune responses to intracellular bacterial infection by targeting interferon-γ[J]. Nat Immunol, 2011,12(9):861-869.

3 Fu Y, Yi Z, Wu X, et al. Circulating microRNAs in patients with active pulmonary tuberculosis[J]. J Clin Microbiol, 2011,49(12):4 246-4 251.

4 中華人民共和國衛生部.WS288-2008肺結核診斷標準[M]. 北京：人民衛生出版社，2008：1-16.

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Changes of the Expression of miR-29a and IFN-γ in Peripheral Blood Patients with Active Pulmonary Tuberculosis and Latent Tuberculosis

ZHAN Yu, LIU Shui-yi, WU Tang-wei, SHI Li-feng, LIU Yi-wen, ZHANG Hong-mei, WANG Hui, LU Zhong-xin

Department of Clinical Loboratory, The Central Hospital of Wuhan, Tongji Medical College, Huazhaong University of Science and Technology, Wuhan 430014,China

Objective: To analyze the changes and correlations of the expression of miR-29a and IFN-γ in peripheral blood with active pulmonary tuberculosis and latent tuberculosis patients.Method: 49 cases of tuberculosrs patients were divided into two groups:active pulmonary tuberculosis group(n=27), latent tuberculosis group(n=22). 30 cases of non tuberculosis patients (control group) were enrolled. The expression level of miR-29a in the peripheral blood and IFN-γ mRNA in the peripheral blood mononuclear cells were detected with qRT-PCR. The level of IFN-γ of the serum was detected with ELISA. Differences between groups were analyzed. Results: The expression level of miR-29a in active pulmonary tuberculosis was significantly higher than those of control group and latent infection group (P<0.01). The IFN-γ expression level of cells in patients with active pulmonary tuberculosis and latent infection group were significantly lower than those of control group (P<0.01), and compared with the latent infection group, the expression of the active pulmonary tuberculosis was more significantly (P<0.05). The correlation analysis showed the expression level of miR-29a was negative correlated with the IFN-γ mRNA expression level, r value were -0.697, -0.559, respectively (P<0.05). Conclusion: miR-29a may play an important role in the development of the pulmonary tuberculosis by targeting IFN-γ.

Active pulmonary tuberculosis; Latent infection; miR-29a; IFN-γ

武漢市衛生和計劃生育委員會科研項目(WX14C14)；武漢市中心醫院院內科研基金(YQ13A04)

華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院檢驗科，武漢 430014

本文2016-06-17收到，2016-08-02修回

R521

A

1005-1740(2016)04-0024-05